作為表皮成熟標記的表面各向同性的制作方法
【專利說明】作為表皮成熟標記的表面各向同性
[0001] 皮膚是人體最大的器官，它有多種功能。最重要的功能是保護身體免受外界的影 響。
[0002] 皮膚的表面不是光滑的，而其特征在于反映皮膚三維組織結(jié)構(gòu)的特殊紋理 (relief)。這種紋理由于環(huán)境和生理兩種因素而經(jīng)受變化。在這些因素中，通過藥物和化 妝品的外用治療當然是非常重要的。
[0003] 皮膚的機械特性在許多的化妝品和臨床意義中是很重要的考量。例如，皮膚機械 特性的知識能夠有助于量化化妝產(chǎn)品如霜或者洗劑（lotion)的效力，還有助于研宄皮膚 老化。最后，因皮膚疾病在皮膚的機械性質(zhì)上的變化會對這些疾病的更好了解和治療起到 作用。
[0004] 尤其是通過防止體液損耗和不良物質(zhì)的滲透保護身體的皮膚屏障功能，其主要是 通過表層（top layer)實現(xiàn)的。該層，又叫作角質(zhì)層，由角質(zhì)細胞（由蛋白質(zhì)和脂質(zhì)構(gòu)成） 組成，該角質(zhì)細胞嵌入在由膽固醇、神經(jīng)酰胺和脂肪酸組成的富含脂質(zhì)的基質(zhì)中。當接觸 環(huán)境時另一類脂質(zhì)也分泌在表皮的表面，該脂質(zhì)與水相互作用形成對維持皮膚的水分含量 (moisture content)和感覺屬性重要的親水膜。該親水膜的脂質(zhì)部分也能夠滲透進表皮的 上層，與表皮的屏障結(jié)合，并還有助于其功能。當設(shè)計化妝品時這是要考慮的相當重要的因 素，因為就是角質(zhì)層與像霜和洗劑的化妝品界面結(jié)合。
[0005] 在過去的十年間，關(guān)于新生兒皮膚生理學（newborn skin physiology)的知識已 經(jīng)逐步發(fā)展?，F(xiàn)在清楚的是，出生后的生活是積極的功能成熟和皮膚對干燥的子宮外環(huán)境 適應(yīng)的一段時期。不同的環(huán)境因素（例如，干冷氣候、尿布和化妝品護理程序）影響尤其是 在早產(chǎn)兒中的皮膚功能參數(shù)如角質(zhì)層水合作用和滲透屏障的出生后發(fā)育。
[0006] 本發(fā)明人已經(jīng)顯示在先前的研宄（Fluhr等，Br J Dermatol，166(3) :483-90, 2012)中表明角質(zhì)層的濕度和水分含量低于出生時（嬰兒1-15 天），而天然保濕因子（NMF)的比率最高。該比率隨后在水合作用穩(wěn)定時降低。作者假設(shè)皮 膚減少的酸化作用和更低的水合作用能夠激活補償調(diào)節(jié)機制（包括NMF的顯著生成），這使 得新生兒能適應(yīng)他的新環(huán)境。
[0007] 為了獲得對屏障功能的全面評估，就不得不依賴參數(shù)如NMF，這要求大量的技術(shù)。 特別地，測量NMF用的設(shè)備成本會妨礙多數(shù)的生物實驗室提供那種給付。
[0008] 因此仍然需要開發(fā)新的工具用于評估皮膚的屏障功能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明人已經(jīng)表明皮膚的成熟水平和隨此水平的屏障組織結(jié)構(gòu)/功能，能夠通過 評價皮膚表面的各向同性/各向異性而輕易確定。在這方面，發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了一種新的、 半定量的評分系統(tǒng)，其能夠可靠且可重現(xiàn)地評估皮膚表面的各向同性。
[0010] 為闡明在新生兒中的主要皮膚生理功能，進行了兩個臨床研宄。這些研宄旨在無 創(chuàng)地研宄皮膚表面成熟，其是通過與不同的兒童年齡組和成人的皮膚比較來表征嬰兒的皮 膚而進行的。
