一種非諾特羅的膠體金檢測卡及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及食品安全檢測領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種非諾特羅的膠體金檢測卡及其制備 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 非諾特羅，屬于選擇性0 2型受體激動劑，它可用于治療支氣管哮喘，尤其對兒童 支氣管哮喘有較好的療效。0 2型受體激動劑種類較多，其它有鹽酸克侖特羅、萊克多己胺、 沙了胺醇、西布特羅、馬布特羅、漠布特羅、妥布特羅、氯丙那林、班布特羅等。在畜牧養(yǎng)殖 中，有少部分人將鹽酸克侖特羅等0 2型受體激動劑作為一種生長促進(jìn)劑非法添加到飼料 中，用W改善禍體的品質(zhì)，但同時也造成食品中0 2型受體激動劑的殘留。當(dāng)人們食用殘留 量大的食品后可能會出現(xiàn)一系列的中毒癥狀。我國已明令禁止在畜牧業(yè)中使用鹽酸克侖特 羅，沙了胺醇等0 2型受體激動劑。
[0003] 免疫層析技術(shù)是出現(xiàn)于80年代初期，通常W條狀纖維層析材料為固相，通過毛細(xì) 作用使樣品在層析條上爬動，層析材料上的受體（如抗體或抗原）與樣品中的待測物發(fā)生 特異性免疫反應(yīng)而顯色。免疫層析技術(shù)常見的示蹤粒子有膠體金、乳膠、膠體砸、明膠等，其 中運用最成功的標(biāo)記物為膠體金。用膠體金作為特殊標(biāo)記物的研究始于60年代初，1962年 Fel化err等報道了用膠體金標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行電子顯微鏡的研究。1971年，化^or等將膠體 金引入電鏡免疫標(biāo)記技術(shù)中。90年代W來，由于早孕試紙條的快速推廣和使用，使得膠體金 檢測卡成為開發(fā)最多，使用最廣，最為成熟的體外診斷試劑。
[0004] 目前，用于檢測非諾特羅公開報道的方法和標(biāo)準(zhǔn)較多；如農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)《動物源性食 品中0 -受體激動劑殘留檢測液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法》（1025號公告-18-2008)，非諾特羅 檢測限可達(dá)0. 25 y g/kg ;迂寧省地方標(biāo)準(zhǔn)《牛羊組織中0 -受體激動劑殘留檢測超高效液 相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》值B 21/3004-2013)，非諾特羅檢測限可達(dá)0. 25 y g/kg ;吉林省地 方標(biāo)準(zhǔn)《動物源性食品中24種受體激動劑殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》值BS22 012-2013)，非諾特羅檢測限可達(dá)0. 1 y g/kg ;然而用于檢測非諾特羅的產(chǎn)品鮮有報道，中 國專利文獻(xiàn)公開號CN102359961A的專利，公開了一種用于0 -腎上腺素受體激動劑類化 合物檢測的試劑盒，該方法是通過比較樣品溶液與空白溶液的變色時間來定性檢測非諾特 羅，其存在靈敏度低，準(zhǔn)確性差，不能定性檢測非諾特羅等問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于針對上述問題，提供一種非諾特羅的膠體金檢測卡及其制備方 法，其具有成本低、靈敏度高、檢測方便、快捷的特點。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過W下技術(shù)方案來實現(xiàn)：
[0007] 一種非諾特羅的膠體金檢測卡，包括卡殼及設(shè)置于卡殼內(nèi)的試紙條，所述試紙條 上沿液體流動方向依次設(shè)置有樣本墊、金標(biāo)結(jié)合物墊、硝酸纖維素膜、吸水墊，所述金標(biāo)結(jié) 合物墊上包被有抗非諾特羅單克隆抗體-膠體金結(jié)合物，所述抗非諾特羅單克隆抗體-膠 體金結(jié)合物中的抗非諾特羅單克隆抗體是w非諾特羅偶聯(lián)抗原I為免疫抗原制備的，所述 硝酸纖維素膜上鄰近金標(biāo)結(jié)合物墊的一端設(shè)置有檢測線，且硝酸纖維素膜上鄰近吸水墊的 一端設(shè)置有質(zhì)控線，所述檢測線上包被有非諾特羅偶聯(lián)抗原II，所述質(zhì)控線上包被有抗鼠 二抗。
[000引作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述卡殼由底卡及面卡構(gòu)成，且卡殼由塑料材料制成。
[0009] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述面卡上開有加樣孔，所述加樣孔位于樣本墊的上方。
