骨髓涂片微小巨核細胞染色試劑盒及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及骨髓涂片染色技術(shù)，尤其涉及一種用CD41與CD61抗體聯(lián)合標(biāo)記的骨髓涂片微小巨核細胞染色試劑盒及其使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002]微小巨核通常是一種病態(tài)的巨核細胞，微小巨核細胞直徑小于15μπι，該細胞與淋巴細胞大小相當(dāng)，細胞質(zhì)內(nèi)容物較少，常伴有血小板的生成。微小聚合細胞見于多種血液病，是骨髓病態(tài)造血的特征之一。臨床常用瑞氏-姬姆薩染色法對微小巨核細胞進行染色鑒定，但是該染色方法通過形態(tài)細胞涂片以主觀經(jīng)驗評判，很容易將微小巨核細胞和原始巨核細胞以及淋巴細胞發(fā)生混淆，所以臨床檢出的準(zhǔn)確性較低。目前，也有CD41單抗體骨髓細胞學(xué)的檢測技術(shù)，但是該技術(shù)存在假陽性的弊端，使檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度也較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種用CD41與CD61抗體聯(lián)合標(biāo)記的骨髓涂片微小巨核細胞染色試劑盒，本發(fā)明還公開了該試劑盒的使用方法。
[0004]本申請的骨髓涂片微小巨核細胞染色試劑盒，通過合理的⑶41與⑶61抗體組合聯(lián)合標(biāo)記，克服了單個抗體染色假陽性的干擾，還可進一步區(qū)分出小巨核細胞、多圓小巨核細胞及大單圓核巨核細胞，極大的提高了臨床診斷及鑒別診斷。
[0005]根據(jù)本發(fā)明的實施例，提供了用CD41與CD61抗體聯(lián)合標(biāo)記的骨髓涂片微小巨核細胞染色試劑盒，其主要包括:裝有Polymer Helper試劑的試劑管、裝有PBS磷酸鹽緩沖液的試劑管、裝有抗原修復(fù)液的試劑管、裝有過氧化氫溶液的試劑管、裝有二氨基聯(lián)苯胺染色液的試劑管、裝有蘇木素染色液的試劑管、裝有I %酸酒精的試劑管、裝有I %氨水的試劑管、裝有二甲苯的試劑管、裝有酒精的試劑管、裝有CD41單克隆抗體的試劑管、裝有CD61單克隆抗體的試劑管、裝有通用型CD41和CD61免疫組化抗體的試劑管；分隔并集中包裝這些試劑管的包裝盒。
[0006]其中，所述Polymer Helper試劑為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司的PolymerHelper 試劑。
[0007]其中，所述酸酒精為鹽酸酒精。
[0008]其中，PBS磷酸緩沖液濃度為0.01M, pH值為7.2?7.4。
[0009]其中，過氧化氫溶液濃度為3?3.5 %，進一步地，所述過氧化氫溶液濃度為3 %。
[0010]本發(fā)明的試劑盒的使用方法，包括以下步驟:
[0011]I)使用抗原修復(fù)液對骨髓涂片進行抗原修復(fù)后，使用蒸餾水洗滌骨髓涂片；
[0012]2)使用過氧化氫溶液對骨髓涂片進行封閉，然后使用PBS磷酸鹽緩沖液洗滌骨髓涂片;
[0013]3)滴加第一抗體，室溫孵育25?35分鐘，用PBS磷酸鹽緩沖液洗滌后，再滴加Polymer Helper試劑，室溫孵育15?25分鐘，用PBS磷酸鹽緩沖液洗滌后，再滴加第二抗體，室溫孵育15?25分鐘，再用PBS磷酸鹽緩沖液洗滌；
[0014]4)使用二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine，DAB)染色液顯色，再用蘇木素染色，使用蒸餾水洗滌骨髓涂片；
[0015]5)在I %酸酒精中涮2次，用蒸餾水洗滌玻片，然后再用I %氨水涮2次，用蒸餾水洗滌玻片；
[0016]6)在梯度稀釋的酒精(75%?100% )中(各30s)脫水并在二甲苯中(2min)做透明處理后，就可以通過顯微鏡判讀結(jié)果。
[0017]其中，步驟3)所述的第一抗體為CD41單克隆抗體和CD61單克隆抗體；第二抗體為通用型⑶41和⑶61免疫組化抗體。
[0018]其中，步驟3)中，滴加第一抗體后孵育30分鐘，滴加Polymer Helper試劑后孵育20分鐘，滴加第二抗體后孵育20分鐘。
[0019]其中，步驟6)中，梯度稀釋的酒精濃度為75%—85%— 100%。
[0020]通過以上技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果如下:
[0021]本發(fā)明進行技術(shù)創(chuàng)新，通過長期的摸索、試驗，探討出了一種全新的⑶41及⑶61聯(lián)合免疫組化染色方法，既克服了形態(tài)細胞涂片以主觀經(jīng)驗評判的缺點，以抗原抗體結(jié)合再顯色尋找陽性細胞為診斷依據(jù)達到了同組織切片免疫組化相類似的效果，又避免了以往單個CD41抗體染色假陽性對結(jié)果的干擾，提高了檢測的準(zhǔn)確性，且標(biāo)本易于獲得，收集到的有核細胞多，大大提高了陽性檢出率，具有自己獨特的優(yōu)點，滿足了臨床的需求。
