一種用毛細(xì)管電泳快速檢測(cè)生物樣本中兒茶酚氧甲基轉(zhuǎn)移酶comt活性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 一種用毛細(xì)管電泳快速檢測(cè)生物樣本中兒茶酚氧甲基轉(zhuǎn)移酶COMT活性的方法， 屬于毛細(xì)管電泳檢測(cè)及兒茶酚氧甲基轉(zhuǎn)移酶檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶（COMT)廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)及機(jī)體組織內(nèi)，是兒茶酚胺類 神經(jīng)遞質(zhì)的主要代謝酶之一。COMT是腦內(nèi)前額葉皮層多巴胺水平的主要調(diào)節(jié)器，已有文獻(xiàn) 報(bào)道抑郁與腦內(nèi)多巴胺功能失調(diào)有關(guān)。而評(píng)價(jià)腦內(nèi)多巴胺功能狀況的方法之一是測(cè)定COMT 的活性濃度。
[0003] 隨著社會(huì)的高速發(fā)展，工作、生活及精神壓力的增加，抑郁癥的發(fā)病率逐年上升。 據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)每45000萬精神疾病的患者中有15000萬是抑郁癥患者。抑郁癥給患 者、家人帶來極大的痛苦。因此，研究抑郁癥的發(fā)病機(jī)制及藥物的作用靶點(diǎn)對(duì)抑郁癥的防治 極為重要。
[0004] 國內(nèi)外神經(jīng)科學(xué)研究者相繼進(jìn)行了一些關(guān)于抑郁癥患者紅細(xì)胞COMT活性濃度的 檢測(cè)研究。文獻(xiàn)報(bào)道的COMT的活性測(cè)定方法有放射性檢測(cè)法，但其對(duì)環(huán)境存在污染；而熒 光法測(cè)定必須進(jìn)行衍生化，操作復(fù)雜；電化學(xué)法檢測(cè)法需特殊的檢測(cè)器。我們以3, 4-二羥 基苯甲酸為底物，建立了毛細(xì)管電泳快速檢測(cè)COMT活性的分析方法，該方法簡便快速，未 見文獻(xiàn)報(bào)道。
[0005] 文獻(xiàn)報(bào)道慢性應(yīng)激誘導(dǎo)氧化性損傷可導(dǎo)致抑郁、焦慮等精神性紊亂疾病。使用慢 性應(yīng)激法使動(dòng)物每天處于無法預(yù)期的壓力環(huán)境中使其出現(xiàn)抑郁癥狀可以成功建立抑郁癥 模型。PQQ(化學(xué)名稱為4, 5-二氫-4, 5-二氧化-1-氫吡咯（2, 3f)醌-2, 7, 9 一三羧酸)， 它具有很強(qiáng)的自由基清除作用，并具有提高認(rèn)知功能等作用，它在神經(jīng)精神疾病方面具有 較重要的研究前景。PQQ對(duì)于氧化性損傷誘發(fā)的抑郁癥是否具有修復(fù)作用，能否作為新的治 療靶點(diǎn)對(duì)抑郁癥的發(fā)病機(jī)制和治療是值得深入研究的。
[0006] 本發(fā)明用所建立的毛細(xì)管電泳方法研究PQQ對(duì)慢性應(yīng)激誘導(dǎo)氧化性損傷所致抑 郁模型鼠腦內(nèi)COMT活性的變化，未見文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種用毛細(xì)管電泳快速檢測(cè)生物樣本中兒茶酚氧甲基轉(zhuǎn)移 酶COMT活性的方法。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案：一種用毛細(xì)管電泳快速檢測(cè)生物樣本中兒茶酚氧甲基轉(zhuǎn)移酶 COMT活性的方法，步驟為： (1)毛細(xì)管選擇及預(yù)處理： 選用未涂層石英毛細(xì)管柱（45cmX50Mffl，河北永年縣銳灃色譜器件有限公司），新毛 細(xì)管柱先依次用甲醇沖洗l〇min，蒸餾水沖洗5min，IMNaOH溶液沖洗30min，蒸餾水沖洗 5min,最后再用運(yùn)行緩沖液沖洗15min;進(jìn)樣前依次用蒸饋水及運(yùn)行緩沖液各沖洗2min; 運(yùn)行緩沖液為：200mmol/LPBS體積百分60%+75mmol/L硼酸體積百分40%的緩沖體 系，PH=IO，含緩沖體系體積百分0. 05%三氟乙酸； (2)毛細(xì)管電泳分析條件： 檢測(cè)波長是350nm，進(jìn)樣方式為壓力進(jìn)樣（0. 5psi，10. 0s)，分離電壓為25kv,毛細(xì)管 柱溫25°C，運(yùn)行緩沖溶液為：60% 200mMPBS+40% 75mM硼酸（pH10. 0)含0. 05%的三氟乙 酸。緩沖液及樣品溶液均用〇. 22Mm微孔針頭過濾器過濾。
