一種犬細(xì)小病毒IgG抗體檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種犬細(xì)小病毒IgG抗體檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 犬細(xì)小病毒病是危害我國(guó)養(yǎng)犬業(yè)的主要流行型傳染病之一，是犬的一種具有高度 接觸性的烈性傳染病，具有發(fā)病急和死亡率高等特點(diǎn)，不同品種和年齡的犬都易感，幼犬在 16周齡左右感染率高達(dá)100%，死亡率達(dá)10% ~50%。中國(guó)寵物市場(chǎng)的發(fā)展和進(jìn)步，是社 會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展、人們對(duì)寵物的態(tài)度以及人口老齡化和城市化進(jìn)程綜合促進(jìn)的結(jié)果。犬作為一 種與人類接觸最為親密的、與人類相處時(shí)間最長(zhǎng)的寵物之一，與人類的日常生活已經(jīng)密不 可分，其健康狀況往往與人類自身的健康狀況息息相關(guān)，諸如犬是多少人畜共患的寄生蟲、 病毒和細(xì)菌性病原的宿主和可能的傳染源，因此，關(guān)注寵物犬的健康對(duì)于動(dòng)物福利和人類 健康具有重要的公共衛(wèi)生意義。犬除了作為寵物飼養(yǎng)之外，其在生命科學(xué)、軍用犬已經(jīng)試驗(yàn) 動(dòng)物用途中越來越廣泛。
[0003] 我國(guó)廣泛存在并已分離多種毒株，對(duì)于其特異性抗體的檢測(cè)方法主要有血凝抑制 試驗(yàn)（HI)，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)，膠體金法。其中血凝抑制試驗(yàn)（HI)，需要新鮮的豬、猴 的紅細(xì)胞，材料來源不及時(shí)、批次制備原料不穩(wěn)定、難以高通量檢測(cè)，操作人為因素影響大， 而僅限于個(gè)別實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部使用，無法批量工業(yè)化生產(chǎn)，而不能推廣到基層養(yǎng)殖場(chǎng)和寵物醫(yī) 院臨床一線檢測(cè)之用。膠體金便于臨床定性分析犬細(xì)小病毒抗體陽(yáng)性與陰性問題，而無法 做到精確定量。ELISA是一項(xiàng)國(guó)內(nèi)外通用的，目前在各個(gè)檢測(cè)領(lǐng)域技術(shù)最為成熟的一種方 法，商品化的試劑盒也非常好用。然而，目前國(guó)內(nèi)的技術(shù)力量沒有達(dá)到相應(yīng)的國(guó)際水平，遲 遲沒有中國(guó)自己的犬細(xì)小病毒ELISA抗體檢測(cè)試劑盒上市。而進(jìn)口犬細(xì)小病毒ELISA抗體 檢測(cè)試劑盒價(jià)格昂貴，臨床應(yīng)用成本高，在國(guó)內(nèi)難以普遍推廣使用。
[0004] 鑒于上述情況，開發(fā)一種能夠適合工業(yè)化批量生產(chǎn)、質(zhì)量可控、性能穩(wěn)定、高通量、 特異性和敏感性好的犬細(xì)小病毒抗體檢測(cè)試劑盒十分必要，更為重要的是，該試劑盒的成 本不能太高，否則，難以推廣應(yīng)用?；谝陨戏N種背景，建立了本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種犬細(xì)小病毒IgG抗體檢測(cè)試劑盒，能夠快速、準(zhǔn)確的進(jìn) 行檢測(cè)。