[0011] 因此本發(fā)明涉及用于確定受試者皮膚表面的成熟度的方法。特別地，本發(fā)明人已 經(jīng)觀察到皮膚表面的成熟度與所述皮膚表面漸增的各向同性密切相關(guān)，正如通過檢測反映 細胞組織結(jié)構(gòu)的各種參數(shù)所評價的。
[0012] 因此本發(fā)明的方法能夠從出生時表征皮膚表面并能夠監(jiān)測其隨時間的演變。"兒 童"根據(jù)本發(fā)明指年齡小于16歲的個體。尤其是，1-15天的初生兒（neonates)、5/6周的 嬰兒、6個月± 1個月的嬰兒及1-2歲的嬰兒根據(jù)本發(fā)明包括在兒童分類內(nèi)。如在本文使用 的"初生兒"可以是足月出生的也可以是早產(chǎn)的。為避免歧義，在本申請中使用的術(shù)語"兒 童"沒有進一步的解釋時必須在其最廣泛的意義上理解，即指16歲以下的人。"成人"在本 發(fā)明的含義內(nèi)指不是兒童的人，也就是超過16歲的人。
[0013] 優(yōu)選地，可以使用本發(fā)明的方法而不考慮皮膚種族或地理，或其光類型 (phototype)。其可以是高加索、非洲、亞洲、南美、美拉尼西亞或任何其他來源的；其可具有 光類型I、II、III、IV、V或VI，并不因此而影響本發(fā)明。本發(fā)明的方法的確旨在確定皮膚表 面成熟，其不考慮皮膚類型，而只取決于供體年齡。
[0014] 因此本發(fā)明涉及用于確定受試者皮膚表面的成熟度的方法，所述方法包括評估所 述皮膚表面的各向同性的步驟。
[0015] 就"各向異性"而言，其在本文涉及依賴方向上的性質(zhì)，而如在本文中使用的"各向 同性"意味著在所有方向上完全相同的性質(zhì)?？梢岳斫獾氖牵飨蛲院透飨虍愋允窍喾?的，即當各向同性增加時，各向異性減少，反之當各向異性增加時，各向同性減少。
[0016] 皮膚是高度非線性的，各向異性的，粘彈性的，且?guī)缀醪豢蓧嚎s的材料。它的性質(zhì) 隨著年齡、地點和人的不同而改變。這導致了難以獲取皮膚機械性質(zhì)的定量描述。第二個 問題是用到的大量的各式儀器、單位和測量條件使得難以比較結(jié)果。
[0017] 本發(fā)明人已經(jīng)找到一種繞過這些不便的新途徑。他們已經(jīng)觀察到通過檢測皮膚表 面的細胞組織結(jié)構(gòu)能夠評估各向同性。根據(jù)該實施方案，通過評估細胞參數(shù)如細胞密度、細 胞團、粘附性/細胞形狀及單個細胞的可辯性（differentiability)評估所述皮膚表面的 各向同性。
[0018] 本發(fā)明人已經(jīng)設(shè)計了新的評分系統(tǒng)，EMI (Electron Microscopy Isotropy，電子 顯微鏡法各向同性）評分系統(tǒng)，其使得表面各向同性能夠被半定量分析。
[0019] 所述評分系統(tǒng)包括使用基于細胞密度、細胞團、粘附性/細胞形狀及單個細胞的 可辯性四個參數(shù)的適當?shù)臄?shù)值范圍。這些標準每一個在0-3的數(shù)值范圍上進行評分，其中 〇表明細胞是分離的，或者細胞團是完全不規(guī)則的，或者細胞形狀非對稱且完全不規(guī)則，或 者細胞不可辯，而分值3表明細胞是融合的，或者細胞團是規(guī)則的，或者細胞形狀規(guī)則且對 稱，或者細胞極易可辨。
[0020] 分值0-4表明各向異性，而分值5-7表明中等的各向同性，以及分值8-12表明良 好的各向同性。
[0021] 因此將皮膚的成熟度與EMI分值聯(lián)系起來是可能的。分值0-4表明不成熟的皮膚 表面，分值5-7表明皮膚表面的中等成熟，且分值8-12表明完全成熟的皮膚表面。
[0022] 在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明人能夠區(qū)分與兒童年齡相關(guān)的三類皮膚表面成熟：
[0023] -不成熟：0至5/6周；
[0024] -中等的成熟：多5/6周至1-2歲；以及
[0025] _成熟：多1-2歲。
