專利名稱：細(xì)胞學(xué)定量測定抑制骨吸收藥物生物活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測定抑制骨吸收藥物活性的方法，該方法具體涉及對破骨細(xì)胞抑制性藥物的活性進(jìn)行定量的測定。
背景技術(shù)：
骨質(zhì)疏松是常見病與多發(fā)病，由于該病的發(fā)病率高、并發(fā)癥較為嚴(yán)重、缺乏理想的預(yù)防和治療措施，日益成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)，隨著老齡人群的增加，發(fā)病率亦呈上升趨勢。
骨骼正常形態(tài)和功能的維持依賴于骨質(zhì)合成和骨質(zhì)吸收之間的動(dòng)態(tài)平衡，各種類型骨質(zhì)疏松的發(fā)病原因是不同的，但是基本病理改變卻是相同的，即由于骨質(zhì)吸收超過骨質(zhì)合成從而造成全身性的骨質(zhì)丟失。治療骨質(zhì)疏松的主要手段，一是促進(jìn)骨礦化的藥物，如維生素D及各種種類的鈣制劑等；二是抗骨吸收的藥物，如目前常用雌激素類藥物替代療法、雙膦酸鹽、降鈣素等。隨著骨質(zhì)疏松發(fā)病率上升和人們對其危害性的關(guān)注，開發(fā)更安全有效的骨質(zhì)疏松防治藥物，成為目前十分活躍的研究領(lǐng)域之一，尤其是能夠有效抑制破骨細(xì)胞作用減少骨質(zhì)破壞的藥物已成為當(dāng)前主要的研究目標(biāo)。如近期上市的降鈣素和正在臨床試驗(yàn)中的骨保護(hù)蛋白(Osteoprotegerin，OPG)、抗RANKL單抗denosumab等，均是通過抑制破骨細(xì)胞作用治療骨質(zhì)疏松的新藥。
正常人體骨組織處在不停的骨重建中，骨重建是指去除骨骼局部舊骨代之以形成新骨的過程，是成熟骨組織的一種重要替換機(jī)制，是破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞一個(gè)成對的、相偶聯(lián)的細(xì)胞活動(dòng)過程，骨質(zhì)疏松癥的主要發(fā)病機(jī)制是機(jī)體的骨重建失衡，破骨細(xì)胞的作用在其中起到至關(guān)重要的角色。破骨細(xì)胞來源于血液單核細(xì)胞，進(jìn)入骨組織后在骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌的誘導(dǎo)分化因子作用下分化成熟為破骨細(xì)胞。破骨細(xì)胞的功能為骨吸收，它可以像挖掘機(jī)一樣在骨表面向四周溶解骨組織。破骨細(xì)胞骨吸收主要靠二種作用，一是其與骨基質(zhì)呈刷狀接觸的皺折緣釋放酸性物質(zhì)，將骨表面的鈣磷等無機(jī)鹽溶解；二是與骨基質(zhì)相連的清亮區(qū)將待吸收的骨包圍起來，在褶皺緣釋放溶酶體酶的配合下，將骨有機(jī)基質(zhì)降解。破骨細(xì)胞溶酶體包含的酶重要有組織蛋白酶、基質(zhì)金屬酶、半胱氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶和酸性磷酸酶。這些酶是破骨細(xì)胞功能所必須的酶，同時(shí)也是破骨細(xì)胞的特征，可以用來測定破骨細(xì)胞活性。
抗骨吸收藥物可以在破骨細(xì)胞及其前體細(xì)胞膜表面阻斷活化誘導(dǎo)因子與受體的結(jié)合，或通過抑制破骨細(xì)胞的正常生理代謝，抑制破骨細(xì)胞的形成或抑制破骨細(xì)胞活性來發(fā)揮作用的。這類藥物既可能抑制破骨細(xì)胞前體細(xì)胞或破骨細(xì)胞生長，也可能是抑制破骨細(xì)胞發(fā)揮生物功能所需要酶的活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用細(xì)胞學(xué)定量測定抑制骨吸收藥物生物活性的方法。
本發(fā)明的目的可以通過以下措施來達(dá)到1.建立體外誘導(dǎo)培養(yǎng)破骨細(xì)胞的方法或者并由此方法誘導(dǎo)培養(yǎng)出成熟的破骨細(xì)胞；2.在誘導(dǎo)培養(yǎng)體系或培養(yǎng)體系中加入不同濃度的藥物；3.細(xì)胞生長狀態(tài)或細(xì)胞活性功能狀態(tài)測定；4.待測藥物生物活性單位的計(jì)算。
