高精度測量豬尿中的克侖特羅含量的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及動物飼料的檢測領域，特別是一種高精度測量豬尿中的克侖特羅含量 的方法。
【背景技術】
[0002] 樣品前處理是分析檢測過程的關鍵環(huán)節(jié)，是濃縮被測定的痕量組分，提高方法的 靈敏度，及除去對分析系統(tǒng)有干擾的物質(zhì)的重要手段。萃取是從樣品集體中分離出目標化 合物的一項技術，是樣品預處理中最重要的方法之一。目前，液液萃取仍然是應用最廣泛的 樣品制備方法之一，但是，傳統(tǒng)的液液萃取的操作繁瑣費時、有機溶劑消耗量大，而且容易 出現(xiàn)乳化現(xiàn)象的缺陷，使得在實際應用中具有一定的局限性。
[0003] 1998年，科學家提出了在傳統(tǒng)的液液萃取的基礎上，利用一種具有吸附性和較大 的比表面積的惰性多空填料作為介質(zhì)，建立的一種新型高效樣品的制備方法-介質(zhì)液液萃 ?。╯upported liquid extraction簡稱SLE)，SLE萃取技術就是選用一種多孔性惰性材 料-煅燒硅藻土作為介質(zhì)，取代分液漏斗，增大了兩相接觸時的作用面積，實現(xiàn)高效、快速 的萃取過程。
[0004] 當水溶液樣品加樣到固定的聚丙烯注射管中的煅燒硅藻土上后，經(jīng)過一定時間 (一般分為幾分鐘），水相溶液以一層薄薄的液膜形式分布在填料表面，之后，將有機溶劑 從柱管上端加入，當互不相溶的兩相在硅藻土表面接觸的同時萃取立即發(fā)生，最后萃取液 在重力作用下流出，必要情況下，可以施加較小的壓力，而水相保留在介質(zhì)中。盛接的流出 液直接將溶劑吹干，復溶后，即可用于下一步分析檢測。
[0005] 農(nóng)業(yè)部1025號公告-11-2008公開了豬尿中β -受體激動劑多殘留檢測，其采用 酶解后異丙醇-乙酸乙酯進行萃取，并通過內(nèi)標法可以得到相關的檢測結(jié)果，但是在實際 應用中，采用酶解后然后在采用傳統(tǒng)方法萃取后通過色譜檢測有時無法檢出殘留項。如何 提高豬尿中的克侖特羅含量的測量精度是本領域技術人員需要考慮的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種分離效果好、有利于后續(xù)測試工作進行的高精度測量 豬尿中的克侖特羅含量的方法。
[0007] 本發(fā)明的技術方案為：一種高精度測量豬尿中的克侖特羅含量的方法，包括以下 步驟：
[0008] 步驟1 :樣品預處理；收集豬尿，并加入三氯乙酸沉淀豬尿中的蛋白質(zhì)，加入4倍于 豬尿體積的2mol/L的乙酸銨緩沖液，漩渦混合器混合后離心；取離心后的上清液；
[0009] 步驟2 :將上清液加入到SLE柱后，靜置2~4分鐘；
[0010] 步驟3 :采用二元洗脫劑對SLE柱洗脫至少兩次，接收洗脫液，得到含有克侖特羅 的洗脫液；
[0011] 步驟4 :采用高效液相色譜法對步驟3得到的洗脫液進行檢測，同時采用不同濃度 的克侖特羅標準溶液繪制標準回歸曲線，所述的高效液相色譜法的具體參數(shù)為：
[0012] 色譜柱：C18 柱，150mm*3. 9mmID
[0013] 柱溫：室溫
[0014] 流動相：0. 05%磷酸水溶液和乙腈的混合液，其中0. 05%磷酸水溶液和乙腈的體 積比為100:12 ;
[0015] 檢測器：UV檢測器；
[0016] 檢測波長：2IOnm;
[0017]進樣量：5〇yL;
[0018] 其中，所述的二元洗脫劑為乙酸乙酯和乙酸甲酯的混合物，其中乙酸乙酯和乙酸 甲酯的重量比為1:0. 5~1。
[0019] 在上述的采用SLE法分離飼料中的克侖特羅的方法中，所述的豬尿為lg，緩沖溶 液為4ml，步驟2中所取的上清液為0. 5ml，所述的步驟3中，每次洗脫時所用的洗脫劑為 0. 5ml 〇
[0020] 在上述的采用SLE法分離飼料中的克侖特羅的方法中，所述的三氯乙酸和豬尿的 質(zhì)量比為1:98~100。
[0021] 在上述的采用SLE法分離飼料中的克侖特羅的方法中，所述的步驟1中，漩渦混合 器混合處理的時間為0. 5~1分鐘。
[0022] 在上述的采用SLE法分離飼料中的克侖特羅的方法中，所述的步驟1中，所述的離 心處理的具體操作為：將經(jīng)混合處理的溶液在離心機中以9000~11000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離 心0· 5~1分鐘。
