一種胃蛋白酶原Ⅰ化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種胃蛋白酶原I化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒 及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 胃蛋白酶原（pepsinogen，PG)是胃分泌的一種消化酶前體，是胃液中胃蛋白酶的 無活性前體，為一個(gè)由375個(gè)氨基酸組成的蛋白多肽鏈，平均相對(duì)分子質(zhì)量為42, 000,人胃 粘膜中有7組胃蛋白同工酶原。PG在核糖體上合成，由高爾基體分泌出細(xì)胞，被鹽酸激活后 變成胃蛋白酶。根據(jù)生化性質(zhì)、免疫原性、細(xì)胞來源及組織內(nèi)分布可分成PG I、PG II兩個(gè) 亞群，其中1~5組分免疫原性近似，稱為PG I，主要由胃腺的主細(xì)胞的粘液頸細(xì)胞分泌。
[0003] 胃蛋白酶原I被鹽酸激活后變成小分子的胃蛋白酶，胃蛋白酶只在酸性環(huán)境中發(fā) 揮作用，PH>6即失去活性，pH=2時(shí)優(yōu)先作用于天然蛋白質(zhì)，pH=4時(shí)能消化某些特異性的肽。 在體外，胃蛋白酶的持續(xù)作用可使蛋白分子的肽鍵約有30%分裂。胃蛋白酶不作用于角蛋 白和黏蛋白，亦不作用于低相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白衍生物。在復(fù)合維生素與蛋白質(zhì)結(jié)合和釋 放上，胃蛋白酶亦起主要作用。
[0004] 血清PG濃度可作為胃酸分泌的檢測(cè)指標(biāo)，在幽門螺桿菌陽性體內(nèi)，PG I水平和 PG I /PG II比值與胃酸分泌量顯著相關(guān)，其中后者與胃酸分泌量相關(guān)性更強(qiáng)。在幽門螺桿 菌陰性體內(nèi)，PG I的水平與胃酸分泌量顯著相關(guān)，但PG I /PG II比值與胃酸分泌量無相關(guān) 性。通過血清PG濃度估計(jì)胃酸分泌量具有臨床實(shí)用價(jià)值。
[0005] PG含量與良、惡性胃潰瘍的鑒別有關(guān)，血清PG I水平與萎縮性胃炎和消化性潰瘍 呈正相關(guān)，血清PG I水平升高者，應(yīng)注意其是否存在潰瘍的可能性，對(duì)于臨床上無癥狀潰 瘍的鑒別具有意義。血清PG I與胃泌酸腺細(xì)胞功能相關(guān)，PG II與胃底粘膜病變的相關(guān)性 較大，血清PG反映胃總體分泌PG水平。胃酸分泌過多引起的淺表性胃炎和幽門螺桿菌感 染引起的萎縮性胃炎都會(huì)導(dǎo)致PG I和PG II的分泌增加；慢性嚴(yán)重萎縮性胃炎當(dāng)主細(xì)胞減 少時(shí)PG I含量下降；萎縮性胃炎當(dāng)伴有腸化、胃竇憲假幽門腺化生時(shí)，PG II含量會(huì)隨之增 尚。
[0006] 胃蛋白酶原對(duì)胃部疾病的發(fā)展歷程，一般可表述為：淺表性胃炎一胃粘膜糜爛潰 瘍一萎縮性胃炎，及其它疾病具有良好的診斷和篩選作用。胃蛋白酶原I /11檢測(cè)試劑盒 用于檢測(cè)血清中的胃蛋白酶原I / II的含量，具有簡(jiǎn)便、快速的優(yōu)勢(shì)，避免了 X-射線對(duì)人體 的侵害和胃鏡的不便。
[0007] 20世紀(jì)70年代中期Arakawe首次報(bào)道用發(fā)光信號(hào)進(jìn)行分析檢測(cè)，即利用發(fā)光 的化學(xué)反應(yīng)（chemiluminescence，CL)和生物反應(yīng)（bioluminescence，BL)分析超微量 物質(zhì)，特別是用于臨床免疫分析中檢驗(yàn)超微量活性物質(zhì)。這一方法從實(shí)驗(yàn)室的稀有技 術(shù)過渡到臨床醫(yī)學(xué)的常規(guī)檢測(cè)手段，近十年來獲得了很大的發(fā)展?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析 (chemiluminescence immunoassay，CLIA)靈敏度高（10~18mol)、快速（幾秒鐘內(nèi)產(chǎn)生化學(xué) 發(fā)光信號(hào)，有的情況下信號(hào)可持續(xù)幾小時(shí))、簡(jiǎn)便、測(cè)試中不使用有害試劑，因此成為非放射 性免疫分析法中最有前途的方法之一。