[0006] 本發(fā)明為解決上述問題所采取的技術(shù)方案是：一種犬細(xì)小病毒IgG抗體檢測(cè)試劑 盒，該試劑盒內(nèi)設(shè)有包被犬細(xì)小病毒抗原的96孔免疫檢測(cè)反應(yīng)板5塊、120mL10倍濃縮洗滌 液1瓶、120mL樣品稀釋液1瓶、50 μ L陽(yáng)性血清1管、50 μ L陰性血清1管、20 μ L辣根 過氧化物標(biāo)記的SPA酶標(biāo)抗體1管、60mL底物顯色液A液1瓶、I. 5 mL每管的底物顯色液 B液2管。
[0007] 所述包被犬細(xì)小病毒抗原96孔免疫檢測(cè)反應(yīng)板的制備方法，包括以下步驟： (1)、將培養(yǎng)瓶中單層貓腎細(xì)胞的培養(yǎng)基倒掉，然后向培養(yǎng)瓶中加入PBS洗滌液，每cm2 單層貓腎細(xì)胞對(duì)應(yīng)的PBS洗滌液為0. 027mL，之后搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，使洗滌液覆蓋單層貓腎細(xì)胞 面，以除去培養(yǎng)瓶中殘留的培養(yǎng)基，倒掉PBS洗滌液后備用； (2) 、向步驟（1)處理過的培養(yǎng)瓶中加入質(zhì)量濃度為0. 25%的胰酶-EDTA-Na2溶液，每 cm2單層貓腎細(xì)胞對(duì)應(yīng)的胰酶-EDTA-Na2溶液為0. 013mL，搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，直至胰酶-EDTA-Na2 溶液覆蓋單層貓腎細(xì)胞，室溫下靜置Imin后，倒掉瓶中的胰酶-EDTA-Na2溶液，再靜置 2min，振動(dòng)培養(yǎng)瓶直至單層貓腎細(xì)胞全部脫落，備用； (3) 、向步驟（2)處理過的培養(yǎng)瓶中加入MEM培養(yǎng)基，且MEM培養(yǎng)基中胎牛血清的質(zhì)量 濃度為5%，用移液槍吹散貓腎細(xì)胞，直至貓腎細(xì)胞呈單個(gè)分布，即制得細(xì)胞懸液，備用； (4) 、將細(xì)胞懸液與胎牛血清質(zhì)量濃度為5%的MEM培養(yǎng)基按1:5的體積比混合并攪拌 均勻，制得培養(yǎng)液，將基因型為2a型的犬細(xì)小病毒液加入到培養(yǎng)液中，使每孔病毒感染復(fù) 數(shù)為5TCID50,混合并攪拌均勻后制得包被液，備用； (5) 、用排槍吸取步驟（4)制備的包被液，并以每孔120 μ L加入到96孔免疫檢測(cè)反應(yīng) 板中，振動(dòng)免疫檢測(cè)反應(yīng)板，使包被液在孔內(nèi)均勻分布，之后放入溫度為37°C、C02體積濃 度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，將96孔免疫檢測(cè)反應(yīng)板中的包被液倒掉，并用PBS洗滌溶液 清洗3-4次，在溫度為30°C的真空干燥儀內(nèi)干燥，直至孔邊緣處出現(xiàn)白色圈； (6) 、向步驟（5)處理過的96孔免疫檢測(cè)反應(yīng)板中加入固定液，靜置30min后棄去固定 液，放入溫度為30°C的真空干燥儀內(nèi)干燥，直至孔邊緣出現(xiàn)白色圈，所述固定液是將丙酮與 PBS洗滌溶液按33:67的體積比混合并攪拌均勻后制得； (7) 、將步驟（6)制得的96孔免疫檢測(cè)反應(yīng)板抽真空后置于溫度為-20°C下保存，即制 得包被犬細(xì)小病毒抗原的96孔免疫檢測(cè)反應(yīng)板。
[0008] 每升10倍濃縮洗滌液的制備方法是將NaCl 80 g、kcl 2 g、Na2HP04 14. 2 g、 KH2P04 2. 7g溶入到900mL去離子水中，并定容至1000mL，在溫度為120°C下滅菌30分鐘 后，轉(zhuǎn)入溫度為4°C下密閉保存即可。
[0009] 所述底物顯色液A液的制備方法是將去離子無菌水、體積百分比濃度為30%的雙 氧水和pH為5. 0、摩爾濃度為0.1 moL/L的乙酸鹽緩沖液按1 :0. 03 :1的體積比混合并攪拌 均勻后制得。
[0010] 所述底物顯色液B液的制備方法是在每毫升二甲基甲酰胺中加入4mg 3-氨 基-9-乙基咔唑，混合并攪拌均勻后即可。