[0026] 因此在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及確定受試者的皮膚表面于其組織結(jié)構(gòu)/功 能是成熟還是不成熟的方法，所述方法包括步驟：
[0027] a)取得所述受試者的皮膚樣本㈧；
[0028] b)將所述皮膚樣本評分至適當?shù)臄?shù)值范圍，其中所述適當?shù)臄?shù)值范圍基于細胞密 度、細胞團、粘附性/細胞形狀及單個細胞的可辯性四個參數(shù)。
[0029] 優(yōu)選地，所述數(shù)值范圍是0-12的數(shù)值范圍，其中分值0表明強烈的各向異性且分 值12表明良好的各向同性。
[0030] 所述皮膚表面樣本的EMI分值通過從先前實驗結(jié)果的匯編獲得的參考而確定。的 確，如本發(fā)明人所示，顯然EMI分值隨著年齡而增加。例如，4或小于4的EMI分值與不成熟 的皮膚表面有關(guān)，而分值8或大于8則與成熟的皮膚表面有關(guān)。
[0031] 可替代地，將本發(fā)明的皮膚表面樣本的EMI分值與來自參考受試者（reference subject)的皮膚表面樣本的EMI分值相比較是可能的。就"參考受試者"而言，在本文表示 年齡已知的受試者。優(yōu)選地，參考受試者是1-15天的新生兒，5/6周的嬰兒，6個月±1個 月的嬰兒，1-2歲的嬰兒或者超過16歲的成人。
[0032] 使用為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種皮膚成像方法能夠確定EMI分值的各種參數(shù)。 這樣的方法包括，尤其是使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠觀察且區(qū)分角質(zhì)層的細胞的所有技術(shù)。例 如，技術(shù)人員可以使用任意在實驗室中常用的顯微鏡技術(shù)。這些技術(shù)包括，例如，光學顯微 鏡法如傳統(tǒng)的光學顯微鏡法、熒光顯微鏡法、共焦/多光子顯微鏡法及受激發(fā)射損耗；掃描 探針顯微鏡法，包括掃描隧道顯微鏡法（STM)、原子力顯微鏡法（AFM)、近場掃描光學顯微 鏡法及其他；以及電子顯微鏡法。適于本發(fā)明方法的電子顯微鏡技術(shù)包括像透射電子顯微 鏡法（TEM)、掃描透射電子顯微鏡法（STEM)、聚焦離子束顯微鏡法（FIB)以及掃描電子顯微 鏡法（SEM)這樣的技術(shù)。優(yōu)選地，使用電子顯微鏡技術(shù)確定Emi分值參數(shù)。
[0033] 掃描電子顯微鏡法（SEM)呈現(xiàn)了非常精確的方法，該方法用于直接分析最外面的 皮膚層尤其是角質(zhì)層的微結(jié)構(gòu)。隨著分辨率和可能從X 100直到X 100000的放大率，其能 夠獲得皮膚表面形貌和超微結(jié)構(gòu)的高質(zhì)量三維圖片。更優(yōu)選地，所述參數(shù)通過執(zhí)行掃描電 子顯微鏡法來確定。根據(jù)該實施方案，使用SEM獲取的皮膚樣本的圖像并由此對其進行檢 測從而確定EMI分值的各種參數(shù)。
[0034] 因此，根據(jù)該實施方案，本發(fā)明涉及確定受試者的皮膚表面于其組織結(jié)構(gòu)/功能 是成熟還是不成熟的方法，所述方法包括步驟：
[0035] a)取得所述受試者的皮膚樣本（A);
[0036] b)通過掃描電子顯微鏡法獲取所述皮膚樣本的圖像，以及
[0037] c)將所述皮膚樣本評分至適當?shù)臄?shù)值范圍，其中所述適當?shù)臄?shù)值范圍基于細胞密 度、細胞團、粘附性/細胞形狀及單個細胞的可辯性四個參數(shù)。
[0038] "皮膚樣本"根據(jù)本發(fā)明包括含有皮膚細胞的任何樣本。有利地，所述皮膚樣本通 過從皮膚的表面剝離所述表面而獲取。有助于這個目的的各種設(shè)備在市場上可買到，比如， 例如D-SQUAME li 皮膚取樣 Disc