用于定量腫瘤組織中的免疫細(xì)胞的方法及其應(yīng)用
【專利說明】用于定量腫瘤組織中的免疫細(xì)胞的方法及其應(yīng)用 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及用于定量腫瘤組織中的免疫細(xì)胞的方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] EP-A-EP1943520和W02007045996描述了用于預(yù)后患者的癌癥的進(jìn)展和/或存活， 和/或預(yù)測對治療（化療、放療、生物治療、免疫治療）的響應(yīng)的體外方法，所述方法包括W 下步驟：
[0003] a)在來自所述患者的腫瘤組織樣品中定量至少一種指示所述患者的局部適應(yīng)性 免疫反應(yīng)的狀態(tài)的生物標(biāo)志物；和
[0004] b)比較步驟a)獲得的所述至少一種生物標(biāo)志物的值與相同生物標(biāo)志物的預(yù)定參 考值；所述預(yù)定參考值與所述患者的所述癌癥的進(jìn)展或存活的特定預(yù)后或治療響應(yīng)（諸如 化療、放療、生物治療、免疫治療）的預(yù)測相關(guān)聯(lián)W預(yù)期"良好響應(yīng)者"VS "差響應(yīng)者"。
[0005] 腫瘤組織樣品可W選自（i)總體原發(fā)腫瘤（作為整體），（ii)來自腫瘤的組織樣 品，（iii)來自直接包圍腫瘤的組織的組織樣品，所述組織選可W更具體地稱為腫瘤的"侵 入性邊緣"，（iv)與腫瘤密切接近的淋己島，（V)位于腫瘤最接近處的淋己結(jié)，（vi)手術(shù)之 前進(jìn)行的腫瘤活檢，和（vii)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。
[0006] 優(yōu)選在步驟a)中在從腫瘤的兩個區(qū)域（分別為（i)腫瘤（CT)和（ii)腫瘤的侵 入性邊緣（IM))收集的腫瘤樣品中定量生物標(biāo)志物。
[0007] 在組織微陣列（TMA)上實(shí)施上述方法。然而，所述方法的大多數(shù)步驟手動執(zhí)行，且 可能觀察到測量的可重復(fù)性的問題。例如，基于蘇木精-伊紅復(fù)染檢查，可W發(fā)生病理學(xué)家 之間選擇腫瘤區(qū)域W打孔的差異。另外，觀察到準(zhǔn)確地打孔病理學(xué)家觀察到的區(qū)域的困難。 此類典型錯誤可W發(fā)生在每一個步驟。盡管該些文獻(xiàn)中描述的方法使得可能獲得用于預(yù)測 癌癥患者的存活的高性能，但研究仍繼續(xù)至具有甚至更好品質(zhì)的方法，特別是關(guān)于自動化 再現(xiàn)性和結(jié)果的可比性。
[0008] 女口 Halama 等人在 Quantification of prognostic immune cell markers in colorectal cancer using whole slide imagining tumour maps, analytical and quantitative cytology and histology, Vol. 32, 6, Dec 2010, pp. 333-340 中所強(qiáng)調(diào)，使用 組織微陣列（TM)采樣組織學(xué)探針在目標(biāo)分子的空間異質(zhì)性（如癌組織中經(jīng)常觀察到）的 情況下是特別成問題的?；痩ama等人提出全組織切片顯微鏡用于數(shù)據(jù)采集。然而，該研究 沒有證明產(chǎn)生能夠解釋腫瘤的空間異質(zhì)性的參數(shù)的特定診斷方法。他的結(jié)論是，直到生成 該診斷方法并進(jìn)行后續(xù)研究，他不知道腫瘤圖譜是否將在單個患者中具有預(yù)后價(jià)值。
[000引發(fā)明簡述
[0010] 現(xiàn)在，本申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)用于評估腫瘤組織中免疫細(xì)胞的數(shù)量或密度、用于獲得 患有癌癥的患者的免疫評分（或免疫評分）的方法。
