一種血液及尿液中硫化氫的測定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于體內(nèi)藥物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種血液及尿液中硫化氫的檢測方法，特別是一種分散固相微萃取結(jié)合高效液相色譜測定血液及尿液中的硫化氫的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在心血管系統(tǒng)中，硫化氫(H2S)能開放ATP敏感的鉀離子通道，使血管平滑肌舒張，降低血壓；體內(nèi)H2S生成減少與自發(fā)性高血壓的形成有密切關(guān)系；外源性給予H2S能有效保護心肌的缺血性損傷。由于能在體內(nèi)產(chǎn)生，并具有多種生理功能，H2S成為繼NO和CO后的第三個氣體信號分子。越來越多的證據(jù)表明內(nèi)源性H2S與多種疾病有著密切的關(guān)系，在臨床多種疾病中，內(nèi)源性H2S的生成和代謝發(fā)生了改變，并進一步影響了疾病的發(fā)展過程，以H2S為靶點的治療具有潛在的臨床應(yīng)用前景；一種可靠、準(zhǔn)確的血液、尿液中內(nèi)源性H2S的測定方法對監(jiān)測體內(nèi)H2S含量及相關(guān)疾病的預(yù)測及診斷有重要意義。
[0003]H2S檢測方法主要包括亞甲基蘭分光光度法、硫離子選擇電極法、熒光衍生法、氣相色譜法、熒光探針及免疫分析法等。目前現(xiàn)有H2S檢測技術(shù)主要集中在大氣、水等環(huán)境樣品中，其檢測靈敏度在lmg/kg，而體內(nèi)內(nèi)源性硫化氫(H2S)含量在μπιο?級。研宄小組之前已利用分散液液微萃取結(jié)合光度法、共沉淀結(jié)合高效液相色譜法對血液及尿液H2S檢測進行了研宄，取得了不錯的效果，申請了發(fā)明專利(201410382081)及(201410062197)。進一步研宄發(fā)現(xiàn)，血液及尿液由于基體復(fù)雜，存在顏色、蛋白、脂肪的影響，共沉淀及液液微萃取存在基體分離不完全的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種穩(wěn)定性好、干擾小、準(zhǔn)確、靈敏、快速測定血液及尿液中硫化氫含量的方法。
[0005]本發(fā)明利用硅酸納改性的磁性納米材料(Fe3O4OS12)吸附硫化氫衍生物亞甲基藍，對目標(biāo)物進行快速富集，在磁場作用下能夠快速將基體與磁性材料分離。由于磁性吸附劑與目標(biāo)物之間的磁性吸附具有特異性，因而，避免了溶液中的懸濁顆粒對于整個吸附過程的影響，降低了基質(zhì)干擾同時提高了檢測靈敏度。本發(fā)明利用磁性材料結(jié)合高效液相色譜(HPLC)法，一是利用磁性材料能高效分離血液、尿液中的干擾物質(zhì)；二是對硫離子衍生物亞甲基蘭能快速吸附；三是洗脫劑用量小，洗脫快速，檢測限可0.005 μ g/mL ;四是納米磁性材料可以重復(fù)用到3次以上。
[0006]除非另有說明，本發(fā)明所采用的百分?jǐn)?shù)均為重量百分?jǐn)?shù)。
[0007]本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn):
以制備的硅酸納改性的磁性納米材料(Fe3O4IgS12)為固相萃取劑，按每5mL尿液或處理過的血液中加入質(zhì)量百分比濃度為0.2%對氨基二甲基苯胺鹽酸鹽溶液100?200 μ L，再加入質(zhì)量百分比濃度為20%三氯化鐵溶液50?100 μ L，混合均勻，靜置5?1min ;加入5mol/L NaOH溶液將樣品pH調(diào)至中性，3000r/min離心2?5min，吸取上清液；向上清液中加入I?3mg固相萃取劑，渦旋I?2min使固相萃取劑均勻分散在水中，然后靜置5?1min后，用外磁場收集帶有目標(biāo)物的固相萃取劑，去掉上清液，用洗脫劑洗脫固相萃取劑，收集洗脫液，采用設(shè)置的高效液相色譜條件進行含量測定。
[0008]所述娃酸鈉改性的磁性納米材料(Fe3O4OS12)的制備包括以下步驟:
①Fe3O4磁性納米材料的制備:按照三價鐵鹽與二價鐵鹽摩爾比為2.0?1.6:1的比例將三價鐵鹽溶液與二價鐵鹽溶液溶解于5?10倍的三價鐵鹽與二價鐵鹽溶液體積的去離子水中，在氮氣保護下，滴加氨水使溶液體系pH為9?12，在60?80°C、攪拌速度400?800 rpm下，水浴加熱，恒溫攪拌反應(yīng)I?3h后，用去離子水洗滌至中性，40?80°C真空干燥6?12h，制得四氧化三鐵磁性納米材料；