[0009] 測(cè)定原理 在Mg2+(MgCl2)和SAM(S-腺苷甲硫氨酸）的存在下，COMT催化底物3, 4-二羥基苯甲 酸，生成產(chǎn)物4-羥基-3-甲氧基苯甲酸，以3, 4-二羥基苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品外標(biāo)法測(cè)定組織液中 剩余3, 4-二羥基苯甲酸的濃度，COMT酶活以測(cè)定單位時(shí)間內(nèi)每毫克蛋白轉(zhuǎn)化生成的產(chǎn)物 量表示。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用毛細(xì)管電泳快速檢測(cè)生物樣本中兒茶酚氧甲基轉(zhuǎn)移酶COMT活性的方法，其 特征在于步驟為： (1) 毛細(xì)管選擇及預(yù)處理： 選用未涂層的45cmX50Mffl石英毛細(xì)管柱；新毛細(xì)管柱先依次用甲醇沖洗lOmin，蒸餾 水沖洗5min，IM NaOH溶液沖洗30min，蒸饋水沖洗5min，最后再用運(yùn)行緩沖液沖洗15min ; 進(jìn)樣前依次用蒸餾水及運(yùn)行緩沖液各沖洗2min ; 運(yùn)行緩沖液為：200mmol/L PBS體積百分60%+75 mmol/L硼酸體積百分40%的緩沖體 系，PH=IO，含緩沖體系體積百分0. 05%三氟乙酸； (2) 毛細(xì)管電泳分析條件： 檢測(cè)波長為350nm，進(jìn)樣方式為0. 5psi壓力進(jìn)樣，進(jìn)樣時(shí)間10.0 s,分離電壓為25kV，毛 細(xì)管柱溫25°C ; (3) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立： 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精密稱取對(duì)照品3,4-二羥基苯甲酸0.0058，溶于51^501111?85緩沖 液配成lmg/mL的儲(chǔ)備液，用該緩沖液稀釋成25、50、100、150、200μ g/mL的3, 4-二羥基苯 甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，每個(gè)樣品重復(fù)3次，以峰面積對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸，結(jié)果在25-200 μ g/ mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=166111x+11747,相關(guān)系數(shù)r2=0. 9951，在25~ 200μ8/ιΛ濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，最低檢出濃度為0.02~0. 5μΜ，S/N彡3 ; (4) 腦組織COMT酶活性測(cè)定 (4. 1)樣品的制備： 腦組織處理： 腦組織精密稱重，加入組織裂解液，腦組織重量：組織裂解液=lg:7.5mL，勻漿， 4°C HOOOg離心15min，取上清液A ;上清液A再HOOOg離心15min，取二次離心后上清液 B，上清液B于-80°C冰箱保留；組織裂解液為含0. 6M高氯酸PCA和0. 5mM EDTA二鈉，即 16. 6mL PCA和0. 092g EDTA二鈉溶于500mL水配制而成； 測(cè)試前先低溫解凍上清液B，再加入等體積的含I. 2M K2HPOjP 2mM EDTA二鈉的溶液， 稱為PCA沉淀劑，用于沉淀反應(yīng)剩余的PCA，冰浴中放置IOmin后4°C HOOOg離心15min，取 上清液C，即COMT酶液；之后進(jìn)行酶反應(yīng)體系孵育； (4. 2)酶反應(yīng)體系制備： 2mM 氯化鎂 100 μ L +0· 2mM SAM 100 μ L+0. 2mM 3, 4-二羥基苯甲酸 150 μ L+ 最后離心 出來的上清液C 150 μ L，反應(yīng)體系總體積為500 μ L，漩渦振蕩后于37°C孵育60min ;之后加 入80 μ L冰冷2M PCA終止反應(yīng)，16000g離心15min為上清液D，取上清液D為待測(cè)物； 按步驟（1)所述毛細(xì)管電泳分析條件進(jìn)樣，所得峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算得 到反應(yīng)剩余3, 4-二羥基苯甲酸的濃度，計(jì)算單位時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)化為3-羥基4-甲氧基-苯甲酸， 即為COMT活性：
<1000, μ M/g. min, Ctl為3, 4-二羥基苯甲酸起始濃度，C為反應(yīng)剩余3, 4-二羥基苯甲酸濃度，t min為反應(yīng) 孵育時(shí)間min, G為腦組織重量g。
【專利摘要】一種用毛細(xì)管電泳快速檢測(cè)生物樣本中兒茶酚氧甲基轉(zhuǎn)移酶COMT活性的方法，屬于毛細(xì)管電泳檢測(cè)技術(shù)及兒茶酚氧甲基轉(zhuǎn)移酶檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明所建立的方法分析慢性應(yīng)激誘導(dǎo)氧化性損傷抑郁癥大鼠以及葉酸和不同劑量PQQ腹腔注射后腦組織COMT活性的變化，未見文獻(xiàn)報(bào)道，為抑郁癥的發(fā)病機(jī)制和藥物作用靶點(diǎn)提供新的依據(jù)。本發(fā)明所采用的毛細(xì)管電泳法分析速度更高，分離度更好，能快速檢測(cè)腦組織中COMT活性濃度，與以往檢測(cè)COMT的方法相比具有明顯優(yōu)勢(shì)，不需要衍生化，與文獻(xiàn)方法相比，本方法具有更好的可靠性和選擇性，而且具有靈敏度高、分析速度快等特點(diǎn)。
【IPC分類】G01N27-447
【公開號(hào)】CN104655705
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510073846
【發(fā)明人】周杏琴, 毛師師, 欽曉峰
【申請(qǐng)人】江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所
【公開日】2015年5月27日
【申請(qǐng)日】2015年2月12日