細(xì)胞生長狀態(tài)及活性功能狀態(tài)的測定方法，可以為MTS[3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-5(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfopheny)-2H-tetrazolium，inner salt]法、MTT(diMethylThiazol-diphenyl Tetrazolium bromide)法、CCK8(Cell Counting Kit-8)法、XTT(2，3-Bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide)法、臺芬蘭染色法及組織蛋白酶、基質(zhì)金屬酶、半胱氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶，抗酒石酸酸性磷酸酶底物反應(yīng)顯色法。并以IC50(50％ inhibitary concentration)值計(jì)算活性單位。藥物是以抑制破骨細(xì)胞產(chǎn)生及成熟破骨細(xì)胞活性功能為主的藥品，如雌激素類藥物、雙膦酸鹽類藥物、降鈣素藥物及骨保護(hù)素等等。
這類藥物既可能抑制破骨細(xì)胞前體細(xì)胞或破骨細(xì)胞生長，也可能是抑制破骨細(xì)胞發(fā)揮生物功能所需要酶的活性。我們分別做了“藥物對破骨前體細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞抑制作用的測定”和“藥物對成熟破骨細(xì)胞活性抑制作用的測定”試驗(yàn)。具體的實(shí)驗(yàn)方法如下；
一藥物對破骨前體細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞抑制作用的測定1建立體外誘導(dǎo)培養(yǎng)破骨細(xì)胞的方法在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)破骨細(xì)胞的前體細(xì)胞RAW264.7，在誘導(dǎo)培養(yǎng)體系中加入誘導(dǎo)劑1，25(OH)2VitD3(1，25-dihydroxyvitamin D3)，1，25(OH)2VitD3的終濃度為10E6-10E9M，通過抗酒石酸酸性磷酸酶染色與骨膜片骨陷窩形成來鑒定破骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)成功。
2在誘導(dǎo)培養(yǎng)體系中加入不同濃度的藥物對細(xì)胞進(jìn)行分組。對照組不加藥物，藥物組在誘導(dǎo)混合培養(yǎng)的同時(shí)加入不同濃度的藥物，用于評價(jià)藥物對破骨前體細(xì)胞分化的抑制作用。具體分組如下1)誘導(dǎo)劑對照組單純誘導(dǎo)劑作用的Raw264.7誘導(dǎo)培養(yǎng)2)藥物組誘導(dǎo)劑作用的Raw264.7誘導(dǎo)培養(yǎng)+按一定比例稀釋的藥物(藥物與誘導(dǎo)劑同時(shí)加入)3細(xì)胞狀態(tài)測定利用細(xì)胞生長狀態(tài)和存活狀態(tài)測定方法如MTT法、MTS法，臺芬蘭染色、CCK-8，XTT等方法，檢測藥物對破骨前體細(xì)胞分化與生長的影響。也可以用破骨細(xì)胞特定酶活性的方法如選用酸性磷酸酶底物對-硝基酚磷酸酯(NPP)，測定各組細(xì)胞的抗酒石酸酸性磷酸酶的活性。
4活性單位的計(jì)算藥物的抑制率(％)＝(誘導(dǎo)劑對照組的測定值-藥物組的測定值)*100/誘導(dǎo)劑對照組的測定值。將所獲得的抑制率為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)的濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)作圖，將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)線形回歸處理，計(jì)算藥物的IC50，以IC50計(jì)算活性單位。
二藥物對成熟破骨細(xì)胞活性抑制作用的測定1誘導(dǎo)培養(yǎng)出成熟的破骨細(xì)胞用1，25(OH)2VitD3在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)破骨前體細(xì)胞RAW264.7，誘導(dǎo)出成熟破骨細(xì)胞，通過抗酒石酸酸性磷酸酶染色與骨膜片骨陷窩形成來鑒定破骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)成功。