[0011] 已經(jīng)W令人梅訝和意料之外的方式注意到，用于評估腫瘤組織中免疫細(xì)胞的數(shù)量 或密度的新方法的使用確保了 W02007045996中描述方法的自動化、可重復(fù)性和再現(xiàn)性，并 且因此提供了用于預(yù)測癌癥患者的存活率和治療響應(yīng)的實(shí)驗(yàn)室間測試的標(biāo)準(zhǔn)測試方法。
[0012] 當(dāng)與EP-A-EP1943520和W02007045996的方法相比時(shí)，新方法具有特別較少的可 重復(fù)性和再現(xiàn)性的問題。
[0013] 優(yōu)選實(shí)施方案的描述
[0014] 因此，本申請的主題是用于評估腫瘤組織中免疫細(xì)胞的數(shù)量或密度的方法，所述 方法包括由W下組成的步驟：
[0015] a.提供通過使用特異性結(jié)合由免疫細(xì)胞表達(dá)的抗原的抗體的自動化載片染色系 統(tǒng)獲得的一片或多片免疫染色的組織切片。
[0016] b.通過高分辨率掃描捕獲進(jìn)行到步驟a.的載片的數(shù)字化，由此獲得待分析載片 的高清晰度（4. 6 y m/像素或更好）數(shù)字圖像，
[0017] C.檢測數(shù)字圖像上該片組織切片
[001引 d.分析組織切片，用于定義（i)腫瘤（CT)和m)腫瘤的侵入性邊緣（IM)，
[0019] e.提供尺寸參考網(wǎng)格，其中均勻分布單元具有相同表面，所述網(wǎng)格適于待分析腫 瘤的尺寸，
[0020] f.檢測和定量每個單元的染色細(xì)胞，由此評估每個單元染色的免疫細(xì)胞的數(shù)量或 密度。
[0021] 通常，抗體對于由免疫細(xì)胞表達(dá)的蛋白是特異性的，更具體地對于免疫細(xì)胞表面 標(biāo)志物是特異性的。例如，抗體可對于如W02007045996中描述的標(biāo)志物是特異性的，考慮 的免疫細(xì)胞可W是B細(xì)胞和優(yōu)選是T細(xì)胞。例如，本發(fā)明的T細(xì)胞是亞群CD3+細(xì)胞（T細(xì) 胞）、CD8+細(xì)胞或GZMB+細(xì)胞（細(xì)胞毒性T細(xì)胞）、CD4+細(xì)胞（T輔助細(xì)胞）、CD45R0+細(xì)胞 (記憶性T細(xì)胞）的T細(xì)胞。在一個具體實(shí)施方案中，抗體對于CD3、CD4、CD8、CD20、CD45R0、 和GZMB標(biāo)志物是特異性的。
[0022] 當(dāng)使用兩種或更多種標(biāo)志物時(shí)，優(yōu)選對于每種標(biāo)志物單獨(dú)實(shí)施上述步驟。例如，抗 CD3抗體用于一個組織切片，且抗CD8抗體用于另一個組織切片，優(yōu)選鄰近的組織切片。當(dāng) 不同地染色用于檢測不同標(biāo)志物的抗體時(shí)，可替代地進(jìn)行多重（例如雙重）檢測。因此，每 種標(biāo)記物可用一種可檢測信號。
[0023] 免疫組織化學(xué)或I肥是指通過使用抗體特異性結(jié)合生物組織中的抗原的原理檢 測組織切片的細(xì)胞中的抗原（通常是蛋白）的常規(guī)方法。免疫組織化學(xué)染色允許可視化抗 體-抗原相互作用。它可多種方式來實(shí)現(xiàn)。在最常見的實(shí)例中，將抗體綴合至酶，諸如 過氧化物酶，其可催化產(chǎn)生顏色的反應(yīng)。或者，抗體也可W標(biāo)記至英光團(tuán)，諸如英光素或若 丹明。
[0024] 本發(fā)明中使用的抗體通常是可商購的。具體而言，當(dāng)選擇CD3標(biāo)志物用于實(shí)施本 發(fā)明的方法時(shí)，商購自Roche VentanaCTucson, AZ,USA)的2GV6抗體可W是合適的煙letty R，等人，J化thol. 173 (4): 303-307, 1994)。具體而言，當(dāng)選擇CD8標(biāo)志物用于實(shí)施本發(fā) 明的方法時(shí)，商購自Dako(Denmark)的C8/144B抗體可W是合適的（Mason DY,Cordell JL, Gaulard P, Tse AGD, Brown MH. Immunohistological detection of human cytotoxic/ suppressor T cells using antibodies to a CDSpeptide sequence. J Clin Pathol 1992:45:1084-8)〇
