一種人巨細胞病毒pp65抗原血癥免疫熒光法檢測試劑盒陽性對照玻片的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因工程技術(shù)、診斷試劑領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種人巨細胞病毒PP65抗原 血癥免疫巧光法檢測試劑盒陽性對照玻片的制備方法。
【背景技術(shù)】
[000引 人巨細胞病毒化uman cytomegalovirus, HCMV)屬于人類瘤疹病毒0亞科病毒， 在人群中的感染極為普遍，呈世界性分布，血清流行病學(xué)調(diào)查表明，40%?100%成人HCMV 抗體陽性。研究表明，HCMV是人類先天性感染最常見的病原體之一，孕期的HCMV原發(fā)感染 危害較大，2/3先天性感染是由孕期原發(fā)感染造成的。在先天性感染中，90%的患兒不表現(xiàn) 臨床癥狀，約有5%?10%受感染孕婦可造成流產(chǎn)、死胎、胎兒崎形、發(fā)育遲緩及遲發(fā)性中 樞神經(jīng)系統(tǒng)缺陷等后果。此外，HCMV活動性感染也是器官移植失敗和艾滋病患者繼發(fā)感染 死亡的主要原因之一。
[0003] 目前臨床上急需快速準確地診斷和監(jiān)測HCMV感染狀態(tài)的方法，在一些特定的人 群中尤為突出，比如器官移植手術(shù)中的供體和受體的選擇；育齡婦女W及接受免疫抑制劑 治療的人群等的篩查或監(jiān)測。HCMV在免疫力正常人群中通常呈隱性感染，雖病毒復(fù)制受到 抑制，但有間歇性排毒現(xiàn)象存在。而在HCMV活動性感染中，病毒大量復(fù)制，可在血液，尿液， 腦脊液等體液中檢測到活病毒。病毒分離是診斷HCMV活動性感染最重要的指標之一。但 是由于病毒自身的復(fù)制特點，病毒分離實驗周期較長，約需2?4周時間。而且病毒分離本 身操作繁瑣，對實驗條件、設(shè)備及技術(shù)均具有較高的要求，不適用于臨床對該病毒的及時監(jiān) 測及診斷。市場現(xiàn)有的用于檢測HCMV特異性IgM抗體的化ISA試劑因免疫抑制患者抗體 應(yīng)答能力降低或抗體延遲出現(xiàn)，常導(dǎo)致檢出率降低，出現(xiàn)假陰性。
[0004] 抗原血癥指在血液中檢測病原微生物特定的抗原，常用的方法有免疫巧光法和基 于磁珠的化學(xué)發(fā)光發(fā)法。HCMV pp65抗原血癥指在外周血單核細胞或中性粒細胞中檢測到 HCMVpp65抗原。該方法是由WIM Vander BIJ等1988年建立，CMV-10和CMV-11兩株單抗 也是由該實驗室制備。HCMV pp65是一種被膜蛋白，在病毒中含量較高，占完整病毒顆粒的 15%，在致密小體中高達90%。致密小體主要由病毒包膜包裹的被膜蛋白pp65形成。在有 蛋白合成抑制劑如放線菌酬存在下，病毒包膜和細胞膜融合后，病毒自身攜帶該蛋白進入 細胞后，即可用免疫巧光的方法檢測到HCMV pp65抗原。有研究表明，在血液中檢測到HCMV 抗原與病毒活動性感染有很好的一致性。因此HCMV pp65抗原血癥已經(jīng)成為一種檢測HCMV 活動性感染新的"金標準"。目前，全球僅有荷蘭IQ Pro化cts生產(chǎn)的"CMV Brite?化rbo Kit"獲得了美國FDA的批準，用于臨床檢測，但還未進入我國市場。
[0005] HCMV pp65抗原血癥免疫巧光法檢測試劑盒的兩大技術(shù)核屯、為制備pp65單克隆 抗體和陽性對照品（玻片）。由于制備pp65陽性對照品（玻片）的方法未見報道，本發(fā)明 旨在解決該一核屯、技術(shù)難題。已有通過EGFP示蹤技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，單獨轉(zhuǎn)染pp65基因時的 其亞細胞定位和病毒感染時的該基因亞細胞定位截然不同現(xiàn)象：單獨轉(zhuǎn)染時pp65主要定 位在細胞質(zhì)，而HCMV感染時pp65主要定位在細胞核。