2在培養(yǎng)體系中加入不同濃度的藥物對細(xì)胞進(jìn)行分組。對照組不加藥物，藥物組在誘導(dǎo)培養(yǎng)出成熟破骨細(xì)胞后加入不同濃度的藥物，用于評價(jià)藥物對破骨細(xì)胞活性的抑制作用。具體分組如下1)誘導(dǎo)劑對照組單純誘導(dǎo)劑作用的Raw264.7誘導(dǎo)培養(yǎng)2)藥物組誘導(dǎo)劑作用的Raw264.7誘導(dǎo)培養(yǎng)出成熟破骨細(xì)胞+按一定比例稀釋的藥物3細(xì)胞狀態(tài)測定和活性單位的計(jì)算方法同上。
本發(fā)明方法可以對破骨細(xì)胞抑制性藥物的活性進(jìn)行定量測定，具有精確、可靠、方便、經(jīng)濟(jì)和簡單可行等特點(diǎn)?？捎糜诤Y選新的化合物，確定其是否具有抑制破骨細(xì)胞活性并進(jìn)而推斷是否可以治療骨質(zhì)疏松候選藥物。


圖1為實(shí)施例1OPG抑制破骨細(xì)胞前體細(xì)胞RAW264-7生物活性的定量測定(MTS法)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖2為實(shí)施例2 rhOPG-Fc抑制破骨細(xì)胞前體細(xì)胞生物學(xué)活性的定量測定(抗酒石酸酸性磷酸酶活性測定法)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖3為實(shí)施例3rhOPG-Fc抑制成熟破骨細(xì)胞生物學(xué)活性的定量測定(抗酒石酸酸性磷酸酶活性測定法)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果具體實(shí)施方式
實(shí)施例1OPG抑制破骨細(xì)胞前體細(xì)胞RAW264-7生物活性的定量測定(MTS法)骨組織血液單核細(xì)胞在骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌的誘導(dǎo)分化因子作用下分化為成熟破骨細(xì)胞。局部誘導(dǎo)破骨前體細(xì)胞的因子中，以RANKL-RANK系統(tǒng)最為關(guān)鍵。骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌細(xì)胞核因子-κB受體活化因子配基(receptor activator ofNFKB ligand，RANKL)，RANKL與破骨細(xì)胞系細(xì)胞表面的細(xì)胞核因子-κB受體活化因子(receptor activator of NF-κB，RANK)結(jié)合。RANKL一旦與RANK結(jié)合就會刺激前體破骨細(xì)胞分化，及活化成熟的破骨細(xì)胞，引起骨吸收。OPG是一種RANK誘餌受體，其作用是結(jié)合或中和可溶性RANKL，從而阻斷RANKL與功能性受體RANK的結(jié)合。因此OPG相當(dāng)于整個(gè)RANKL系統(tǒng)的制動(dòng)器，抑制了RANKL-RANK系統(tǒng)的作用，從而抑制破骨細(xì)胞分化及活化。RANKL-RANK-OPG形成完整的骨代謝調(diào)控系統(tǒng)，調(diào)節(jié)骨組織的代謝平衡。
OPG是在1997年分別被美國和日本的兩個(gè)研究組同期發(fā)現(xiàn)的，成熟蛋白質(zhì)是含有380個(gè)氨基酸的一種分泌型糖蛋白，其生物活性功能片段為N端的第1-4結(jié)構(gòu)域，即第22-201位氨基酸的部分?；趯PG/RANKL/RANK系統(tǒng)的認(rèn)識和OPG作用的明確，作為一種治療以過度骨吸收為特征疾病，如多發(fā)性骨髓瘤、腫瘤骨轉(zhuǎn)移、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥、激素引起的骨質(zhì)疏松等，OPG的藥用價(jià)值日益引起人們的關(guān)注。我們利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)制備了OPG的22-201位氨基酸功能片斷與人IgGlFc片段的OPG-Fc融合蛋白，并在細(xì)胞和動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中觀察到明顯地抑制破骨細(xì)胞活性和抗骨質(zhì)疏松作用，為了方便、快速、定量的測定OPG-Fc融合蛋白的生物活性，我們采用以上描述的破骨細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)和酶促底物分解顯色的比色測定，建立了OPG-Fc融合蛋白生物活性定量方法。
