一種檢測(cè)人復(fù)制蛋白變體含量的膠乳增強(qiáng)免疫比濁試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)免疫體外診斷試劑領(lǐng)域，涉及一種檢測(cè)人復(fù)制蛋白變體含量的膠 乳增強(qiáng)免疫比濁試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 人復(fù)制蛋白 CIZl $ipl interacting zinc finger protein 1)是參與 DNA 復(fù) 制的一種核蛋白，它與包括多種癌癥在內(nèi)的很多人類疾病相關(guān)。有研究表明，第14、15 號(hào)外顯子發(fā)生突變的CIZl突變體（CIZl-V)是一個(gè)早期肺癌和多種腫瘤生物標(biāo)記物，以 它作為腫瘤特異性檢測(cè)單標(biāo)記物，能夠不依靠傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的侵入性檢測(cè)手段從風(fēng)險(xiǎn)人群中 診斷鑒定出患有早期肺癌的患者。由于目前CIZl突變體（CIZl-V)的突變片段多肽序列 ⑶EDEEEIEVRSRDISR很短，一般的檢測(cè)需要基因測(cè)序或侵入性檢測(cè)手段才能通過PCR等技 術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，提供一種檢測(cè)人復(fù)制蛋白變體含量的 膠乳增強(qiáng)免疫比濁試劑盒。
[0004] 本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0005] -種檢測(cè)人復(fù)制蛋白變體含量的膠乳增強(qiáng)免疫比濁試劑盒，包括試劑R1、試劑R2 和復(fù)制蛋白變體標(biāo)準(zhǔn)品溶液，其中：
[0006] 所述試劑Rl包含電解質(zhì)、促凝劑、防腐劑及緩沖液；
[0007] 所述試劑R2包含抗人復(fù)制蛋白變體的多克隆抗體包被的膠乳顆粒、電解質(zhì)、穩(wěn)定 齊U、防腐劑及緩沖液；
[0008] 所述復(fù)制蛋白變體標(biāo)準(zhǔn)品溶液為含有不同濃度復(fù)制蛋白變體標(biāo)準(zhǔn)品的緩沖液。
[0009] 優(yōu)選的，所述的反應(yīng)緩沖液為PBS緩沖液、Ifepes緩沖液、MES緩沖液、Tris-HCl緩 沖液、甘氨酸緩沖液、醋酸緩沖液或DIPSO緩沖液中的一種或幾種，緩沖液濃度在20-200mM 之間。
[0010] 優(yōu)選的，所述Rl中防腐劑優(yōu)選疊氮鈉（NaN3)，促凝劑選自roG6000、PEG8000和 PEG12000,優(yōu)選PEG6000或不同PEG的混合體，在試劑R2中的濃度為2. 0% -3. 5%。
[0011] 優(yōu)選的，所述的膠乳顆粒為直徑范圍〇. 05-0. 20 μ m的聚苯乙烯膠乳顆粒，試劑R2 中膠乳顆粒濃度為〇. 1% -〇. 8%。
[0012] 進(jìn)一步優(yōu)選的，所述的膠乳顆粒為直徑0. 13 μ m的聚苯乙烯膠乳顆粒，試劑R2中 膠乳顆粒濃度為0.2%。
[0013] 所述的抗人復(fù)制蛋白變體的多克隆抗體選自兔、羊、雞的免疫球蛋白，優(yōu)選兔抗， 經(jīng)人復(fù)制蛋白變體免疫、親和層析純化獲得的免疫球蛋白；進(jìn)一步優(yōu)選合成CIZl-V第14、 15號(hào)外顯子基因表達(dá)的突變片段多肽序列CDEDEEEIEVRSRDISR(SEQ ID NO. 1)，將合成的多 肽序列偶聯(lián)至血藍(lán)蛋白載體蛋白上制備抗原并免疫兔、羊、雞、再經(jīng)親和層析純化獲得的免 疫球蛋白。
[0014] 抗人復(fù)制蛋白變體的多克隆抗體包被膠乳顆粒是通過化學(xué)交聯(lián)劑在交聯(lián)緩沖液 中進(jìn)行的，所用化學(xué)交聯(lián)劑為碳化二亞胺（EDAC)和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)，交聯(lián)緩沖液 選自PBS緩沖液、Hepes緩沖液、MES緩沖液、Tris-HCl緩沖液、甘氨酸緩沖液、醋酸緩沖液 或DIPSO緩沖液，pH在6. 0-8. 0之間。
