快速測定蛋白混合物中的各組分含量的毛細管等電聚焦方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種快速測定蛋白混合物中的各組分含量的方法，特別是涉及一種快 速測定蛋白混合物中的各組分含量的毛細管等電聚焦方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 單克隆抗體藥物在治療腫瘤和自體免疫疾病等領(lǐng)域都具有顯著的優(yōu)勢，但對于靶 點較為復(fù)雜的疾病，如感染性疾病或涉及體內(nèi)多個靶點的疾病則有一定的局限性。
[0003] 復(fù)合抗體藥物（antibodymixtureorantibodycocktail)是一類由兩種或多種 單克隆抗體組成的藥物，它由一系列確定的、充分表征的單克隆復(fù)合抗體藥物組成，這些單 克隆抗體在序列、靶點和結(jié)合活性上都具有充分的多樣性，能夠模擬人體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的 一系列抗體，因而在治療復(fù)雜靶點疾病上具有明顯的優(yōu)勢。由于其組成上的復(fù)雜性，復(fù)合抗 體藥物的生產(chǎn)工藝開發(fā)和質(zhì)量控制均有較大的挑戰(zhàn)。
[0004] 在復(fù)合抗體藥物的質(zhì)量控制中，各單克隆抗體組分的含量是保證產(chǎn)品的藥效、 安全性和批間重復(fù)性的重要指標(biāo)。由于各單克隆抗體通常具有較高比例的同源序列，其 分子量、分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)非常接近，常用的多數(shù)分析方法如體積排阻色譜、毛細管凝 膠電泳等方法均無法區(qū)分這些不同的單克隆抗體組分，因而不適用于復(fù)合抗體藥物的組 成和含量分析這一目的。等電點是單克隆抗體的固有性質(zhì)之一，不同的單克隆抗體由 于氨基酸組成、序列和空間結(jié)構(gòu)不同，等電點通常具有明顯的差異，因而可以利用不同單 克隆抗體的等電點差異對其進行分離和定量。Symphogen公司采用陽離子交換色譜法 (F.Wiberg,S.Rasmussenetal.Productionoftarget-specificrecombinanthuman polyclonalantibodiesinmammaliancells.BiotechnologyandBioengineering. Vol. 94,No. 2, 2006 ；T.Frandsen,H.Naestedetal.Consistentmanufacturingand qualitycontrolofahighlycomplexrecombinantpolyclonalantibodyproduct forhumantherapeuticuse.BiotechnologyandBioengineering.Vol. 108,No. 9, 2011) 和液質(zhì)聯(lián)用法（P.Persson，A.Engstr6metal.Techniquesfortheidentificationand determinationofcompositionalvariabilityinrecombinantpolyclonalantibody products.AnalyticalChemistry，Vol. 82,No. 17, 2010)對幾種復(fù)合抗體藥物中的各組分 含量進行了測定。陽離子交換色譜法利用不同等電點的抗體在特定pH值下所帶正電荷數(shù) 的不同對其進行分離和定量，能夠反映不同樣品中各組分含量的一致性，但分析時間較長， 且樣品中組分較多時可能出現(xiàn)兩種組分無法分離的情況。液質(zhì)聯(lián)用法通過檢測各單克隆抗 體的輕鏈含量來反映各單克隆抗體組分的含量，其專屬性較強，但樣品需經(jīng)還原、輕重鏈分 離等處理后才能上樣分析，步驟較為繁瑣，且質(zhì)譜分析的成本較高。因此，開發(fā)新的復(fù)合抗 體藥物組成分析方法是非常必要的。
[0005] 毛細管等電聚焦是近年來基于平板等電聚焦和毛細管電泳技術(shù)發(fā)展而來的分析 方法，它利用毛細管中灌注的一系列不同等電點的兩性電解質(zhì)混合物在電場下形成的PH 梯度，根據(jù)蛋白質(zhì)或其他待分析物等電點的差異對其進行分離，其分離精度可達到0. 1個PH單位，并克服了平板等電聚焦操作復(fù)雜、無法實現(xiàn)自動化、無法準確測定電荷異質(zhì)體含 量等缺點，因而被廣泛應(yīng)用于單克隆抗體產(chǎn)品的等電點測定和電荷異質(zhì)體含量分析。與離 子交換色譜相比，毛細管等電聚焦具有分析時間短、樣品消耗量小、通用性強等優(yōu)勢，其單 個樣品分析時間通常是離子交換色譜的1/4,單次測試樣品消耗量通常是離子交換色譜的 1/10左右，且對一些電荷異質(zhì)性較為復(fù)雜的樣品如融合蛋白樣品具有更好的分離效果。
[0006] 盡管毛細管等電聚焦已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于單克隆抗體的質(zhì)量分析，但其應(yīng)用于復(fù)合 抗體藥物的組成和含量分析還未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種快速測定蛋白混合物中的各組分含量的毛 細管等電聚焦方法。該方法具有通用性強、分析周期短、數(shù)據(jù)處理簡單等優(yōu)點，而且適用于 蛋白混合物(包括：復(fù)合抗體藥物）的生產(chǎn)工藝開發(fā)和質(zhì)量控制。
