基于雙通道的多光譜熒光成像顯微系統(tǒng)和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及光學(xué)成像技術(shù)、生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別是一種基于雙通道的多光譜熒光 成像顯微系統(tǒng)和方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)，隨著生物醫(yī)學(xué)研宄的進(jìn)展，利用熒光壽命顯微成像的方法獲取生物光子 學(xué)信息的手段逐漸被采用。結(jié)合熒光強(qiáng)度成像，熒光壽命成像方法可用于細(xì)胞微環(huán)境檢測(cè)， 光譜重疊的熒光團(tuán)成像，具體可以完成熒光共振能力轉(zhuǎn)移、細(xì)胞內(nèi)物理化學(xué)環(huán)境例如氧離 子濃度、鈣離子、PH值的定量監(jiān)測(cè)等。
[0003] 目前，可對(duì)熒光壽命進(jìn)行探測(cè)的熒光顯微成像系統(tǒng)主要包括：?jiǎn)喂庾訜晒庥?jì)數(shù)熒 光顯微系統(tǒng)，門(mén)控?zé)晒怙@微成像系統(tǒng)，頻域熒光顯微成像系統(tǒng)；以上幾種熒光顯微系統(tǒng)都可 以同時(shí)獲取熒光強(qiáng)度成像和熒光壽命成像。
[0004] 現(xiàn)有的技術(shù)中，熒光顯微系統(tǒng)多是針對(duì)單一波長(zhǎng)的熒光團(tuán)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，或者是利用 光譜儀結(jié)合探測(cè)器對(duì)興趣波長(zhǎng)進(jìn)行成像融合；以上設(shè)備利用的方法在光學(xué)信息獲取是針對(duì) 動(dòng)態(tài)過(guò)程的單一波段，或者針對(duì)興趣波段逐一探測(cè)，例如活體細(xì)胞的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)、FRET過(guò)程 等，現(xiàn)有系統(tǒng)無(wú)法針對(duì)整個(gè)監(jiān)測(cè)過(guò)程的多個(gè)興趣波段進(jìn)行同時(shí)獲取并對(duì)圖像信息進(jìn)行融合 處理。從而，利用雙通道的探測(cè)器對(duì)多波長(zhǎng)的相同目標(biāo)活動(dòng)的檢測(cè)可以滿(mǎn)足動(dòng)態(tài)過(guò)程中的 熒光光譜信息，熒光強(qiáng)度信息，熒光壽命信息同時(shí)獲取的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種基于雙通道的多光譜熒光成像顯微系統(tǒng)和方法。本發(fā)明 實(shí)施例的基本思路是將利用分光鏡的分束的雙通道探測(cè)方法和門(mén)控?zé)晒鈮勖上耧@微方 法結(jié)合，實(shí)現(xiàn)基于雙通道的多光譜熒光成像顯微系統(tǒng)。
[0006] 該基于雙通道的多光譜焚光成像顯微系統(tǒng)，包括：光源模塊，光斑整形光路，焚光 激發(fā)收集光路，雙通道光路，雙ICCD、時(shí)序信號(hào)產(chǎn)生器和PC機(jī)，其特征在于：所述光源模塊， 用于激發(fā)熒光樣品，使樣品表面產(chǎn)生光致熒光信號(hào)；
[0007] 所述光斑整形光路包括光纖耦合輸出裝置、擴(kuò)束鏡，用于將自由空間輸出的激發(fā) 光經(jīng)光纖耦合輸出后，采用擴(kuò)束鏡進(jìn)行光斑擴(kuò)束，用于適應(yīng)激發(fā)樣品大小，實(shí)現(xiàn)寬場(chǎng)激發(fā)；