[0023] 在上述的采用SLE法分離飼料中的克侖特羅的方法中，所述的SLE柱為奧秘山東 科技有限公司生產(chǎn)的介質(zhì)液液萃取SLE柱，所述的高效液相色譜法所采用的儀器型號為 LC-2010型高效液相色譜儀。
[0024] 本發(fā)明的有益效果如下：
[0025] 采用SLE法分離豬尿中的克侖特羅，省略掉酶解步驟，并且采用緩沖溶液進行混 合，然后通過SLE柱分離出克侖特羅，萃取劑為乙酸乙酯和乙酸甲酯，本發(fā)明的分離效率 好、分離時間短，同時結(jié)合HPLC法測量萃取得到的洗脫液，能夠準確的測量豬尿中的克侖 特羅的含量，本發(fā)明的洗脫劑與傳統(tǒng)的洗脫劑相比，其測量精度提高了 9.99%。
【具體實施方式】
[0026] 下面結(jié)合【具體實施方式】，對本發(fā)明的技術方案作進一步的詳細說明，但不構(gòu)成對 本發(fā)明的任何限制。
[0027] 實施例1
[0028] 步驟1 :收集豬尿1ml，并加入三氯乙酸沉淀豬尿中的蛋白質(zhì)，加入4ml的2mol/L 的乙酸銨緩沖液，漩渦混合器混合后離心；取離心后的上清液0.5ml ;三氯乙酸和豬尿的質(zhì) 量比為1:99 ;所述的離心處理的具體操作為：將經(jīng)混合處理的溶液在離心機中以10000轉(zhuǎn) /分鐘的速度離心0.8分鐘。
[0029] 步驟2 :將上清液加入到SLE柱（奧秘山東科技有限公司生產(chǎn)的介質(zhì)液液萃取SLE 柱）后，靜置3分鐘；
[0030] 步驟3 :采用二元洗脫劑對SLE柱洗脫2次，接收洗脫液，得到含有克侖特羅的洗 脫液；每次消耗的洗脫劑為〇. 5ml，所述的二元洗脫劑為乙酸乙酯和乙酸甲酯的混合物，乙 酸乙酯和乙酸甲酯的重量比1:0. 8。
[0031] 實施例2
[0032] 步驟1 :收集豬尿1ml，并加入三氯乙酸沉淀豬尿中的蛋白質(zhì)，加入4ml的2mol/L 的乙酸銨緩沖液，漩渦混合器混合后離心；取離心后的上清液0.5ml ;三氯乙酸和豬尿的質(zhì) 量比為1:98 ;所述的離心處理的具體操作為：將經(jīng)混合處理的溶液在離心機中以9000轉(zhuǎn)/ 分鐘的速度離心1分鐘。
[0033] 步驟2 :將上清液加入到SLE柱（奧秘山東科技有限公司生產(chǎn)的介質(zhì)液液萃取SLE 柱）后，靜置2分鐘；
[0034] 步驟3 :采用二元洗脫劑對SLE柱洗脫2次，接收洗脫液，得到含有克侖特羅的洗 脫液；每次消耗的洗脫劑為〇. 5ml，所述的二元洗脫劑為乙酸乙酯和乙酸甲酯的混合物，乙 酸乙酯和乙酸甲酯的重量比1:1。
[0035] 實施例3
[0036] 步驟1 :收集豬尿1ml，并加入三氯乙酸沉淀豬尿中的蛋白質(zhì)，加入4ml的2mol/L 的乙酸銨緩沖液，漩渦混合器混合后離心；取離心后的上清液0.5ml ;三氯乙酸和豬尿的質(zhì) 量比為1:99 ;所述的離心處理的具體操作為：將經(jīng)混合處理的溶液在離心機中以10000轉(zhuǎn) /分鐘的速度離心0.5分鐘。
[0037] 步驟2 :將上清液加入到SLE柱（奧秘山東科技有限公司生產(chǎn)的介質(zhì)液液萃取SLE 柱）后，靜置4分鐘；
[0038] 步驟3 :采用二元洗脫劑對SLE柱洗脫2次，接收洗脫液，得到含有克侖特羅的洗 脫液；每次消耗的洗脫劑為〇. 5ml，所述的二元洗脫劑為乙酸乙酯和乙酸甲酯的混合物，乙 酸乙酯和乙酸甲酯的重量比1:0. 5。
[0039] 標準樣的制備
[0040] 稱取克侖特羅標準品（純度彡99% )0· OlOOg，置于1000 ml容量瓶中，用重量比為 1:0. 8的乙酸乙酯和乙酸甲酯的混合物的溶劑溶解定容，其濃度為10 μ g/ml ;
[0041] 取上述濃度為10 μ g/ml的克侖特羅溶液于1000ml容量瓶中，配制成為2 μ g/L、 5 μ g/L、8 μ g/L、10 μ g/L、20 μ g/L 的標準樣。
[0042] 對比例I
[0043] 與實施例1大體相同，不同的地方在于，步驟3中，洗脫劑為異丙醇與乙酸乙酯的 混合物，其體積比為60:40。
[0044] 分析：
[0045] 檢測方法具體為：
