一種合金納米粒子修飾的電致發(fā)光細胞傳感紙芯片的制備
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細胞檢測技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說是一種基于合金納米粒子電致發(fā)光檢測腫瘤細胞的折疊式紙芯片的制備。
【背景技術(shù)】
[0002]在惡性腫瘤也稱癌癥，是當前嚴重威脅人類健康和生命的一類疾病，它是機體在受各種內(nèi)在或外在致癌因素的作用下，局部組織的細胞的在基因水平失去了對其自身生長的正常調(diào)控，導致不正常增生而形成的新生物。腫瘤發(fā)病率和死亡率上升趨勢嚴重威脅著人類的健康，它的早期診斷和治療是腫瘤預(yù)防治療的重要研宄領(lǐng)域之一。
[0003]由于人們對癌癥預(yù)防的日益重視，腫瘤細胞檢測方法也越來越多。目前而言，細胞檢測的方法大都是基于熒光成像的方法，但是這個方法需要的操作時間長，設(shè)備昂貴，同時需要操作人員具有較熟練的經(jīng)驗。為了克服這些缺點，也催生了一些其他的腫瘤細胞的檢測方法，例如:
1.石英微天平傳感器。主要通過檢測物質(zhì)在石英晶片表面上吸附前后石英晶片共振頻率的變化以得到吸附物質(zhì)的量以及一些物理性能。該方法的主要優(yōu)點是靈敏度較高，響應(yīng)快，缺點是重復(fù)率低并且不利于現(xiàn)場快速檢測；
2.表面增強拉曼光譜法檢測(SERS)。目前普遍認為SERS主要有兩種機理，一種是物理增強機理，通過局域場和偶極發(fā)射起作用；另一種是化學增強機理，通過分子的極化率起作用。該方法的優(yōu)點是檢測靈敏度高，缺點是一起昂貴，且需要熟練操作，不利于現(xiàn)場檢測；
3.電化學阻抗譜圖法。其原理是給電化學系統(tǒng)施加一個頻率不同的小振幅的交流電勢波，測量交流電勢與電流信號的比值(此比值即為系統(tǒng)的阻抗)隨正弦波頻率ω的變化，或者是阻抗的相位角Φ隨ω的變化。該方法檢測細胞時的缺點是應(yīng)用范圍有一定的限制。
[0004]以上幾種方法對于腫瘤細胞的檢測和分析都存在一些問題和缺點而限制其在實際樣品檢測中的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]在本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供了一種具有樣品處理簡單、檢測速度快、成本低、靈敏度高、特異性強等特點的檢測細胞電致發(fā)光傳感折疊式紙芯片的制備及檢測方法。
[0006]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明是通過以下措施來實現(xiàn)的:一種基于合金納米粒子修飾的電化學發(fā)光細胞傳感紙芯片的制備方法，其特征包括以下步驟:
(O制備折疊式紙芯片:先用蠟打印機在Α4紙上打印如附圖1的蠟圖案，并將帶有蠟圖案的的Α4紙放到平板加熱器或烘箱中，在60-150攝氏度下加熱0.5-2分鐘，使蠟融化并浸透整個紙的厚度，形成疏水區(qū)域；采用絲網(wǎng)印刷電極的方法，在處理好的Α4紙的未打印蠟的親水區(qū)域印刷碳工作電極和Ag/AgCl參比電極(如附圖2)；
(2)制備用于修飾電極的AuOPd納米粒子，利用原位生長的方法，將其修飾到電極表面； (3)選擇能夠特異性識別被檢測細胞SK-BR-3的適配體，通過自組裝技術(shù)將其修飾到已經(jīng)處理過的電極表面上；
(4)將已經(jīng)過處理的被測細胞樣品，利用自組裝技術(shù)與(3)中的適配體進行特異性結(jié)合；
(5)制備具有高發(fā)光性能的量子點；
(6)制備能夠增強電子傳遞，起到信號放大作用的多孔納米材料PtNi合金；
(7)利用自組裝表面修飾等技術(shù)，將(5)與(6)制備的材料符合，合成具有信號放大作用的ECL探針。
[0007]本發(fā)明所述的基于合金納米粒子修飾的細胞傳感器將細胞修飾到電極表面包括以下步驟:
(1)將制備的紙芯片上的印刷電極用瑪瑙錘子仔細地打磨2分鐘；
(2)制備AuOPd納米粒子修飾紙電極
首先將15.0微升Au納米種子滴加到紙電極的工作區(qū)域，然后在室溫下反應(yīng)I小時，清洗除去未結(jié)合的Au納米后，將該電極放入到含有10 mM HAuCldP 20禮H2PdCld^混合溶液中，然后再振蕩的條件下迅速加入檸檬酸，最后得到的AuOPd修飾紙電極清洗后置于室溫下30 min后即可得；
(3)制備PtNi合金納米材料
