寡糖的發(fā)酵生產(chǎn)的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】真糖的發(fā)酵生產(chǎn) 發(fā)明領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明設(shè)及通過(guò)發(fā)酵制備2'-FL(2'-0-巖藻糖基乳糖，F(xiàn)uc(al-2)Gal(m-4)Glc) 和DFL (二巖藻糖基-乳糖，化C (α 1 -2) Ga 1 (β 1 -4)[化C (α 1 -3) ] G1C)的混合物的方法和所述混 合物用于制備巖藻糖(6-脫氧-半乳糖)的用途。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 巖藻糖是所謂的稀有單糖中的一種。其在來(lái)自很多不同來(lái)源的多種天然產(chǎn)物中被 發(fā)現(xiàn)為〇-和心型兩種。哺乳動(dòng)物細(xì)胞可W制備巖藻糖基化的多糖，如ΑΒ0血型抗原和多種人 乳寡糖。在海膽卵和青蛙卵中存在巖藻糖。巖藻糖存在于來(lái)自植物如海藻（褐藻糖膠 (化coidan)，硫酸鹽化的巖藻糖聚合物的形式），黃著膠，馬鈴馨，雜猴桃，大豆，翅豆品種， 加拿大油菜等的多糖中。在植物中，巖藻糖通常與植物多糖相關(guān)，所述植物多糖常常是高度 分支的結(jié)構(gòu)，在多糖鏈的末端或多糖鏈內(nèi)具有k化喃巖藻糖基單位。人或動(dòng)物糖蛋白的N- 和0-糖基二者都可W含有結(jié)合于碳水化合物鏈的末端的巖藻糖。此外，來(lái)自細(xì)菌、真菌和微 藻的細(xì)胞外多糖也含有巖藻糖。在所有天然活細(xì)胞中的巖藻糖基化過(guò)程具有兩個(gè)常見(jiàn)特 征:其由巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)，所述巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶將巖藻糖基殘基攜帶到適當(dāng)?shù)慕邮苷?上，并且其形成活化的巖藻糖核巧酸，即，GDP-巖藻糖，不是游離形式的巖藻糖。
[0004] 最近對(duì)游離形式的巖藻糖，特別是心巖藻糖的興趣增加，因?yàn)槠淇赡苡糜谥委煾?種疾病，炎性病況和與人免疫系統(tǒng)相關(guān)的病癥。巖藻糖也已經(jīng)用于化妝品，用于皮膚保濕、 皮膚再生、作為抗衰老劑W及用于預(yù)防皮膚炎癥。
[0005] 巖藻糖已經(jīng)從天然來(lái)源獲得，從單糖化學(xué)或酶學(xué)合成和通過(guò)微生物輔助的過(guò)程產(chǎn) 生。
[0006] 從天然來(lái)源，已經(jīng)從生物量，如藻，通過(guò)提取分離含有巖藻糖的寡糖，并且隨后已 經(jīng)將寡糖水解W提供巖藻糖和相關(guān)糖和衍生物的復(fù)合體混合物。巖藻糖的回收通常需要復(fù) 復(fù)雜的分離技術(shù)如利用陰離子或陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的色譜，透析，級(jí)分結(jié)晶等，著取決于附隨 的糖或糖相關(guān)化合物的性質(zhì)（例如W0 2005/040430，P. Saar i等人J. Li quid Qirom.Re1.Techno1.32,2050(2009))。
[0007] 巖藻糖的化學(xué)合成設(shè)及常見(jiàn)單糖如心半乳糖，D-半乳糖阿拉伯糖，D-葡萄糖， D -甘露糖和L -鼠李糖的化學(xué)修飾（參見(jiàn)綜述：P . T . V a η h 0 0 r e η等人 J.Chem.Technol.Biotechnol.74,479(1999)，W0 2011/144213，W02013/046180，W0 2013/ 046181)。巖藻糖和其類(lèi)似物的酶合成使用多酶體系從墨角藻糖(fuculose)-6-憐酸鹽進(jìn)行 (參見(jiàn)W0 97/15683)。
[000引也已經(jīng)培養(yǎng)了來(lái)自產(chǎn)堿菌屬物種(Alcaligenes sp.)的細(xì)菌來(lái)產(chǎn)生富含巖藻糖的 細(xì)胞外多糖，巖藻糖通過(guò)酸性水解被從其中釋放(參見(jiàn)EP-A-102535)。類(lèi)似地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)來(lái) 自腸桿菌科化nterobacteriaceae)的細(xì)菌株在有氧發(fā)酵條件下能夠產(chǎn)生含有心巖藻糖的 多糖，已經(jīng)通過(guò)酸性水解和很多純化步驟從其中分開(kāi)和分離巖藻糖（參見(jiàn)W0 2012/ 034996)。