利用MTS法檢測OPG對RAW264-7分化的影響作用，比較不同劑量和時(shí)間點(diǎn)的差異，具體方法如下1.RAW264-7細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)取96孔板，每孔混合接種破骨細(xì)胞前體細(xì)胞RAW264-7細(xì)胞1000個(gè)及骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0細(xì)胞5000個(gè)，每孔加入破骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化液，即DMEM完全培養(yǎng)基中加入地塞米松和1，25-(OH)2VitD3，終濃度分別為1×10-7mol/L和2×10-8mol/L。共種三塊板，每塊板上的A1孔只加入DMEM完全培養(yǎng)基，作為MTS測定時(shí)的空白對照孔。
同時(shí)平行接種另外一塊96孔板，用作鑒定破骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)是否成功。鑒定的方法采用抗酒石酸酸性磷酸酶染色與骨膜片骨陷窩形成實(shí)驗(yàn)。
2、實(shí)驗(yàn)分組將96孔板破骨細(xì)胞混合培養(yǎng)體系分成9組，每組三個(gè)復(fù)孔。分別加入不同濃度的rhOPG-Fc，濃度為200ug/L，20ug/l，2ug/l，200ng/l，20ng/l，2ng/l，0.2ng/l，0.02ng/l，Ong/l(對照組)，細(xì)胞于37℃，5％CO2繼續(xù)培養(yǎng)。
3、MTS法測定實(shí)驗(yàn)組加入rhOPG-Fc蛋白后，取一塊培養(yǎng)板，加入20μl的MTS工作液，37℃，5％CO2培養(yǎng)4h后，置酶聯(lián)檢測儀上測定光密度(OD)值，檢測波長490nm。分別在96小時(shí)和120小時(shí)再進(jìn)行兩次MTS測定。
4.結(jié)果破骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)鑒定結(jié)果加入誘導(dǎo)劑的混合培養(yǎng)體系中，與單純混合培養(yǎng)不加誘導(dǎo)劑對照組相比，96小時(shí)后TRAP染色陽性，骨膜片骨陷窩形成。證實(shí)誘導(dǎo)培養(yǎng)成功。
MTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。
結(jié)果顯示，rhOPG-Fc的濃度低于0.02ug/L對破骨細(xì)胞前體細(xì)胞基本沒有什么抑制作用，高于0.02ug/L對破骨細(xì)胞前體細(xì)胞出現(xiàn)抑制作用，用作圖法可以計(jì)算出rhOPG-Fc抑制RAW264-7分化的IC50為20ug/L。
以rhOPG-Fc IC50為50ug/L計(jì)算，rhOPG-Fc生物活性為5×10E4 U/g(一般標(biāo)示為50U/mg)。
實(shí)施例2rhOPG-Fc抑制破骨細(xì)胞前體細(xì)胞生物學(xué)活性的定量測定(抗酒石酸酸性磷酸酶活性測定法)1.破骨細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)取24孔板，每孔混合接種破骨細(xì)胞前體細(xì)胞RAW264-7細(xì)胞4000個(gè)及骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0細(xì)胞20000個(gè)，每孔加入破骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化液即DMEM完全培養(yǎng)基中加入地塞米松和1，25-(OH)2VitD3，最終濃度分別為1×10-7mol/L和2×10-8mol/L。共種一塊板。
同時(shí)平行接種另外一塊24孔板，用作鑒定破骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)是否成功。鑒定的方法采用抗酒石酸酸性磷酸酶染色與骨膜片骨陷窩形成實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)96小時(shí)后，抗酒石酸酸性磷酸酶染色顯示，破骨細(xì)胞胞漿呈現(xiàn)玫瑰紅色，胞質(zhì)內(nèi)存在紅色陽性顆粒，核數(shù)眾多。同時(shí)電鏡下觀察骨膜片骨陷窩形成，證實(shí)破骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)成功。
2.實(shí)驗(yàn)分組將24孔板上的破骨細(xì)胞分六組，每組三個(gè)復(fù)孔，混合培養(yǎng)的同時(shí)分別加入不同濃度的rhOPG-Fc，濃度分別為0.0001mg/L，0.001mg/L，0.01mg/L，0.1mg/L，1mg/L，10mg/L。