[0008] 我公司采用的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，是利用酶催化發(fā)光底物使其發(fā)生化學(xué)反應(yīng) 并釋放出大量的能量，產(chǎn)生激發(fā)態(tài)中間體。這種激發(fā)態(tài)中間體，當(dāng)其回到穩(wěn)定的基態(tài)時(shí)，可 同時(shí)發(fā)射出光子，利用發(fā)光信號(hào)測(cè)量?jī)x器即可測(cè)量光量子產(chǎn)額，該光量子產(chǎn)額與樣品中的 待測(cè)物質(zhì)的量成比例，由此可以建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算樣品中待測(cè)物質(zhì)的含量。與幾種傳統(tǒng) 的免疫學(xué)檢測(cè)方法對(duì)比而言，無論從最低檢測(cè)限、檢測(cè)時(shí)間、線性范圍、試劑的穩(wěn)定性、有無 環(huán)境污染等方面對(duì)比，化學(xué)發(fā)光法的優(yōu)勢(shì)都顯得極為突出。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種胃蛋白酶原I化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒及其制備方法。
[0010] 本發(fā)明所述的胃蛋白酶原I化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒，包括：1)胃蛋白酶原I抗 體包被微孔板；2) HRP標(biāo)記胃蛋白酶原I抗體；3)校準(zhǔn)品稀釋液稀釋后的系列胃蛋白酶原 I校準(zhǔn)品；4)發(fā)光底物A ;5)發(fā)光底物B ;6)固體洗液。
[0011] 所述胃蛋白酶原I抗體為鼠源或兔源人胃蛋白酶原I單克隆抗體。
[0012] 所述包被的微孔板為48孔或96孔的微孔板條。
[0013] 所述校準(zhǔn)品稀釋液的配方為： 去離子水 IL Na2HPO4 2.9g NaH2PO4 0. 2g NaCl 8. 2g 復(fù)合蛋白保護(hù)劑PHD 0. 5g 5%酪蛋白 IOg Tween-20 10mT, 0. 1%疊氮鈉 ImL。
[0014] 調(diào)節(jié)胃蛋白酶原I校準(zhǔn)品的稀釋液pH為7. 4。
[0015] 所述發(fā)光底物A為魯米諾和氫氧化鈉溶液。
[0016] 所述發(fā)光底物B為過氧化氫和對(duì)碘苯酚溶液。
[0017] 所述固體洗液為PBST，PBST固體洗液配方為 KH2PO4 4.8g Na2HPO4* 12H20 28. 8g NaCl 155g Tween-20 10mL。
[0018] 本發(fā)明的胃蛋白酶原I化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒制備方法，包括以下步驟：1)配 制PBST固體洗液及其稀釋液；2)胃蛋白酶原I抗體包被微孔板的制備；3)HRP標(biāo)記胃蛋白 酶原I抗體的制備；4)胃蛋白酶原I校準(zhǔn)品的制備；5)配制發(fā)光底物A、發(fā)光底物B ;6)分 裝固體洗液、酶標(biāo)抗體、校準(zhǔn)品、發(fā)光底物A和發(fā)光底物B并組裝為成品。其中： 所述配制PBST固體洗液及其稀釋液的步驟為：混合均勻后的PBST固體洗液在氣壓 500Pa、溫度10°C、濕度30%狀態(tài)下減壓低溫干燥，Ih后用鋁箔袋分裝，使用時(shí)每5g的PBST 固體洗液溶解在500mL去離子水中混勻。
[0019] 所述制備胃蛋白酶原I抗體包被微孔板的步驟為：采用包被緩沖液將胃蛋白酶原 I單克隆抗體稀釋至濃度為1~5 μ g/mL，將其吸附于微孔板上，再用固體洗液稀釋液洗板兩 次，采用封閉液對(duì)包被后的微孔板進(jìn)行封閉和保護(hù)。
[0020] 所述包被緩沖液為碳酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液或TriS-HCl緩沖液。
[0021] 所述HRP標(biāo)記的胃蛋白酶原I抗體的制備的步驟為：配制酶標(biāo)抗體稀釋液，用過 碘酸鹽法將HRP標(biāo)記在單克隆抗體上，經(jīng)試驗(yàn)證明，胃蛋白酶原I酶標(biāo)抗體的工作濃度范 圍為50ng/mL以上。
[0022] 所述胃蛋白酶原I校準(zhǔn)品的制備的步驟為：配制胃蛋白酶原I校準(zhǔn)品稀釋液，將 人工合成的胃蛋白酶原I用校準(zhǔn)品稀釋液稀釋成含量分別為5yg/mL、20yg/mL、50yg/ mL、100 μ g/mL、200 μ g/mL的系列濃度，建立定量校準(zhǔn)品。
[0023] 所述HRP標(biāo)記胃蛋白酶原I抗體所用的酶標(biāo)抗體稀釋液的配方為： 去離子水 IL Na2HPO4 2.9g NaH2PO4 0. 2g NaCl 8. 2g 25%BSA IOg 酶穩(wěn)定劑 Ig 0. 1%疊氮鈉 ImL。