[00巧]當(dāng)實(shí)施該方法時(shí)可W檢測兩種或更多種標(biāo)志物。在具體實(shí)施方案中，可W使用 W 下組合；CD3+CD8、CD3+CD45R0、CD3+CD20、CD3+GZMB、CD8+CD20、CD8+GZMB、CD8+CD45R0、 CD20+GZMB、CD20+CD45R0、GZMB+CD45R0、CD4+CD8、CD4+CD45R0、CD4+GZMB、CD4+CD20 和 CD3、 CD8、CD20、CD45R0、CD4和GZMB標(biāo)志物中的3種標(biāo)志物的所有組合。在用于實(shí)施本發(fā)明的 優(yōu)選條件下，組合CD3+CD45R0、CD8+CD45R0和CD3+CD8是最優(yōu)選的，更特別是后者，因?yàn)橛?該些抗體獲得的背景染色低。
[0026] 可W在本方法中使用不同類型腫瘤的組織切片。腫瘤組織樣品涵蓋（i)總體原發(fā) 性腫瘤（作為整體），（ii)來自腫瘤的組織樣品（活檢樣品），（iii)切除的腫瘤樣品，和 (iv)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移樣品。
[0027] 用一片染色的組織切片提供的一個或多個載片可用于本方法中。通常，一個單一 載片對于一種標(biāo)記物是足夠的，除非獲得較差染色。
[002引例如，IHC自動化諸如允許自動染色載片制備的BenchMark⑧XT可用于實(shí)施 免疫組織化學(xué)染色步驟a)。
[0029] 步驟a的載片的數(shù)字化通過掃描捕獲進(jìn)行，例如使用允許掃描標(biāo)準(zhǔn)尺寸（26mm X 76mm)載片的高分辨率Hamamatsu NanoZoomer? 2. 0-HT掃描儀。該種掃描儀提供高 清晰度數(shù)碼圖像（x20:0.46ym/像素是優(yōu)選的）和（x40:0.23ym/像素）。
[0030] 檢測，即數(shù)字圖像上組織切片的邊界的定義可W由技術(shù)人員、通常由醫(yī)生人工進(jìn) 行，或者可W通過適當(dāng)?shù)能浖韺?shí)施。
[0031] 分析組織切片用于定義（i)腫瘤（CT)和（ii)腫瘤的侵入性邊緣（IM)的邊界也 可W由醫(yī)生人工進(jìn)行，或者可W通過適當(dāng)?shù)能浖韺?shí)施。通常獲得對應(yīng)于正常組織、腫瘤和 其之間的侵入性邊緣的H個區(qū)域。
[0032] 優(yōu)選地，在該步驟之前，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)諸如檢測要素和區(qū)域的顏色、強(qiáng)度、致密性、空 性、組織密度、使用復(fù)染的核密度、粒度、形狀、尺寸中的一種或多種，將該片組織切片分成 類似特性的區(qū)域。
[0033] 在步驟e，提供適于待分析腫瘤的尺寸的參考網(wǎng)格。優(yōu)選使用六邊形、正方形或矩 形網(wǎng)狀網(wǎng)格。正方形網(wǎng)狀網(wǎng)格是特別優(yōu)選的。
[0034] 單個網(wǎng)格的表面，下文稱為"單元"，應(yīng)為例如2. 51(T9m2至2510可12,優(yōu)選101(T9m 2 至ioooi(r9m2,特別是10010可至100010可t更特別是aooicrW至sooicrW,且非常特別 是約 esoicrV。
[0035] 具有W下表面的六邊形、正方形或矩形單元是優(yōu)選的；l〇l(T9m2至lOOOlCrV，特別 是 looicrw至 loooicrw，更特別是 3001(T9m2至 gooicrW，且非常特別是約 65〇1〇-9口2。
[0036] 邊長長度為500至1000 y m、優(yōu)選約800 y m的正方形網(wǎng)狀參考網(wǎng)格是最優(yōu)選的，因 為在此類區(qū)域中免疫細(xì)胞的適當(dāng)代表性平均值為1至5000個細(xì)胞。
[0037] 提供優(yōu)選的參考網(wǎng)格，例如具有2至5000,優(yōu)選10至2000,特別是10化〇 1000,更 特別是400至700個單元。
[0038] 邊長長度為約800 y m且具有