[0015] 優(yōu)選的，所述抗人復(fù)制蛋白變體的多克隆抗體利用化學(xué)交聯(lián)劑碳化二亞胺（EDAC) 和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)定向固定在苯乙烯膠乳顆粒上的途徑為：取20 μ g膠乳微球 于1.5mL EP管中，加入ImL MES緩沖液（pH6. 0)，槍頭混勻；HOOOrpm離心30min，去上清， 加入 0· 5mL EDAC 溶液（0· 2-2. Omg/mL)，22°C 16rpm 旋轉(zhuǎn) IOmin ;再加入 50μ L NHS 溶液 (0· 2-2. Omg/mL)，22°C 16rpm 旋轉(zhuǎn) 30min，膠乳顆粒得到活化，之后 HOOOrpm 離心 30min， 去上清，加入ImL 50mM PBS緩沖液（pH7. 4)，槍頭混勻；HOOOrpm離心30min，去上清，加入 ImL 50mM PBS 緩沖液（pH7. 4)，超聲 15s，加入 20yg CIZl-V抗體，37°C16rpm旋轉(zhuǎn) 2h;加入 1(^1^終止液（11?甘氨酸+10%854)，371：16印111旋轉(zhuǎn)111。14000印111離心251^11，去上清， 加入ImL貯存液（30mM pH7. 4的H印es或DIPSO緩沖液，防腐劑0. 1 % NaN3，電解質(zhì)0. 01 % NaCl，穩(wěn)定劑 0· 01% EDTANajP 0· 09% BSA)，超聲 20s ; HOOOrpm 離心 20min，去上清，加入 ImL貯存液，超聲20s，4°C保存。
[0016] 所述的復(fù)制蛋白變體標(biāo)準(zhǔn)品通過以下方法制備：合成CIZl-V第14、15號(hào)外顯子基 因表達(dá)的突變片段多肽序列⑶EDEEEIEVRSRDISR，將合成的多肽偶聯(lián)至卵白蛋白（OVA)載 體蛋白得到復(fù)制蛋白變體標(biāo)準(zhǔn)品。
[0017] 優(yōu)選的，所述復(fù)制蛋白變體標(biāo)準(zhǔn)品溶液為含有不同濃度復(fù)制蛋白變體標(biāo)準(zhǔn)品的適 當(dāng)緩沖液，其中復(fù)制蛋白變體含量分別為0 μ g/mL、0. 50 μ g/mL、I. 00 μ g/mL、2. 00 μ g/mL、 4· 00 μ g/mL、8. 00 μ g/mL或類似比例濃度，緩沖液為PBS緩沖液、！fepes緩沖液或Tris-HCl 緩沖液中的一種或幾種。
[0018] 優(yōu)選的，檢測(cè)時(shí)R1、R2分別加取112. 5 μ L和37. 5 μ L，樣品加樣量為2-8 μ L，或類 似比例整體增減。
[0019] 最優(yōu)選的，檢測(cè)人血清中復(fù)制蛋白變體含量的膠乳增強(qiáng)免疫比濁試劑盒組成如 下：
[0020] 試劑 Rl :50mM PBS 緩沖液（ρΗ7· 4)，2· 5% PEG8000,0. 015% NaCl, 0· 5% NaN3;
[0021] 試劑1?2:0.2%兔抗人復(fù)制蛋白變體抗體包被膠乳顆粒（粒徑0.1311111)，3〇1111 ρΗ7· 4 的！fepes 或 DIPSO 緩沖液，0· 1% NaN3,0. 01% NaCl，0. 01% EDTANaJP 0· 09% BSA ;
[0022] 復(fù)制蛋白變體標(biāo)準(zhǔn)品溶液：合成的CIZl-V第14、15號(hào)外顯子基因表達(dá)的多肽序 列CDEDEEEIEVRSRDISR偶聯(lián)卵白蛋白（OVA)載體蛋白作為抗原標(biāo)準(zhǔn)品，50mM PBS緩沖液 (ρΗ7· 4)。
[0023] 在本發(fā)明中，復(fù)制蛋白變體與膠乳顆粒包被的兔抗人復(fù)制蛋白變體多克隆抗體發(fā) 生抗原抗體反應(yīng)，形成抗原一抗體一膠乳顆粒復(fù)合物，導(dǎo)致濁度上升，優(yōu)選的，測(cè)定此濁度 在500-600nm(最優(yōu)選的，600nm)波長(zhǎng)處的吸光度，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算樣本中復(fù)制蛋白 變體含量。
[0024] 有益效果：
[0025] 目前關(guān)于CIZl-V的報(bào)道還非常少，也沒有相關(guān)試劑盒技術(shù)及產(chǎn)品面世。由于目前 CIZl突變體（CIZl-V)的突變片段多肽序列CDEDEEEIEVRSRDISR很短，一般的檢測(cè)需要基因 測(cè)序或侵入性檢測(cè)手段才能通過PCR等技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明將CIZl-V第14、15號(hào)外顯子 基因表達(dá)的突變片段多肽序列⑶EDEEEIEVRSRDISR偶聯(lián)至血藍(lán)蛋白載體蛋白上制備抗原， 并免疫兔、羊、雞、再經(jīng)親和層析純化獲得的免疫球蛋白。合成CIZl-V第14、15號(hào)外顯子基 因表達(dá)的突變片段多肽序列⑶EDEEEIEVRSRDISR，將合成的多肽偶聯(lián)至卵白蛋白（OVA)載 體蛋白得到復(fù)制蛋白變體標(biāo)準(zhǔn)品，使得突變小片段也能用常規(guī)的膠乳增強(qiáng)免疫比濁試劑盒 通過優(yōu)化條件，能夠在全自動(dòng)生化檢測(cè)儀上進(jìn)行檢測(cè)，達(dá)到成本低、方便、快速、正確進(jìn)行臨 床檢測(cè)。