②Fe3O4OS1Jlt性納米材料的制備:按1.0g Fe 304磁性納米材料添加100 mL去離子水的比例將步驟①制備好的Fe3O4磁性納米材料分散在去離子水中，并在氮氣保護下，滴加1.0 mol/L硅酸鈉10 mL至Fe3O4納米分散液中，使體系pH為6?7，在70?85°C、攪拌速度400?800 rpm下，恒溫攪拌反應(yīng)2?4h后，用去離子水洗滌4次，40?80°C真空干燥6?12h，制得Fe3O4OS1Jlt性納米材料。
[0009]所述的三價鐵鹽為FeCl3.7H20或Fe2(SO4)3.9H20，二價鐵鹽為FeCl2.4H20或FeSO4.7H20o
所述處理過的血液是指取5mL新鮮血液，2000r/min離心lOmin，將血清轉(zhuǎn)移至離心管中用蒸飽水定容至5 mL。
[0010]所述0.2%對氨基二甲基苯胺鹽酸鹽溶液是0.1g對氨基二甲基苯胺鹽酸鹽溶于5OmL 3mol/L鹽酸制得。
[0011 ] 所述的三氯化鐵溶液為按1g三氯化鐵溶于50mL蒸餾水中的比例配制的。
[0012]所述的洗脫劑甲醇、乙腈、丙酮中的一種，用量為300-600 μ L。
[0013]所述的高效液相色譜測定的色譜條件為:固定相為C18的分析色譜柱，洗脫液為甲醇:水(體積比50:50)，洗脫方式為等度洗脫；流速為1.0mL/min ;進樣量為10 μ L，柱溫250C ;紫外-可見光二極管陣列檢測器的檢測波長為665nm。
[0014]相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下顯著優(yōu)點:
1、￥_與對氨基二甲基苯胺鹽酸鹽和三氯化鐵在酸性條件下衍生形成亞甲基藍，通過加入改性磁性納米材料對亞甲基藍進行吸附，在外加磁場的作用下將磁性材料與基體分離，用少量洗脫劑對磁性材料進行洗脫；既使S2-衍生物與復(fù)雜的基體得到了分離，又對硫離子進行了濃縮富集，檢測限可達0.005 μ g/mL ;
2、分散固相微萃取過程具有簡單、快速、穩(wěn)定性好，易操作的特點，流程見圖1，體內(nèi)硫化氫的檢測存在基體干擾大，含量低的現(xiàn)狀，提供快速、簡便、直觀的定性和定量測定。
【附圖說明】
[0015]圖1為分散固相微萃取流程示意圖；
圖2為血液中H2S經(jīng)Fe3O4OS12磁性納米材料富集與未富集對比色譜圖。
【具體實施方式】
[0016]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步地說明，但本發(fā)明的保護范圍并不限于此。
[0017]實施例1:利用本方法檢測人體尿液中硫化氫的含量
1、卩6304磁性納米材料的制備:將211101/1FeCl3.7Η20 12mL與 lmol/L FeCl2.4Η20 12mL混合于120mL去離子水中，在氮氣保護下，滴加50mL氨水使體系pH為9，在60°C下水浴加熱，攪拌速度為400 rpm下，恒溫攪拌反應(yīng)3h后，用去離子水洗滌至中性，70°C真空干燥8h，制得Fe3O4性納米材料；
2、Fe304@Si02磁性納米材料的制備:將步驟I制備好的Fe304磁性納米材料l.0g分散在100 mL去離子水中，在氮氣保護下，滴加1.0 mol/L娃酸鈉10 mL至Fe3O4納米分散液中，使體系pH為6，在70°C、攪拌速度800rpm下，恒溫攪拌反應(yīng)2h后，用去離子水洗滌4次，40°C真空干燥12h，制得Fe3O4IgS1JIt性納米材料；
3、尿液的檢測:取5mL尿液至1mL離心管中，加入0.2%對氨基二甲基苯胺鹽酸鹽溶液(0.1g對氨基二甲基苯胺鹽酸鹽溶于50mL 3mol/L鹽酸制得)200 μ L，再加入20%三氯化鐵溶液50 μ L，混合均勻，靜置5min ;然后加入5mol/L NaOH溶液將樣品pH調(diào)至中性，3000r/min離心2min，吸取上清液；向上清液中加入Fe3O4OS1JM性材料2mg，禍旋混合lmin，靜置5min ;用磁鐵貼近試管壁，將磁性材料與樣品溶液分離，傾倒出上清液；用400 μ L乙腈對磁性材料進行洗脫，洗脫液用0.45 μπι濾膜進行過濾；進高效液相，測定的色譜條件為:固定相為C18的分析色譜柱，洗脫液為體積比50: 50的甲醇和水的混合液，洗脫方式為等度洗脫；流速為1.0mL/min ;進樣量為10 μ L，柱溫25°C;紫外-可見光二極管陣列檢測器的檢測波長為665nm，得到尿液中硫化氫的含量為0.065 μ g/mL (見圖2)。
[0018]實施例2:利用本方法檢測人體尿液中硫化氫的含量
1、卩6304磁性納米材料的制備:將211101/1FeCl3.7Η20 12mL與 lmol/L FeSO4.7Η20 15mL混合于150mL去離子水中，在氮氣保護下，滴加50mL氨水使體系pH為10，在70°C下水浴加熱，攪拌速度為600 rpm下，恒溫攪拌反應(yīng)1.5h后，用去離子水洗滌至中性，40°C真空干燥12h，制得Fe3O4性納米材料；