[0008] 所述熒光激發(fā)收集光路包括雙色鏡、反射鏡、物鏡，激發(fā)光經(jīng)由右側(cè)雙色鏡反射至 反射鏡表面，反射鏡位于雙色鏡左側(cè)，激發(fā)光反射至反射鏡上方的物鏡內(nèi)；物鏡將激發(fā)光會(huì) 聚到樣品表面完成熒光樣品激發(fā)，并收集樣品表面出射的熒光信號(hào)，雙色鏡用于分離激發(fā) 光束和熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)熒光樣品的激發(fā)和收集，對(duì)于激光全部反射，熒光信號(hào)全部透射；所 述反射鏡用于光路中激發(fā)光和熒光的光路角度調(diào)整，方向調(diào)整90度；
[0009] 所述雙通道光路，包括：分光棱鏡、透鏡L3、透鏡L4、濾光片F(xiàn)1、濾光片F(xiàn)2,其中所 述分光棱鏡，用于將焚光信號(hào)分成50 : 50的焚光強(qiáng)度信號(hào)，50%透射、50%反射實(shí)現(xiàn)雙通 道探測(cè)；所述透鏡L3、L4,用于調(diào)整熒光在探測(cè)器上成像的清晰度和大??；所述濾光片F(xiàn)1、 F2,用于選擇熒光信號(hào)中的興趣波段，實(shí)現(xiàn)興趣光譜成像；
[0010] 所述雙ICCD(增強(qiáng)型電荷耦合器件探測(cè)器）探測(cè)兩路興趣波段的時(shí)間分辨熒光強(qiáng) 度圖像；
[0011] 所述時(shí)序信號(hào)產(chǎn)生器輸出三路電學(xué)觸發(fā)信號(hào)，用于觸發(fā)短脈沖激光器、第一ICXD、 第二ICCD，完成時(shí)序電路控制；
[0012] 所述PC機(jī)同時(shí)連接時(shí)序信號(hào)產(chǎn)生器、雙1C⑶的圖像輸出端口，用于系統(tǒng)探測(cè)參數(shù) 的輸入、成像系統(tǒng)的控制以及熒光壽命圖像計(jì)算和融合處理。
[0013] 按照本發(fā)明的一方面，一種利用雙相機(jī)的多光譜熒光成像顯微系統(tǒng)，包括：
[0014] 光源模塊，紫光372nm、綠光440nm或者根據(jù)實(shí)際熒光樣品選定近紫外至可見(jiàn)光波 段皮秒半導(dǎo)體脈沖激光頭可選的）皮秒脈沖激光器，用于觀察樣品中熒光激發(fā)；
[0015] 激光器光斑整形光路，包括光纖親合輸出裝置，擴(kuò)束鏡。用于將自由空間輸出光光 纖耦合輸出后，利用擴(kuò)束鏡進(jìn)行光斑擴(kuò)束；
[0016] 雙色鏡，反射鏡，物鏡，激發(fā)光經(jīng)由右側(cè)雙色鏡反射至反射鏡表面，反射鏡位于雙 色鏡左側(cè)，激發(fā)光反射至反射鏡上方的物鏡內(nèi)，三者共同位于熒光激發(fā)收集光路上。脈沖激 光經(jīng)雙色鏡發(fā)射并經(jīng)過(guò)物鏡入射到觀測(cè)樣品表面，樣品受激發(fā)的熒光經(jīng)反射鏡并透過(guò)雙色 鏡至熒光探測(cè)光路。
[0017] 分束鏡，用于將樣品焚光分束成強(qiáng)度50/50的兩路信號(hào)；
[0018] 透鏡L3,透鏡L4,濾光片F(xiàn)1，濾光片F(xiàn)2,經(jīng)由分束鏡的焚光信號(hào)經(jīng)由親合透鏡，興 趣波段的濾光片濾除后耦合到ICCD探測(cè)器；
[0019] 雙ICCD(增強(qiáng)型電荷耦合器件探測(cè)器），用于探測(cè)兩路興趣波段的時(shí)間分辨熒光 強(qiáng)度圖像；
[0020] 時(shí)序信號(hào)產(chǎn)生器，用于輸出三路電學(xué)觸發(fā)信號(hào)，同步脈沖激光器、第一ICXD、第二 ICCD，完成時(shí)序電路控制；
[0021] PC機(jī)，同時(shí)連接時(shí)序信號(hào)產(chǎn)生器，兩路1C⑶的圖像輸出端口。用于輸入控制信號(hào) 產(chǎn)生器的參數(shù)和輸出控制參數(shù)，并通過(guò)相機(jī)圖像控制軟件實(shí)時(shí)顯示并存儲(chǔ)樣品熒光強(qiáng)度圖 像，在獲取全部時(shí)序控制參數(shù)和時(shí)間分辨熒光強(qiáng)度圖像后，利用熒光壽命算法處理并顯示 多種熒光圖像信息。