【具體實施方式】
[0022]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步描述，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是示范性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。
[0023]下述實施例中所使用的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0024]下述實施例中所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0025]實施例
[0026]用CD41與CD61抗體聯(lián)合標(biāo)記的骨髓涂片微小巨核細胞染色試劑盒及其使用方法
[0027]1、該試劑盒中裝有:
[0028]裝有Polymer Helper試劑的試劑管、裝有PBS磷酸鹽緩沖液的試劑管、裝有抗原修復(fù)液的試劑管、裝有過氧化氫溶液的試劑管、裝有二氨基聯(lián)苯胺染色液的試劑管、裝有蘇木素染色液的試劑管、裝有1%酸酒精的試劑管、裝有1%氨水的試劑管、裝有二甲苯的試劑管、裝有酒精的試劑管、裝有CD41單克隆抗體的試劑管、裝有CD61單克隆抗體的試劑管、裝有通用型CD41和CD61免疫組化抗體的試劑管；分隔并集中包裝這些試劑管的包裝盒。
[0029]上述Polymer Helper 試劑、抗原修復(fù)液、二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine，DAB)染色液、PBS磷酸鹽緩沖液、抗體等試劑均購買自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。它們的產(chǎn)品目錄號分別為:Polymer Helper試劑(PV-6000)、抗原修復(fù)液(TA-999-DHBH)、二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine，DAB)染色液(ZL1-9032)、PBS 磷酸鹽緩沖液(ZL1-9062)。
[0030]2、試劑盒的使用方法如下:
[0031](I)準(zhǔn)備好待檢測的骨髓涂片，使用抗原修復(fù)液對骨髓涂片進行抗原修復(fù)后，使用蒸餾水洗滌骨髓涂片；
[0032](2)使用過氧化氫溶液對骨髓涂片進行封閉，然后使用PBS磷酸鹽緩沖液洗滌骨髓涂片;
[0033](3)滴加第一抗體(⑶41單克隆抗體和⑶61單克隆抗體)，室溫孵育30分鐘，用PBS磷酸鹽緩沖液洗滌后，再滴加Polymer Helper試劑，室溫孵育20分鐘，用PBS磷酸鹽緩沖液洗滌后，再滴加第二抗體(通用型⑶41和⑶61免疫組化抗體)，室溫孵育20分鐘，再用PBS磷酸鹽緩沖液洗滌；
[0034](4)使用二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine，DAB)染色液顯色，再用蘇木素染色，使用蒸餾水洗滌骨髓涂片；
[0035](5)在1%鹽酸酒精中涮2次，用蒸餾水洗滌玻片，然后再用1%氨水涮2次，用蒸餾水洗滌玻片；
[0036](6)在梯度稀釋的酒精(75%—85%— 100% )中(各30s)脫水并在二甲苯中(2min)做透明處理后，就可以通過顯微鏡判讀結(jié)果。
[0037]本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種用CD41與CD61抗體聯(lián)合標(biāo)記的骨髓涂片微小巨核細胞染色試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括: 裝有Polymer Helper試劑的試劑管、裝有PBS磷酸鹽緩沖液的試劑管、裝有抗原修復(fù)液的試劑管、裝有過氧化氫溶液的試劑管、裝有二氨基聯(lián)苯胺染色液的試劑管、裝有蘇木素染色液的試劑管、裝有I %酸酒精的試劑管、裝有I %氨水的試劑管、裝有二甲苯的試劑管、裝有酒精的試劑管、裝有CD41單克隆抗體的試劑管、裝有CD61單克隆抗體的試劑管、裝有通用型⑶41和⑶61免疫組化抗體的試劑管； 分隔并集中包裝這些試劑管的包裝盒。
2.按照權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述PolymerHelper試劑為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司的Polymer Helper試劑。
3.按照權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述酸酒精為鹽酸酒精。
4.按照權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述PBS磷酸鹽緩沖液的濃度為0.01M, pH 值為 7.2 ?7.4。
5.按照權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述過氧化氫溶液的濃度為3?3.