該就造成了采用基因工程技術(shù)單獨 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pp65的細胞不適合做陽性對照品（玻片）。因此我們對pp65編碼基因進行改造， 通過S輪PCR在其3'端加S個核定位信號，而且在核定位信號之前加上一個脯氨酸（Pro) 用來終止其可能存在的a螺旋結(jié)構(gòu)。將改造后的pp65編碼基因?qū)胝婧思毎麜r發(fā)現(xiàn)，其 已完全定位于細胞核。用該種改造后的細胞株制作的陽性品（玻片）辨識度更高，符合病 毒感染時的實際情況。另外，HCMV標準株AD169在實驗室長期傳代過程中，其基因組會發(fā) 生變異。通過對AD169株pp65編碼基因與野毒株pp65編碼基因的比對后我們發(fā)現(xiàn)，存在 多處的堿基突變（替換），該些突變分布在整個編碼序列。如果該突變發(fā)生在與抗體結(jié)合表 位，將會導(dǎo)致制備的相應(yīng)特異性抗體不能夠與其相互反應(yīng)。因此，我們采用臨床分離株（TR 株）作為改造模版，避免了基因突變導(dǎo)致的抗原與抗體不能夠結(jié)合的結(jié)果，保證了用于檢 測時的可靠性和分辨率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有檢測技術(shù)的不足及國外技術(shù)資料的封鎖，自行研發(fā)構(gòu) 建了一種穩(wěn)定表達HCMV pp65抗原的細胞株，用作HCMV pp65抗原血癥免疫巧光法檢測試 劑盒的陽性對照品（玻片）。
[0007] 本發(fā)明的目的是通過W下方案實現(xiàn)的：
[000引一種人巨細胞病毒pp65抗原血癥免疫巧光法檢測試劑盒陽性對照玻片的制備方 法，其特征在于：將HCMV TR株的pp65編碼基因改造、構(gòu)建至真核表達載體PCDNA3. 1，再轉(zhuǎn) 染至肥K293細胞，并篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株用于制作pp65抗原血癥檢測試劑盒陽性對照玻 片。
[0009] 所述的一種人巨細胞病毒PP65抗原血癥免疫巧光法檢測試劑盒陽性對照玻片的 制備方法，其特征在于：對HCMV TR株的pp65編碼基因改造通過如下方法實現(xiàn)：
[0010] (1)先W肥MV TR株pp65基因序列為模版，Wpp65化S-F和pp65化S-R1為引物進 行第一輪PCR;
[0011] 似再W第一輪PCR產(chǎn)物為模板Wpp65化S-F和pp65化S-R2為引物進行第二輪 PCR ；
[001引 （3)后W第二輪PCR產(chǎn)物為模板Wpp65化S-F和pp65化S-R3為引物進行第S輪 PCR ；
[0013] (4)將第S輪PCR產(chǎn)物通過化n I和化0 I限制性酶切位點連接至真核表達載體 pcDNAS. 1A ；
[0014] ^輪口0?循環(huán)引物如下；
[00巧]卵65化S-F ;CTCGAGATGGAGTCGCGCGGT
[0016] pp65 化 S-R1 ;TGGATCTACCTTTCTCTTCTTTTTTGGATCACCTCGGTGCTTTTTG
[0017] pp65化S-R2 ;TGGATCTACCTTTCTCTTCTTTTTTGGATCTGGATCTACCTTTC
[0018] pp65化S-R3 ;GGTACCTCTAGATCCGGTGGATCCTACCTTTCTCTTTGGATCTACCTTTCTC。
[0019] 所述的一種人巨細胞病毒pp65抗原血癥免疫巧光法檢測試劑盒陽性對照玻片的 制備方法，其特征在于：包括W下步驟：
[0020] A、HCMV pp65編碼基因的改造
[0021] --------------------------------------------------------
[00。] (1)根據(jù)Genebank中已公布的HCMV TR株pp65編碼基因序列，設(shè)計S輪PCR引 物，通過S輪PCR循環(huán)在pp65編碼基因的3'端加上S段核定位信號和一個脯氨酸；
[002引 S輪PCR循環(huán)引物如下；
[0024]卵65化S-F ;CTCGAGATGGAGTCGCGCGGT