[0046] 儀器：LC-2010型高效液相色譜儀（日本島津）
[0047] 色譜柱：C18 柱，I5Omrn*3. 9HimID
[0048] 柱溫：室溫
[0049] 流動相：0. 05%磷酸水溶液：乙腈=100:12 ;
[0050] 檢測器：UV檢測器；
[0051] 檢測波長：2IOnm;
[0052] 進樣量：50 μ L
[0053] 以2 μ g/L、5 μ g/L、8 μ g/L、10 μ g/L、20 μ g/L的標準樣進行測試，回歸方程為Y = 10750X+0. 5, R2= 0. 9991，X為待測物濃度，Y為峰面積。
[0054] 取同一份豬尿1kg，按照實施例1的方法制備10份萃取樣品A標號為A1-A10,按 照對比例1的方法制備10份萃取樣品B標號為B1-B10。
[0055] 按照上述檢測方法進樣檢測，得到如下的檢測結(jié)果：
【主權(quán)項】
1. 一種高精度測量豬尿中的克侖特羅含量的方法，其特征在于，包括以下步驟： 步驟1 :樣品預處理；收集豬尿，并加入三氯乙酸沉淀豬尿中的蛋白質(zhì)，加入4倍豬尿體 積的2mol/L的乙酸銨緩沖液，漩渦混合器混合后離心；取離心后的上清液； 步驟2 :將上清液加入到SLE柱后，靜置2~4分鐘； 步驟3 :采用二元洗脫劑對SLE柱洗脫至少兩次，每次洗脫時所用的洗脫劑為0. 5ml，接 收洗脫液，得到含有克侖特羅的洗脫液； 步驟4 :采用高效液相色譜法對步驟3得到的洗脫液進行檢測，同時采用不同濃度的克 侖特羅標準溶液繪制標準回歸曲線，所述的高效液相色譜法的具體參數(shù)為： 色譜柱：C18 柱，150mm*3. 9mmID 柱溫:室溫 流動相：〇. 05%磷酸水溶液和乙腈的混合液，其中0. 05%磷酸水溶液和乙腈的體積比 為 100:12 ; 檢測器：uv檢測器； 檢測波長：210nm ; 進樣量：50yL ; 其中，所述的二元洗脫劑為乙酸乙酯和乙酸甲酯的混合物，其中乙酸乙酯和乙酸甲酯 的重量比為1:0. 5~1。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高精度測量豬尿中的克侖特羅含量的方法，其特征在于，所 述的豬尿為lg，緩沖溶液為4ml，步驟2中所取的上清液為0. 5ml。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高精度測量豬尿中的克侖特羅含量的方法，其特征在于，所 述的三氯乙酸和豬尿的質(zhì)量比為1:98~100。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高精度測量豬尿中的克侖特羅含量的方法，其特征在于，所 述的步驟1中，漩渦混合器混合處理的時間為0. 5~1分鐘。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的高精度測量豬尿中的克侖特羅含量的方法，其特征在于，所 述的步驟1中，所述的離心處理的具體操作為：將經(jīng)混合處理的溶液在離心機中以9000~ 11000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心0. 5~1分鐘。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高精度測量豬尿中的克侖特羅含量的方法，包括以下步驟：步驟1：樣品預處理；收集豬尿，并加入三氯乙酸沉淀豬尿中的蛋白質(zhì)，加入80％VOL的2mol/L的乙酸銨緩沖液，漩渦混合器混合后離心；取離心后的上清液；步驟2：將上清液加入到SLE柱后，靜置2～4分鐘；步驟3：采用二元洗脫劑對SLE柱洗脫至少兩次，接收洗脫液，得到含有克侖特羅的洗脫液，步驟4：采用高效液相色譜法對步驟3得到的洗脫液進行檢測。本發(fā)明的目的在于提供一種分離效果好、有利于后續(xù)測試工作進行的高精度測量豬尿中的克侖特羅含量的方法。
【IPC分類】G01N30-02
【公開號】CN104807909
【申請?zhí)枴緾N201510238890
【發(fā)明人】陳學松, 郭振旺, 黃蘅, 吳嵐, 鄧水德, 黎志銳
【申請人】廣西壯族自治區(qū)梧州食品藥品檢驗所
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2015年5月12日