[0009]近期已經(jīng)通過(guò)冗長(zhǎng)的化學(xué)方法步驟順序合成了巖藻糖基化的乳糖，特別是y-FL 和DFL(參見(jiàn)wo 2010/070616，W0 2010/115934，W0 2010/1 15935，Takeo等人 Carbohydr .Res.l41，159(1985) 'Fernandez-Mayoralas等人Carbohydr. Res . 154，93 (1986))。然而，已經(jīng)尋求產(chǎn)生巖藻糖基化的乳糖的較低成本方式，如通過(guò)利用轉(zhuǎn)化的大腸 桿菌發(fā)酵（參見(jiàn)Drouillard等人Angew.Qiem. Int.Ed.45,1778(2006) ;M.Ran化iantsoa: Synthese microbiologique des antigenes glucidiques des groupes s曰nguins，These de Doctorat soutenue le 30/09/2008a I'Universit有 Joseph Fourier,Grenoble, 化ance;W0 2010/070104;W0 2010/142305;W0 2012/097950W0 2012/112777;Lee等人 Mi crob. Ce 11 化ct. 11:48 (2012); Baum鐘irtner等人Mi crob. Ce 11 化ct. 12:40 (2013))。
[0010]然而，已經(jīng)繼續(xù)尋找低成本制造巖藻糖基化的乳糖的更好方法，所述巖藻糖基化 的乳糖可W被水解，從而W低成本產(chǎn)生巖藻糖。
[00川發(fā)明概述
[0012] 本發(fā)明的第一個(gè)方面設(shè)及W高產(chǎn)量獲得2'-化和D化的混合物（任選地含有化U (2'-0-巖藻糖基-半乳糖巧果糖)和/或FFL((化c(al-2)Fuc(al-2)Gal(m-4)Glc))的方法， 其包括在含有乳糖的水性培養(yǎng)或發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)或發(fā)酵，具有編碼單個(gè)巖藻糖基轉(zhuǎn)移 酶，有利地是1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的重組基因的遺傳修飾的細(xì)胞，有利地是大腸桿菌，更有 利地是LacZT+大腸桿菌細(xì)胞的步驟，所述巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶能夠修飾乳糖或在從乳糖生物合 成2 化的途徑中的中間體，并且其對(duì)于從乳糖合成2 化是必需的；該方法特征在于：
[0013] -在培養(yǎng)基中提供乳糖達(dá)多于4天，有利地多至7天;和/或有利地W連續(xù)的方式，在 培養(yǎng)基中提供，至少50,有利地是至少75,更有利地是至少100,甚至更有利地是至少125克 的乳糖/1升的初始培養(yǎng)體積，W致培養(yǎng)基的最終體積不大于培養(yǎng)前的培養(yǎng)基體積的Ξ倍， 有利地是不大于其兩倍，更有利地是小于其兩倍。
[0014] 有利地，得到的培養(yǎng)基中的2'-化和D化的混合物為每升的培養(yǎng)基中至少75,更有 利地是至少100,特別是至少115克。更有利地，得到的混合物中的Di^L的重量包括有利地是 至少2.5%，更有利地是至少5%，甚至更有利地是至少10%，特別是至少20%的y-化的重 量。
[0015] 此外有利地是，在培養(yǎng)步驟之前在培養(yǎng)基中提供碳基底物，更有利地是葡萄糖，W 產(chǎn)生遺傳修飾的細(xì)胞的指數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)。此外有利地是，將碳源和能源，更有利地是甘油，與 乳糖一起加入培養(yǎng)基中。此外有利地是，在培養(yǎng)步驟期間，遺傳修飾的細(xì)胞將2'-化和D化的 混合物分泌到培養(yǎng)基的細(xì)胞外空間中。
[0016] 本發(fā)明的第二方面設(shè)及W高產(chǎn)量獲得巖藻糖，特別是心巖藻糖的方法，其包括將 下述物質(zhì)進(jìn)行由酸起始的或由巖藻糖巧酶介導(dǎo)的水解的步驟：
[0017] -2 ' -化和/或DFL，優(yōu)選至少DFL，從包含2 ' -化和DFL的混合物中分離，所述混合物 通過(guò)本發(fā)明的第一方面的方法獲得，并且其中Di^L的重量包括有利地至少2.5%，更有利地 至少5%，甚至更有利地至少10%，特別是至少20%的2'-化的重量。