[0022] 系統(tǒng)中光學(xué)部件位置如系統(tǒng)光路圖圖2中所示，雙色鏡進(jìn)行不同波長(zhǎng)的激發(fā)光和 熒光信號(hào)的分離，分束鏡實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)分束后的雙通道探測(cè)。PC機(jī)通過(guò)以太網(wǎng)控制時(shí)序信 號(hào)輸入，時(shí)序產(chǎn)生器利用三路TTL信號(hào)（數(shù)字邏輯信號(hào)）觸發(fā)半導(dǎo)體激光器和ICCD探測(cè)器， 獲取圖像通過(guò)以太網(wǎng)線(xiàn)傳入PC機(jī)設(shè)備。
[0023] 系統(tǒng)中通過(guò)控制時(shí)序產(chǎn)生器的TTL信號(hào)的位置，調(diào)整激發(fā)光脈沖同探測(cè)門(mén)的位 置，實(shí)現(xiàn)時(shí)間分辨熒光強(qiáng)度信號(hào)的探測(cè)，延遲精度<l〇ps。
[0024] 按照本發(fā)明的另一方面，一種利用上述的基于雙通道的多光譜熒光成像顯微系統(tǒng) 成像的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：
[0025] 步驟1，PC機(jī)輸入成像系統(tǒng)控制參數(shù)，實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)探測(cè)參數(shù)初始化；
[0026] 步驟2,時(shí)序產(chǎn)生器接受到PC機(jī)設(shè)定TTL參數(shù)，驅(qū)動(dòng)激光器和ICXD探測(cè)器開(kāi)啟，激 發(fā)光傳播到樣品表面完成熒光激發(fā)，雙ICCD(增強(qiáng)型電荷耦合器件）探測(cè)器在延遲信號(hào)驅(qū) 動(dòng)下分別獲取多波長(zhǎng)熒光信號(hào)，完成光學(xué)信號(hào)探測(cè)過(guò)程；
[0027] 步驟3,PC機(jī)讀取多組延遲信息，時(shí)間分辨熒光強(qiáng)度圖像，獲取全部待處理的時(shí)間 和圖像彳目息；
[0028] 步驟4,熒光壽命處理軟件計(jì)算壽命圖像并進(jìn)行融合等操作，完成多光譜熒光信號(hào) 探測(cè)。
[0029] 本發(fā)明基于雙通道的多光譜熒光成像顯微系統(tǒng)，針對(duì)性獲取興趣波段的熒光強(qiáng)度 圖像和熒光壽命圖像，實(shí)現(xiàn)了多光譜的熒光顯微成像，突破了原有單一波段和重復(fù)獲取多 波長(zhǎng)的探測(cè)限制，極具科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0030] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以及結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì) 本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，其中：
[0031] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的雙通道多光譜熒光成像顯微系統(tǒng)的處理流程圖；
[0032] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的雙通道多光譜熒光成像顯微系統(tǒng)的系統(tǒng)光路圖。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0034] 圖1表示了本發(fā)明實(shí)施例提供的基于雙通道的多光譜熒光成像顯微方法的具體 實(shí)現(xiàn)流程，詳述如下：
[0035] 在步驟1中，選定觀察目標(biāo)為活體倉(cāng)鼠的口腔癌細(xì)胞，兩路的興趣熒光波段分別 為450nm、550nm，主要針對(duì)的兩種生物自體熒光團(tuán)為NADH(還原型煙酰