評(píng)價(jià)化學(xué)實(shí)體與其靶標(biāo)分子之間的相互作用的全基因組方法
【專利說(shuō)明】評(píng)價(jià)化學(xué)實(shí)體與其靶標(biāo)分子之間的相互作用的全基因組方 法
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)
[0002] 本申請(qǐng)要求2012年6月14日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)N〇.61/659,750和2012年 7月6日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)N 〇.61/668,718和2012年9月14日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng) No. 61/701,434和2013年3月15日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No. 61/800,060的利益。
[0003] 將以上申請(qǐng)的完整教導(dǎo)按引用并入本文中。
[0004] 政府支持
[0005] 本發(fā)明是用來(lái)自國(guó)家衛(wèi)生研宄院（National Institutes of Health)的 R01-HG002688和來(lái)自美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)的PF-11-042-01-DMC下的政府支持進(jìn)行的。政府在本 發(fā)明中具有一定的權(quán)利。
[0006] 發(fā)明背景
[0007] 最近的技術(shù)發(fā)展已經(jīng)允許通過(guò)將蛋白質(zhì)定位于特定的DNA區(qū)域或相關(guān)染色質(zhì)的 基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的全基因組（genome -wide)研究。與目標(biāo)蛋白質(zhì)相關(guān)的DNA的株度測(cè)序，使 用定向抗體的下拉（pulled-down)，提供了基因組組織的高分辨率空間圖譜。所稱的具有 深度測(cè)序的染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP-seq)，生物學(xué)家現(xiàn)在具有新的透鏡，他們可以通過(guò)其了 解細(xì)胞和疾病生物學(xué)。然而，對(duì)于這個(gè)技術(shù)存在重大的限制。該程序需要驗(yàn)證的、特定的免 疫球蛋白的存在，并且僅單個(gè)蛋白質(zhì)/DNA復(fù)合物可以分離。這種實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性限制了使用 ChIP-seq來(lái)了解和表征染色質(zhì)定向的小分子的作用。
[0008] 發(fā)明概述
[0009] 本文中描述的是化學(xué)實(shí)體與其靶標(biāo)分子之間的相互作用的全基因組評(píng)價(jià)，稱為 Chem-seq 技術(shù)。
[0010] 因此，在一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及對(duì)藥物或藥物候選物與基因組相關(guān)的一個(gè)或多 個(gè)因子的相互作用進(jìn)行基因組范圍的作圖的方法。所述方法包括將包含染色質(zhì)的細(xì)胞、細(xì) 胞裂解物或核提取物與藥物接觸。將所述包含染色質(zhì)的細(xì)胞、細(xì)胞裂解物或核提取物維持 在所述藥物或藥物候選物可以與基因組相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)因子相互作用的條件下。將所述 包含染色質(zhì)的細(xì)胞、細(xì)胞裂解物或核提取物的基因組片段化，由此產(chǎn)生包含基因組片段的 混合物，其中一個(gè)或多個(gè)基因組片段與一個(gè)或多個(gè)與藥物相互作用的因子相關(guān)。測(cè)定與藥 物或藥物候選物與其相互作用的一個(gè)或多個(gè)因子相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)基因組片段的全部或 部分的序列，由此對(duì)藥物或藥物候選物與基因組相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)因子的相互作用進(jìn)行基 因組范圍的作圖。