[0011] 所述底物顯色液的制備方法是將底物顯色液A液和底物顯色液B液按照20:1的 體積比混合并攪拌均勻后制得。
[0012] 有益效果 1、本發(fā)明所制備的試劑盒，在臨床樣品檢測(cè)時(shí)操作流程簡(jiǎn)單，3. 5小時(shí)之內(nèi)可完成檢 測(cè)，結(jié)果判定只需要一臺(tái)普通的倒置顯微鏡即可，不需要特殊的儀器，肉眼可見特異性染 色，非特異性染色十分容易區(qū)分，方便實(shí)驗(yàn)室和臨床現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)之用。
[0013] 2、相對(duì)于現(xiàn)有商品化的犬細(xì)小病毒ELISA抗體檢測(cè)試劑盒制備所需要的高成本、 高技術(shù)制備工藝和生產(chǎn)條件，本發(fā)明所制備的試劑盒，不僅材料成本低廉、制備工藝簡(jiǎn)單， 而且穩(wěn)定性強(qiáng)、靈敏度高、高通量的特性可與商品化的犬細(xì)小病毒ELISA抗體檢測(cè)試劑盒 媲美。
[0014] 3、本發(fā)明所制備的試劑盒具有材料來源穩(wěn)定、單一、可控的優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明所采用的 F81細(xì)胞為傳代細(xì)胞系，國(guó)際通用材料，背景清楚，可進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0015] 圖1為試驗(yàn)2中2只犬體內(nèi)IgG抗體采用本試劑盒所測(cè)定的效價(jià)變化曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 一種犬細(xì)小病毒IgG抗體檢測(cè)試劑盒，該試劑盒內(nèi)設(shè)有包被犬細(xì)小病毒抗原的96 孔免疫檢測(cè)反應(yīng)板5塊、120mL 10倍濃縮洗滌液1瓶、120mL樣品稀釋液1瓶、50 μ L陽(yáng)性血 清1管、50 μ L陰性血清1管、20 μ L辣根過氧化物標(biāo)記的SPA酶標(biāo)抗體1管、60mL底物顯 色液A液1瓶、I. 5 mL每管的底物顯色液B液2管。
[0017] 所述包被犬細(xì)小病毒抗原96孔免疫檢測(cè)反應(yīng)板的制備方法，包括以下步驟： (1) 、將培養(yǎng)瓶中單層貓腎細(xì)胞的培養(yǎng)基倒掉，然后向培養(yǎng)瓶中加入PBS洗滌液，每cm2 單層貓腎細(xì)胞對(duì)應(yīng)的PBS洗滌液為0. 027mL，之后搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，使洗滌液覆蓋單層貓腎細(xì)胞 面，以除去培養(yǎng)瓶中殘留的培養(yǎng)基，倒掉PBS洗滌液后備用； (2) 、向步驟（1)處理過的培養(yǎng)瓶中加入質(zhì)量濃度為0. 25%的胰酶-EDTA-Na2溶液，每 cm2單層貓腎細(xì)胞對(duì)應(yīng)的胰酶-EDTA-Na 2溶液為0. 013mL，搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，直至胰酶-EDTA-Na 2 溶液覆蓋單層貓腎細(xì)胞，室溫下靜置Imin后，倒掉瓶中的胰酶-EDTA-Na2溶液，再靜置 2min，振動(dòng)培養(yǎng)瓶直至單層貓腎細(xì)胞全部脫落，備用； (3) 、向步驟（2)處理過的培養(yǎng)瓶中加入MEM培養(yǎng)基，且MEM培養(yǎng)基中胎牛血清的質(zhì)量 濃度為5%，用移液槍吹散貓腎細(xì)胞，直至貓腎細(xì)胞呈單個(gè)分布，即制得細(xì)胞懸液，備用； (4) 、將細(xì)胞懸液與胎牛血清質(zhì)量濃