[0008] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的測定(快速測定）蛋白混合物中的各組分含量的毛 細管等電聚焦方法，包括步驟：
[0009] 1)將兩性載體、添加劑、等電點標(biāo)記物與待分析的蛋白混合物樣品進行混合，形成 混合液；
[0010] 其中，添加劑包括：甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、尿素、甘油、蔗糖中的一種或 多種；
[0011] 2)將步驟1)的混合液上樣于毛細管柱，在10~40°C、0. 1~lkV/cm下聚焦2~ 15min，并通過毛細管等電聚焦儀或毛細管電泳儀檢測，得到等電聚焦譜圖；
[0012] 3)將步驟2)的等電聚焦譜圖與待分析的蛋白混合物樣品中的單蛋白組分(各組 分）等電聚焦譜圖進行比對，確定步驟2)的等電聚焦譜圖中不同等電點范圍對應(yīng)的單蛋白 組分；
[0013] 4)根據(jù)步驟3)的比對結(jié)果和步驟2)的等電聚焦譜圖信息，確定待分析的蛋白混 合物樣品中的各組分含量。
[0014] 所述步驟 1)中，兩性載體包括：Pharmalyte2. 5-5、Pharmalyte3_10、 Pharmalyte4_6. 5、Pharmalyte4. 2-4.9、Pharmalyte4. 5 - 5. 4、Pharmalyte5_6、 Pharmalyte5_8、Pharmalyte6. 7-7. 7、Pharmalyte8_10. 5、Servalyt2_4、Servalyt2_9、 Servalyt2_ll、Servalyt3_4、Servalyt3_5、Servalyt3_6、Servalyt3_7、Servalyt3_10、 Servalyt4_5、Servalyt4_6、Servalyt4_7、Servalyt4_9、Servalyt5_6、Servalyt5_7、 Servalyt5_8、Servalyt5_9、Servalyt6_7、Servalyt6_8、Servalyt6_9、Servalyt7_9、 Servalyt9_ll中的一種或多種；兩性載體在混合液中的體積范圍為1%~10% ;
[0015] 添加劑的濃度范圍或用量范圍分別為：甲基纖維素或羥丙基甲基纖維素在混合液 中的體積濃度為0~50%，尿素在混合液中的濃度為0~8M(即0 <濃度< 8mol/L)，甘油 在混合液中的體積濃度為0~50%，蔗糖在混合液中的濃度為0~50g/100ml;例如，甲基纖 維素或羥丙基甲基纖維素在混合液中的體積濃度a可為0 < 50%，尿素在混合液中的濃 度b可為0 <b^8M，甘油在混合液中的體積濃度c為0 <c<50%，蔗糖在混合液中的濃 度d為0 <d<50g/100ml。
[0016] 等電點標(biāo)記物，包括：ProteinSimple公司提供的小分子等電點標(biāo)記物、Beckman 公司提供的小分子等電點標(biāo)記物或蛋白等電點標(biāo)記物；
[0017] 其中，ProteinSimple公司提供的小分子等電點標(biāo)記物(小分子標(biāo)記物系列)包括： pI2. 85、pI3. 21、pI3. 59、pI4. 22、pI4. 65、pI5. 12、pI5. 85、pI6. 14、pI6. 61、pI7. 05、pI7. 40、 pI7.55、pI7.65、pI7.90、pI8.18、pI8.40、pI8.79、pI9. 22、pI9. 46、pI9. 50、pI9. 77、pI10. 10 或pI10.45 ;
[0018] Beckman公司提供的小分子等電點標(biāo)記物(小分子標(biāo)記物系列）包括：pI4. 1、 pI5. 5、pI7. 0、pI9. 5 或pI10. 0 ;
[0019] 蛋白等電點標(biāo)記物包括：pI2. 80的胃蛋白酶原（pepsinogen)，pI3. 50的淀粉葡 萄糖苷酶（amylglucosidase)，pI4. 25 的葡萄糖氧化酶（glucoseoxidase)，pI4. 55 的胰 蛋白酶抑制劑（trypsininhibitor)，pI5. 20 的beta-乳球蛋白A(beta-lactoglobulin A)，pI5.85 的牛碳酸酉干酶B[CarbonicanhydraseB(bovine)]，pI6.55 的人碳酸酉干酶 B[carbonicanhydraseB(human) ]，pI7. 35 的肌紅蛋白（myoglobin)，pI8. 15、pI8. 45 和 pI8. 65 的扁豆凝集素（lentillectin)，pI9. 30 的胰蛋白酶原（trypsinogen)，pI9. 45 的核 糖核酸酶A(ribonucleaseA)或pI10. 25 的細胞色素c(cytochromec);
[0020] 混合液中通常包含兩種等電點標(biāo)記物，其中，一種等電點標(biāo)記物的等電點高于所 有待分析蛋白，另一種等電點標(biāo)記物的等電點低于所有待分析蛋白。單個小分子等電點標(biāo) 記物在混合液中的體積范圍為0. 5%~2%，單個蛋白等電點標(biāo)記物在混合液中的濃度范圍 為 0? 01 ~0? 5mg/mL;
[0021] 待分析的蛋白混合物樣品包括：復(fù)合抗體藥物或多種蛋白的混合物；其中，待分 析的蛋白混合物樣品在混合液中的濃度范圍為0.