[0011] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及鑒別基因組上藥物或藥物候選物與其相互作用的一 個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)的方法。所述方法包括將包含染色質(zhì)的細(xì)胞、細(xì)胞裂解物或核提取物接觸藥 物或藥物候選物，并將所述包含染色質(zhì)的細(xì)胞、細(xì)胞裂解物或核提取物維持在所述藥物或 藥物候選物可以與基因組相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)因子相互作用的條件下。將所述包含染色質(zhì)的 細(xì)胞、細(xì)胞裂解物或核提取物的基因組片段化，由此產(chǎn)生包含基因組片段的混合物，其中一 個(gè)或多個(gè)基因組片段與一個(gè)或多個(gè)與藥物相互作用的因子相關(guān)。測(cè)定與藥物或藥物候選物 與其相互作用的一個(gè)或多個(gè)因子相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)基因組片段的全部或部分的序列，由此 鑒別基因組上藥物或藥物候選物與其相互作用的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)。
[0012] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及一種在基因組范圍鑒別病癥或疾?。ɡ纾C合征） 印記的方法。所述方法包括將包含染色質(zhì)的細(xì)胞、細(xì)胞裂解物或核提取物接觸用于或可能 潛在用于治療所述疾病的藥物或藥物候選物，并將所述包含染色質(zhì)的細(xì)胞、細(xì)胞裂解物或 核提取物維持在所述藥物或藥物候選物可以與基因組相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)因子相互作用的 條件下。在一些方面中，所述細(xì)胞或其裂解物是獲自一個(gè)或多個(gè)患病個(gè)體的細(xì)胞或其裂解 物。將所述包含染色質(zhì)的細(xì)胞、細(xì)胞裂解物或核提取物的基因組片段化，由此產(chǎn)生包含基因 組片段的混合物，其中一個(gè)或多個(gè)基因組片段與一個(gè)或多個(gè)與藥物相互作用的因子相關(guān)。 測(cè)定與所述藥物或藥物候選物與其相互作用的一個(gè)或多個(gè)因子相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)基因組 片段每一個(gè)的全部或部分的序列，由此在基因組范圍鑒別所述病癥或疾病的印記。
[0013] 還在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及一種確定藥物或藥物候選物是否有效地治療需要 的個(gè)體中的病癥（例如，綜合征；疾病，如癌癥、心臟病等）的方法。所述方法包括將包含個(gè) 體的染色體的細(xì)胞、細(xì)胞裂解物或核提取物接觸藥物或藥物候選物，并將所述包含染色質(zhì) 的細(xì)胞、細(xì)胞裂解物或核提取物維持在所述藥物或藥物候選物可以與基因組相關(guān)的一個(gè)或 多個(gè)因子相互作用的條件下。將所述包含染色質(zhì)的細(xì)胞、細(xì)胞裂解物或核提取物的基因組 片段化，由此產(chǎn)生包含基因組片段的混合物，其中一個(gè)或多個(gè)基因組片段與一個(gè)或多個(gè)與 藥物相互作用的因子相關(guān)。測(cè)定與藥物或藥物候選物與其相互作用的一個(gè)或多個(gè)因子相關(guān) 的一個(gè)或多個(gè)基因組片段的全部或部分的序列，由此獲得個(gè)體基因組范圍的藥物相互作用 的印記，其中如果個(gè)體基因組范圍的藥物相互作用的印記與陽(yáng)性對(duì)照的印記相似、基本上 相似或相同，則所述藥物或藥物候選物將有效地治療所述個(gè)體的病癥，和/或如果個(gè)體基 因組范圍的藥物相互作用的印記與陰性對(duì)照的印記相似、基本上相似或相同，則所述藥物 或藥物候選物將不能有效地治療所述個(gè)體中的病癥。
[0014] (a)在一個(gè)方面中，本公開特征在于一種試劑盒，所述試劑盒包含以下的一個(gè)或多 個(gè)（例如，以下的每一個(gè)）；
[0015] (b)包含染色質(zhì)的細(xì)胞或細(xì)胞裂解物或核提取物或者用于制備包含染色質(zhì)的細(xì)胞 裂解物或核提取物的試劑；
[0016] (C)藥物或藥物候選物，其中所述藥物或藥物候選物連接可檢測(cè)標(biāo)記（如，生物 素）或與固體支持物偶聯(lián)（例如，直接或間接地）；
[0017] (d)與標(biāo)記相互作用的因子（例如，其中所述因子連接固體支持物，如珠子）（示例 性因子包括抗體（例如，連接于固體支持物））；