[0026] 本發(fā)明用化學(xué)偶聯(lián)法將特異性兔抗人復(fù)制蛋白變體抗體包被到活化后得膠乳顆 粒表面，并通過添加特定的穩(wěn)定劑、防腐劑和促凝劑使膠乳顆粒形成均一穩(wěn)定的懸濁液。使 用時(shí)操作簡(jiǎn)便快捷，適應(yīng)臨床快速高通量篩查的要求。特異性抗體免疫球蛋白的使用保證 了試劑盒較高的特異性，有效避免了其它物質(zhì)的干擾。
[0027] 本發(fā)明的性能鑒定選擇了靈敏性、準(zhǔn)確性、精密性、特異性這幾個(gè)參數(shù)，并與Elisa 方法進(jìn)行了檢測(cè)結(jié)果的比較。此試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2達(dá)到0.9988,線性較好， 檢測(cè)限達(dá)到〇. 2 μ g/mL，對(duì)表達(dá)純化所得目的蛋白的回收率比較高，而變異系數(shù)較低，批間 及批內(nèi)變異系數(shù)均小于10%，說明此試劑盒有較好的準(zhǔn)確性和精密性。通過對(duì)此試劑盒 以及Elisa方法檢測(cè)結(jié)果的比較分析，顯示兩種方法對(duì)于同一濃度的表達(dá)純化所得目的蛋 白的回收率無顯著差異（P3 0.05)。用兩者進(jìn)行蛋白表達(dá)量檢測(cè)時(shí)，結(jié)果也無顯著差異 (P > 0.05)，但是比Elisa方法操作時(shí)間短、簡(jiǎn)單方便、成本低。此試劑盒能從多種蛋白中 特異且準(zhǔn)確地檢測(cè)出目的蛋白的含量，說明其具有較高的特異性，便于方便快速檢測(cè)。
【附圖說明】
[0028] 圖1復(fù)制蛋白變體膠乳增強(qiáng)免疫比濁試劑盒檢測(cè)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0029] 圖2 CIZl-V融合蛋白表達(dá)純化結(jié)果SDS-PAGE鑒定
[0030] 其中，M :蛋白Marker ; 1 :過柱如上清；2 :過柱后上清；3 :目的蛋白
[0031] 圖3不同膠乳微球粒徑制備的R2與Rl及標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)后的檢測(cè)結(jié)果比較
[0032] 圖4 0. 13 μ m的膠乳制備的R2在不同膠乳濃度檢測(cè)結(jié)果比較
[0033] 圖5 0. 13 μ m的0. 2%濃度的膠乳配制成R2在不同波長(zhǎng)檢測(cè)結(jié)果比較
【具體實(shí)施方式】
[0034] 為了使本發(fā)明的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于了解，下面結(jié)合具體實(shí) 施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0035] 實(shí)施例1復(fù)制蛋白變體膠乳增強(qiáng)免疫比濁試劑盒的制備
[0036] 試劑 Rl :試劑 Rl :50mM PBS 緩沖液（pH7. 4)，2. 5% PEG8000,0. 015% NaCl, 0· 5% NaN3，該試劑為無色透明溶液。
[0037] 試劑卩2:0.2%兔抗人復(fù)制蛋白變體抗體包被膠乳顆粒（粒徑0.1311111)，3〇1111 ρΗ7· 4 的！fepes 或 DIPSO 緩沖液，0· 1 % NaN3,0· 01 % EDTANaJP 0· 09% BSA ;
[0038] 制備方法：
[0039] (1)分別取 0· 2mg 粒徑 0· 099 μ m, 0· 13 μ m, 0· 189 μ m, 0· 20 μ m 的膠乳微球于 50mL 離心管中，加入IOmL MES緩沖液（pH6. 0)，槍頭混勻，HOOOrpm離心30min，去上清；
[0040] (2)稱取 2mg EDAC 粉末溶于 IOmL MES 緩沖液（ρΗ6· 0)中配制 0· 2mg/mL EDAC 溶 液，加入5mL于上述離心管，22°C 16rpm旋轉(zhuǎn)IOmin ;
[0041] (3)稱取8mg NHS粉末溶于ImL MES緩沖液（ρΗ6· 0)中配制8mg/mLNHS溶液， 取0. 5mL加入上述離心管，溶解混勻后22°C 16rpm旋轉(zhuǎn)30min，膠乳顆粒得到活化，之后 HOOOrpm離心30min，去上清；
[0042] (4)在上述離心管中加入IOmL 50mM PBS緩沖液（ρΗ7· 4)，槍頭混勻；HOOOrpm離 心30min，去上清；
[0043] (5)在上