[0024] 本發(fā)明的技術(shù)方案：一種血清胃蛋白酶原I化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)方法，基于化學(xué)發(fā) 光免疫分析法。胃蛋白酶原I單克隆抗體包被化學(xué)發(fā)光微孔板，形成固相抗體。檢測(cè)時(shí)向 包被微孔中加入血清樣品或胃蛋白酶原I校準(zhǔn)品，再加入HRP標(biāo)記的胃蛋白酶原I單克隆 抗體進(jìn)行反應(yīng)，形成抗體-抗原-抗體-HRP復(fù)合物。反應(yīng)后用固體洗液稀釋液洗去未結(jié)合 的HRP-胃蛋白酶原I單克隆抗體，然后加入發(fā)光底物，檢測(cè)發(fā)光信號(hào)的強(qiáng)度。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，HRP標(biāo)記的胃蛋白酶原I單克隆抗體與固相載體上包被的 抗體同被測(cè)樣品中的胃蛋白酶原I形成"包被抗體-抗原-酶標(biāo)抗體"的夾心復(fù)合物結(jié)構(gòu)， 因此本發(fā)明采用的"雙抗體夾心法"反應(yīng)模式，既有效地利用抗原-抗體反應(yīng)的高特異性， 又結(jié)合了化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的高靈敏度，可為臨床診斷提供更為特異、快速、可靠的依 據(jù)。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，反應(yīng)模式為：微孔內(nèi)先加入2〇μ?胃蛋白酶原I校準(zhǔn)品或者 血清，然后加入5〇μ?的HRP標(biāo)記的胃蛋白酶原I單克隆抗體，在微量振蕩器上混合30s， 37°C溫育lh，然后用固體洗液稀釋液洗板5次，在吸水紙上輕輕拍干，加入發(fā)光底物A和B 各5〇μ?混勾5s，室溫避光放置5分鐘，用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)發(fā)光值。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，對(duì)讀取的發(fā)光值采取線性擬合方式進(jìn)行處理，可選對(duì)對(duì)數(shù) 和四參數(shù)兩種擬合方式計(jì)算樣本中胃蛋白酶原I的含量。
[0028] 本發(fā)明的胃蛋白酶原I (PG I )化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒可以檢測(cè)出血清中的胃 蛋白酶原I (PG I )含量。血清濃度PG可作為胃酸分泌的檢測(cè)指標(biāo)，在幽門螺桿菌陽性體 內(nèi)，PG I水平和PG I /PG II比值與胃酸分泌量顯著相關(guān)，其中后者與胃酸分泌量相關(guān)性更 強(qiáng)。在幽門螺桿菌陰性體內(nèi)，PG I的水平與胃酸分泌量顯著相關(guān)，但PG I /PG II比值與胃 酸分泌量無相關(guān)性。故通過血清PG濃度估計(jì)胃酸分泌量具有臨床實(shí)用價(jià)值。PG含量還與 良、惡性胃潰瘍的鑒別有關(guān)；血清PG I水平與萎縮性胃炎、消化性潰瘍呈正相關(guān)；在幽門螺 桿菌的治療中，通過監(jiān)測(cè)除菌后的PG變化能夠判定治療效果。它具有無創(chuàng)、檢測(cè)方法簡(jiǎn)單 快速、靈敏度高、檢測(cè)范圍寬等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)該胃蛋白酶原I (PG I )化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑 盒的各項(xiàng)指標(biāo)均已達(dá)到技術(shù)要求。
【附圖說明】
[0029] 圖1為實(shí)施例1所制備的試劑盒的校準(zhǔn)品線性圖。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 實(shí)施例1應(yīng)用碳酸鹽包被緩沖液制備本發(fā)明的胃蛋白酶原I化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè) 試劑盒 一、PBST固體洗液及稀釋液的配制： DPBST固體洗液配方為 KH2PO4 4.8g Na2HPO4* 12H20 28. 8g NaCl 155g Tween-20 IOmL ； 2)混合均勻后的PBST固體洗液在氣壓500Pa、溫度10°C、濕度30%狀態(tài)下減壓低溫干 燥，Ih后用鋁箔袋分裝，使用時(shí)每5g的PBST固體洗液溶解在500mL去離子水中混勻，制得 PBST固體洗液稀釋液。
[0031] 二、包被微孔板的制備： 1) 抗體的選擇：采用鼠源單克隆抗體； 2) 微孔板的包被：用0. 02mol/L的pH值為9. 6的碳酸鹽緩沖液將胃蛋白酶原I單克 隆抗體稀釋至濃度為5yg/mL