[0010] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述面卡上開有觀察窗，所述觀察窗位于硝酸纖維素膜 的上方。
[0011] 一種非諾特羅的膠體金檢測卡制備方法，包括W下步驟：
[0012] 一、金標(biāo)結(jié)合物墊的制備：
[001引 a、合成非諾特羅偶聯(lián)抗原I :取載體蛋白，用雙蒸水溶解后，再用化OH調(diào)抑至 10,加入1，4- 了二醇二縮水甘油離，在氮氣保護(hù)下，避光攬拌24小時，通過柱層析純化制 得接臂載體蛋白，所述1,4-了二醇二縮水甘油離與蛋白載體的摩爾比為100:1，將非諾特 羅調(diào)成堿性后，在攬拌條件下緩慢加入到接臂載體蛋白中，氮氣保護(hù)下室溫避光攬拌24小 時，反應(yīng)產(chǎn)物在4°C用0. Olmol/L的磯酸鹽緩沖液透析3天，透析后得到非諾特羅偶聯(lián)抗原 I ;
[0014] b、免疫動物；將上述步驟a中制成的非諾特羅偶聯(lián)抗原I與等量弗氏完全佐劑乳 化完全后，免疫小鼠；
[0015] C、細(xì)胞融合和雜交瘤細(xì)胞篩選：取經(jīng)非諾特羅偶聯(lián)抗原I免疫的小鼠脾細(xì)胞與 SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，并采用HAT培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，對培養(yǎng)上清進(jìn)行檢測，篩選獲得 穩(wěn)定分泌抗非諾特羅單克隆抗體的細(xì)胞株14F8-B3-C9 ;
[0016] t制備腹水；將分泌抗非諾特羅單克隆抗體的細(xì)胞株14F8-B3-C9培養(yǎng)后，注射入 BALB/C小鼠腹腔，收集其腹水；
[0017] e、抗非諾特羅單克隆抗體的純化制備；采用硫酸錠沉淀法對腹水進(jìn)行透析、過濾 處理，采用非諾特羅親和層析柱對經(jīng)透析、過濾處理的上清進(jìn)行純化，提純制備出抗非諾特 羅單克隆抗體；
[001引 f、膠體金溶液制備：在超純水中加入1 %氯金酸，加熱煮沸，迅速加入1 %巧樣酸 =鋼，繼續(xù)煮沸15分鐘，所述超純水、氯金酸、巧樣酸=鋼的體積比為99 ;1 ;1，冷卻后用超 純水恢復(fù)至原來的體積，4°C保存?zhèn)溆茫?br>[0019] g、抗非諾特羅單克隆抗體-膠體金結(jié)合物溶液的制備；將膠體金溶液調(diào)抑至 6. 0,用20 y g/血濃度的抗非諾特羅單克隆抗體反應(yīng)1小時，然后用10%牛血清白蛋白進(jìn)行 封閉，4°C 7500g離屯、30分鐘，去上清，膠體金沉淀用1/10膠體金體積的金標(biāo)復(fù)溶液進(jìn)行溶 解，制成抗非諾特羅單克隆抗體-膠體金結(jié)合物溶液，所述膠體金溶液、抗非諾特羅單克隆 抗體、牛血清白蛋白的體積比為100 ; 10 ;5 ;
[0020] K制備金標(biāo)結(jié)合物墊；將上述制備的抗非諾特羅單克隆抗體-膠體金結(jié)合物溶液 W 4 y L/cm噴量噴涂于結(jié)合物墊上，37度干燥3小時后，放于濕度低于20 %的干燥柜保存 備用；
[0021] 二、硝酸纖維素膜的制備：
[0022] a、合成非諾特羅偶聯(lián)抗原II ;將對氨基苯甲酸、亞硝酸鋼溶于抑2. 0的溶液中，在 冰浴和避光條件下振蕩反應(yīng)4小時，制得重氮鹽，所述對氨基苯甲酸、亞硝酸鋼的質(zhì)量比為 1 ;2,將該重氮鹽與非諾特羅反應(yīng)，生成非諾特羅衍生物，產(chǎn)物經(jīng)柱層析純化，將純化后的非 諾特羅衍生物與載體蛋白按摩爾比50:1，采用邸C/N服法合成非諾特羅偶聯(lián)抗原II，然后 在4°C用0. Olmol/L磯酸鹽緩沖液透析3天，得到純化的非諾特羅偶聯(lián)抗原II ;
[0023] b、制備硝酸纖維素膜；W 0. Olmol/L，抑7. 4的磯酸鹽緩沖液為稀釋液，將非諾特 羅偶聯(lián)抗原II稀釋至0. 5mg/mU并W 1 y L/cm噴量噴涂于硝酸纖維素膜的一端作為檢測 線，將抗鼠二抗稀釋至1.〇111肖/111以并^ luL/cm噴量噴涂于硝酸纖維素膜的另一端作為質(zhì) 控線，37°C干燥2小時后，密封，室溫保存?zhèn)溆茫?br>[0024] S、非諾特羅的膠體金檢測卡的組裝：
[0025] 在底板上依次粘貼樣本墊、金標(biāo)結(jié)合物墊、硝酸纖維素膜、吸水墊從而組裝成試紙 條，所述硝酸纖維素膜包被非諾特羅偶聯(lián)抗原II的一端搭接金標(biāo)結(jié)合物墊，且硝酸纖維素 膜包被抗鼠二抗的一端搭接吸水墊，將試紙條剪切成一定寬度后裝于卡殼中。
[0026] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述載體蛋白為牛血清白蛋白或陽離子化牛血清白蛋白 或卵清蛋白或鑰孔血藍(lán)蛋白。
[0027] 作為