通過在電弧爐里精煉高純度的Pt、N1、Al金屬，然后再氮氣保護的環(huán)境下利用旋鑄技術(shù)制備得到PtNiAl合金。然后通過去合金化處理將制得的PtNiAl合金溶解在IM NaOH溶液里48h即可得到PtNi合金納米材料；
(4)將制備的PtNi合金納米材料冰水浴超聲處理10-30min,得到分散性較好的合金材料溶液；
(5)將制備的碳點溶液離心處理5-10min，除去不發(fā)光的沉淀物質(zhì)，得到分散性較好的碳點溶液；
(6)將(4)制備的PtNi合金材料溶液與(5)制備的碳點溶液混合超聲，處理20-30min，然后離心分離去除沉淀，得到分散性較好的PtN1CDs復(fù)合材料溶液；
(7)將(6)制備好的PtN1⑶s復(fù)合材料溶液與伴刀豆球蛋白A(Con A)進行振蕩處理20-30min，然后離心除去未反應(yīng)的部分，得到Con A-PtNiMDs復(fù)合物；
(8)將(2)制備好的已修飾好電極，通過層層修飾與自組裝的技術(shù)逐層修飾上選定的適配體與一定濃度的腫瘤細胞，經(jīng)過逐步清洗除去未反應(yīng)的適配體與細胞；
(9)將(6)制備的溶液修飾到(8)已修飾的電極表面，反應(yīng)20-30min后經(jīng)過清洗除去未反應(yīng)的標記復(fù)合物，在室溫下干燥5-10 min。
[0008]本發(fā)明還包括以下步驟:
本發(fā)明所述的發(fā)光量子點為碳點。
[0009]本發(fā)明所述的化學發(fā)光分析儀為西安瑞邁IFFM-E型流動注射化學發(fā)光分析儀。
[0010]一種基于合金納米粒子修飾的電化學發(fā)光細胞傳感紙芯片的制備方法，其特征包括，選定任意一種腫瘤細胞，篩選與之匹配的適配體，利用該芯片即可方便快速檢測。
[0011]本發(fā)明的有益效果
1.基于3D紙芯片制備的ECL傳感器，體積小，攜帶方便，便于處理，相對于傳統(tǒng)電機，極大的降低了成本；
2.將表面修飾技術(shù)應(yīng)用到修飾電極的制備當中，使得納米增效的電致發(fā)光傳感芯片具有可控性，提高了電極的靈敏度和準確性；
3.本發(fā)明所得到的一種基于合金納米材料修飾的細胞片傳感器，可以實現(xiàn)樣本中被測細胞的高特異性、高靈敏度、低成本、快速檢測；
4.本發(fā)明的檢測腫瘤細胞電致發(fā)光紙芯片傳感器特異性、靈敏度高；檢測速度快，完成一個基本檢測過程僅需3-5min的時間，可以在短時間內(nèi)實現(xiàn)大量樣品的高通量篩選；試劑用量少，檢測一個樣品只需要幾十微升試劑；成本低，檢測一個樣品僅需幾分錢；
5.一種基于多金屬納米粒子修飾的電化學發(fā)光細胞傳感紙芯片的制備方法，操作速度簡單，反應(yīng)及結(jié)果均由儀器自動完成和記錄，避免了主觀因素的影響，并有很好的重復(fù)性，便于現(xiàn)場檢測。
【附圖說明】
[0012]下面結(jié)合附圖和具體實施例子對本發(fā)明做進一步的詳細描述。
[0013]附圖1為A4紙上蠟打印疏水圖案。
[0014]附圖2為紙上印刷電極a:工作電極，b:參比電極，c:對電極。
【具體實施方式】
[0015]實施案例I (SK-BR-3腫瘤細胞的檢測)
一種基于多金屬納米粒子修飾的電化學發(fā)光細胞傳感紙芯片的制備方法，包括以下步驟:
(1)制備折疊式紙芯片:先用蠟打印機在A4紙上打印如附圖的蠟圖案，并將帶有蠟圖案的的A4紙放到平板加熱器或烘箱中，在60-150攝氏度下加熱0.5-2分鐘，使蠟融化并浸透整個紙的厚度，形成疏水區(qū)域；采用絲網(wǎng)印刷電極的方法，在處理好的A4紙的未打印蠟的親水區(qū)域印刷碳工作電極和Ag/AgCl參比電極(如附圖2)；
(2)制備AuOPd納米粒子修飾紙電極
首先將15.0微升Au納米種子滴加到紙電極的工作區(qū)域，然后在室溫下反應(yīng)I小時，清洗除去未結(jié)合的Au納米后，將該電極放入到含有HAuCl4 (10 mM)和H2PdCl4 (20 mM)的混合溶液中，然后再振蕩的條件下迅速加入檸檬酸，最后得到的AuOPd修飾紙電極清洗后置于室溫下30 min后即可得；
(3)制備PtNi合金納米材料
通過在電弧爐里精煉高純度的Pt、N1、Al金屬，然后再氮氣保護的環(huán)境下利用旋鑄技術(shù)制備得到PtNiAl合金。然后通過去合金化處理將制得的PtNiAl合金溶解在NaOH (IM)溶液里48h即可得到PtNi合金納米材料；
(4)將制備的PtNi合金納米材料冰水浴超聲處理10-30min,得到分散性較好的合金材料溶液；
(5)將制備的碳點溶液離心處理5-10min，除去不發(fā)光的