[0018] (e)任選地，用于測(cè)序通過(guò)試劑盒的說(shuō)明書的方法鑒別的一個(gè)或多個(gè)序列的試劑， 例如，引物或寡聚物，如PCR寡聚物；和
[0019] 將所述藥物或藥物候選物和所述包含染色質(zhì)的細(xì)胞或細(xì)胞裂解物或核提取物維 持在所述藥物或藥物候選物可以與基因組相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)因子相互作用的條件下的說(shuō) 明，并且所述與基因組相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)因子與細(xì)胞的基因組共價(jià)連接；將包含染色質(zhì)的 細(xì)胞或細(xì)胞裂解物或核提取物的基因組片段化從而產(chǎn)生包含基因組片段的混合物的說(shuō)明， 其中一個(gè)或多個(gè)基因組片段與一個(gè)或多個(gè)藥物或藥物候選物與其相互作用的因子相關(guān)；和 測(cè)定與藥物或藥物候選物與其相互作用的一個(gè)或多個(gè)因子相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)基因組片段 的序列的全部或一部分，由此在基因組范圍將所述藥物或藥物候選物與基因組相關(guān)的一個(gè) 或多個(gè)因子的相互作用進(jìn)行作圖的說(shuō)明。
[0020] 附圖簡(jiǎn)述
[0021] 圖1是Chem-Seq方法的示意圖。
[0022] 圖2顯示了 JQl-PEG-生物素的合成。
[0023] 圖3顯示了 JQl-PEG-生物素的差示掃描熒光測(cè)定法（DSF)的結(jié)果。
[0024] 圖4顯示了 bio-JQl和接近MYC和MITF基因座的基因組區(qū)域的關(guān)系的chem-seq 分析。針對(duì)DMSO(陰性對(duì)照）、bi〇-JQl和Brd4(JQl的蛋白質(zhì)靶標(biāo)）的測(cè)序閱讀片段的富集 顯示出在基因組范圍的區(qū)域處bio-JQl和Brd4的高重疊度，包括在接近MYC (A)和MITF (B) 基因的區(qū)域。
[0025] 圖5是體內(nèi)和體外方法的Chem-seq的圖示。體內(nèi)Chem-Seq允許活細(xì)胞中藥物-基 因組結(jié)合的分析。體外Chem-Seq是用于測(cè)定非細(xì)胞滲透的藥物或化學(xué)實(shí)體的基因組結(jié)合 位點(diǎn)的可選Chem-Seq方法。
[0026] 圖6顯示了癌細(xì)胞中bio-JQl和基因組區(qū)域的關(guān)系的Chem-Seq體內(nèi)分析。體內(nèi) Chem-Seq揭示了活細(xì)胞中藥物JQl結(jié)合的基因組位點(diǎn)。為了比較，顯示了 JQl靶標(biāo)蛋白 BRD4的基因組位置分析（ChIP-Seq)。注意體內(nèi)JQl結(jié)合的位點(diǎn)和BRD4占據(jù)的那些之間 的重疊程度。A :染色體1的區(qū)域上JQl占據(jù)位點(diǎn)的可視化。B :CCNL1基因座的JQl體內(nèi) Chem-Seq 分析。
[0027] 圖7說(shuō)明了癌細(xì)胞中結(jié)合于基因組區(qū)域的bio-JQl的Chem-Seq體外分析。體 外Chem-Seq揭示了藥物JQl結(jié)合的基因組位點(diǎn)（紅色）。為了比較，顯示了 JQl靶標(biāo)蛋白 BRD4(黑色）的基因組位置分析（ChIP-Seq)。注意體外JQl結(jié)合的位點(diǎn)和BRD4占據(jù)的那 些之間的重疊程度。A :染色體1的區(qū)域上JQl占據(jù)位點(diǎn)的可視化。B :IRF4基因座的JQl 體外Chem-Seq分析，其說(shuō)明了體外Chem-Seq產(chǎn)生了與體內(nèi)Chem-Seq相同的結(jié)果：JQl革巴 標(biāo)位點(diǎn)與BRD4-結(jié)合的位點(diǎn)重疊。
[0028] 圖8顯示了用于通過(guò)本文中所述的Chem-Seq方法分析的生物素化化合物的實(shí)例。
[0029] 圖9顯示了化合物Bio-JQl (S)的合成。
[0030] 圖10.生物素化JQl (bio-JQl)的生化表征。A.使用純化的BRD4布羅莫結(jié)構(gòu)域 (bromodomain)，BRD4(1)和DMS0、JQ1、bio-JQl和JQlR的差示掃描熒光測(cè)定法的結(jié)果。 B.生物素化JQl (nio-JQl)的等溫滴定量熱法的結(jié)果和解離常數(shù)的測(cè)定。
[0031] 圖11.基于Chem-Seq和ChIP-Seq數(shù)據(jù)之間的重疊的特異性分析。A.在麗I. S 細(xì)胞中CCND2基因處通過(guò)ChIP-Seq的BRD4和通過(guò)Chem-Seq的JQl的重復(fù)的占