[0018] 有利地，水解利用強(qiáng)酸，更有利地是利用硫酸進(jìn)行。
[0019] 本發(fā)明的第Ξ個(gè)方面設(shè)及W高產(chǎn)量從乳糖獲得y-化的方法，其包括W下步驟:在 含有乳糖的水性培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有編碼巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，有利地是1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的 重組基因的遺傳修飾的細(xì)胞，優(yōu)選大腸桿菌，有利地是大腸桿菌LacZ飛+細(xì)胞，所述巖藻糖基 轉(zhuǎn)移酶有利地是1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶能夠修飾乳糖或在從乳糖生物合成y -化的途徑中的 中間體，并且其對(duì)于從乳糖合成y-化是必需的；該方法特征在于
[0020] -在培養(yǎng)基中提供乳糖達(dá)多于4天，有利地是多至7天;和/或
[0021] -有利地是W連續(xù)的方式，在培養(yǎng)基中提供，至少50,有利地是至少75,更有利地是 至少100,甚至更有利地是至少125克的乳糖/1升的初始培養(yǎng)體積，W致培養(yǎng)基的最終體積 不大于培養(yǎng)前的培養(yǎng)基體積的Ξ倍，有利地是不大于其兩倍，更有利地是小于其兩倍。
[0022] 有利地是，得到的培養(yǎng)基中的2/-化是每升的培養(yǎng)基中至少65,更有利地是至少 80,特別是至少90克。此外有利地是，在培養(yǎng)步驟期間，遺傳修飾的細(xì)胞將y-化分泌到培養(yǎng) 基的細(xì)胞外空間中。此外有利地是，在培養(yǎng)步驟前在培養(yǎng)基中提供碳基底物，有利地是葡萄 糖，從而產(chǎn)生遺傳修飾的細(xì)胞的指數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)。此外有利地是，將碳源和能源，更有利地是 甘油，與乳糖一起加入培養(yǎng)基中。
[0023] 本發(fā)明的第四個(gè)方面設(shè)及可W通過(guò)本發(fā)明第一方面的方法獲得的混合物，并且其 包含y -化和
[0024] -DFL+FLU或
[0025] -D 化+F 化或
[0026] -DFL+FLU+FFLo
[0027] 本發(fā)明的第五個(gè)方面設(shè)及提供FFL。
[002引附圖簡(jiǎn)述
[0029] 在下文將參考附圖進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明，其中：
[0030] 圖 1 顯示F化的 1h NMR譜（3001化，〇2〇，了55參考）。
[0031] 圖2顯示F化的1? NMR譜(75ΜΗζ，〇2〇,巖藻糖的甲基設(shè)置為20.4ppm)。
[0032] 發(fā)明詳述
[0033] 根據(jù)本發(fā)明，出人意料地發(fā)現(xiàn)，具有是巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，優(yōu)選1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶 的單個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶的遺傳修飾的細(xì)胞，在含有乳糖的水性發(fā)酵液或培養(yǎng)基中，可W :
[0034] -產(chǎn)生含有非常顯著量的y斗L和Di^L二者的混合物并且隨后
[0035] -將混合物分泌到培養(yǎng)基的細(xì)胞外空間，隨后可W容易地從其中分離混合物。
[0036] 隨后可簡(jiǎn)單的方式通過(guò)用酸或巖藻糖巧酶處理混合物水解該y-FL+Dni昆合 物，從而W相對(duì)低的成本提供高產(chǎn)量的巖藻糖。
[0037] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"遺傳修飾的細(xì)胞"優(yōu)選意為已經(jīng)在其基因組中添加、缺失或改 變至少一種DNA序列，W致其具有改變的表型的細(xì)胞。該表型的改變從野生型細(xì)胞的特征改 變?yōu)檫z傳修飾的細(xì)胞的特征。因此，當(dāng)被培養(yǎng)或發(fā)酵時(shí)，由于添加或改變的編碼至少一種在 野生型細(xì)胞中不存在的酶的表達(dá)的DNA，所述遺傳修飾的細(xì)