6.權(quán)利要求1所述的試劑盒的使用方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟1、使用抗原修復(fù)液對骨髓涂片進行抗原修復(fù)后，再用蒸餾水洗滌骨髓涂片； 步驟2、使用過氧化氫溶液對骨髓涂片進行封閉，然后使用PBS磷酸鹽緩沖液洗滌骨髓涂片; 步驟3、滴加第一抗體，室溫孵育25?35分鐘，用PBS磷酸鹽緩沖液洗滌后，再滴加Polymer Helper試劑，室溫孵育15?25分鐘，用PBS磷酸鹽緩沖液洗滌后，再滴加第二抗體，室溫孵育15?25分鐘，再用PBS磷酸鹽緩沖液洗滌； 步驟4、使用二氨基聯(lián)苯胺染色液顯色，再用蘇木素染色，使用蒸餾水洗滌骨髓涂片；步驟5、在I %酸酒精中涮2次，用蒸餾水洗滌玻片，然后再用I %氨水涮2次，用蒸餾水洗滌玻片； 步驟6、將骨髓涂片在75 %?100 %梯度稀釋的酒精中脫水，每個梯度脫水30s，再在二甲苯中做2min透明處理后，通過顯微鏡判讀結(jié)果。
7.按照權(quán)利要求6所述的使用方法，其特征在于:步驟3所述的第一抗體為CD41單克隆抗體和⑶61單克隆抗體；第二抗體為通用型⑶41和⑶61免疫組化抗體。
8.按照權(quán)利要求6所述的使用方法，其特征在于:步驟3中，滴加第一抗體后孵育30分鐘，滴加Polymer Helper試劑后孵育20分鐘，滴加第二抗體后孵育20分鐘。
9.按照權(quán)利要求6所述的使用方法，其特征在于:步驟6中，酒精稀釋的梯度為75%—85%— 100%。
10.按照權(quán)利要求1?5任一所述的試劑盒在骨髓涂片異常淋巴細胞染色檢測中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明提供了骨髓涂片微小巨核細胞染色試劑盒及其使用方法，所述試劑盒包括：裝有Polymer Helper試劑的試劑管、裝有PBS磷酸鹽緩沖液的試劑管、裝有抗原修復(fù)液的試劑管、裝有過氧化氫溶液的試劑管、裝有二氨基聯(lián)苯胺染色液的試劑管、裝有蘇木素染色液的試劑管、裝有1％酸酒精的試劑管、裝有1％氨水的試劑管、裝有二甲苯的試劑管、裝有酒精的試劑管、裝有CD41單克隆抗體的試劑管、裝有CD61單克隆抗體的試劑管、裝有通用型CD41和CD61免疫組化抗體的試劑管，分隔并集中包裝這些試劑管的包裝盒。本發(fā)明既克服了形態(tài)細胞涂片以主觀經(jīng)驗評判的缺點，又避免了以往單個CD41抗體染色假陽性對結(jié)果的干擾，提高了檢測的準(zhǔn)確性。
【IPC分類】G01N33-532
【公開號】CN104865377
【申請?zhí)枴緾N201510289582
【發(fā)明人】劉建勇, 劉佳, 張鑫, 王緒華, 梁超, 陳忠, 方國偉, 黃士昂
【申請人】北京海思特臨床檢驗所有限公司
【公開日】2015年8月26日
【申請日】2015年5月29日