[00 巧]pp65化S-R1 ;TGGATCTACCTTTCTCTTCTTTTTTGGATCACCTCGGTGCTTTTTG
[0026] pp65化S-R2 ;TGGATCTACCTTTCTCTTCTTTTTTGGATCTGGATCTACCTTTC
[0027] pp65化S-R3 ;GGTACCTCTAGATCCGGTGGATCCTACCTTTCTCTTTGGATCTACCTTTCTC
[0028] S輪PCR循環(huán)指的是；先W肥MV TR株DM為模版，W PP65化S-F和pp65化S-Rl 為引物進行第一輪PCR。再W第一輪PCR產(chǎn)物為模板W PP65化S-F和pp65化S-R2為引物進 行第二輪PCR。最后W第二輪PCR產(chǎn)物為模板W PP65化S-F和pp65化S-R3為引物進行第S 輪 PCR;
[0029] (2)將第S輪PCR產(chǎn)物通過化n I和化0 I限制性酶切位點連接至真核表達載體 PCDNA3. 1A，構(gòu)建的重組載體命名為PCDNA3. 1A-PP65化S ;
[0030] B、pp65穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的構(gòu)建
[0031] (1)轉(zhuǎn)染
[0032] 轉(zhuǎn)染前一天將肥K293細胞1 X 105個/ml鋪于六孔板中，每孔2ml ;轉(zhuǎn)染時在 e卵endcxrf管中加入150 y 1 DMEM培養(yǎng)液，加入重組質(zhì)粒2 y g混勻，再加入Promega公司 轉(zhuǎn)染試劑化GE肥皿Transfection Reagent 4 yl混勻，室溫放置15min后加入六孔板的 一個孔中，輕輕晃動六孔板，使復(fù)合物均勻分散開來，然后至于37°C，5% C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 4她；
[0033] 似篩選
[0034] 步驟（1)的培養(yǎng)結(jié)束后，棄去六孔板中培養(yǎng)液，PBS洗漆2次，換成含G-418400ng/ ml的DMEM完全培養(yǎng)基，每隔3天棄去舊培養(yǎng)基和死細胞，換新的含有G-418400ng/ml的 DMEM完全培養(yǎng)基，持續(xù)進行上述藥物篩選培養(yǎng)2-3周直到明顯的細胞集落形成；
[00對 做擴大培養(yǎng)
[0036] 將六孔板中的細胞集落消化下來，轉(zhuǎn)移到25cm2的細胞培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)使用含有 G-418400ng/ml的DMEM完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，待細胞長滿后傳代至更大面積的細胞培養(yǎng) 瓶，同時降低G4-18濃度至20化g/ml ;
[0037] (4)細胞凍存
[003引擴大培養(yǎng)后凍存一定數(shù)量的種子細胞，即獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞備用；
[0039] C、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的鑒定
[0040] (1)免疫巧光法鑒定
[0041] 將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞鋪于六孔板中，待其長滿后先用PBS洗漆2次，4%多聚甲醒固 定15111；[]1，1%曲拉通37°[穿透15111；[]1，20%小牛血清封閉3〇111；[]1;-抗為油cam公司pp65單 克隆抗體1 ;20稀釋，37°C解育化，PBS洗漆S次，每次5min ;二抗為Life公司Alexa Fluor 488conjugated羊抗鼠IgG 1:1000倍稀釋，室溫解育30min，同時采用DAPI襯染；
[0042] (2) Western blot 鑒定
[0043]