3.抗酒石酸酸性磷酸酶活性檢測120小時(shí)后，檢測破骨細(xì)胞內(nèi)抗酒石酸酸性磷酸酶的活性。將培養(yǎng)上清棄去，用PBS沖洗兩次，加入細(xì)胞裂解液，每孔150ul，冰上孵育25分鐘，用細(xì)胞鏟將細(xì)胞刮下，轉(zhuǎn)移到微量離心管內(nèi)，10000g，10min離心。收集上清。取100ul，加入抗酒石酸酸性磷酸酶的底物對-硝基酚磷酸酯(NPP)，室溫孵育15-30分鐘，置于酶標(biāo)儀上檢測光密度值(OD值)，測量波長405nm。
4.結(jié)果見圖2。
結(jié)果顯示，rhOPG-Fc對破骨細(xì)胞的分化有明顯的抑制作用，通過作圖法可以計(jì)算出其IC50為0.02mg/L，其活性單位為5×10E4 U/g(一般標(biāo)示為50U/mg)實(shí)施例3rhOPG-Fc抑制成熟破骨細(xì)胞生物學(xué)活性的定量測定。
1.破骨細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)取24孔板，每孔混合接種破骨細(xì)胞前體細(xì)胞RAW264-7細(xì)胞4000個(gè)及骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0細(xì)胞20000個(gè)，每孔加入破骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化液即DMEM完全培養(yǎng)基中加入地塞米松和1，25-(OH)2VitD3，最終濃度分別為1×10-7mol/L和2×10-8mol/L。共種一塊板。
同時(shí)平行接種另外一塊24孔板，用作鑒定破骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)是否成功。鑒定的方法采用抗酒石酸酸性磷酸酶染色與骨膜片骨陷窩形成實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)96小時(shí)后，抗酒石酸酸性磷酸酶染色顯示，破骨細(xì)胞胞漿呈現(xiàn)玫瑰紅色，胞質(zhì)內(nèi)存在紅色陽性顆粒，核數(shù)眾多。同時(shí)電鏡下觀察骨膜片骨陷窩形成，證實(shí)破骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)成功。
2.實(shí)驗(yàn)分組破骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)成功后，將24孔板上的破骨細(xì)胞分八組，每組三個(gè)復(fù)孔每組分別加入不同濃度的rhOPG-Fc，濃度分別為0.0125mg/L，0.025mg/L，0.05mg/L，0.1mg/L，0.2mg/L，0.4mg/L，0.8mg/L。
3.抗酒石酸酸性磷酸酶活性檢測加入rhOPG-Fc24小時(shí)后，檢測破骨細(xì)胞內(nèi)抗酒石酸酸性磷酸酶的活性。將培養(yǎng)上清棄去，用PBS沖洗兩次，加入細(xì)胞裂解液，冰上孵育25分鐘，用細(xì)胞鏟將細(xì)胞刮下，轉(zhuǎn)移到微量離心管內(nèi)，10000g，10min離心。收集上清。取100ul，加入抗酒石酸酸性磷酸酶的底物對-硝基酚磷酸酯(NPP)，室溫孵育15-30分鐘，置于酶標(biāo)儀上檢測光密度值(OD值)，測量波長405nm。
4.結(jié)果見圖3。
結(jié)果顯示，rhOPG-Fc對成熟破骨細(xì)胞的功能有明顯的抑制作用，通過作圖法可以計(jì)算出其IC50為0.18mg/L，其活性單位為5.5×10E3 U/g(一般標(biāo)示為5.5U/mg)。
OPG作用于破骨細(xì)胞生成與成熟以及成熟后發(fā)揮破骨作用的多個(gè)環(huán)節(jié)，rhOPG-Fc抑制破骨細(xì)胞治療骨質(zhì)疏松及骨壞死是其多種作用的綜合體現(xiàn)，在用上述多種方法測定其抑制破骨細(xì)胞功能的活性定量試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，OPG對不同環(huán)節(jié)作用的活性單位是有差異的，由此我們推測OPG對破骨作用的多個(gè)環(huán)節(jié)的作用能力有所不同，例如rhOPG-Fc對破骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的抑制活性為50U/mg，對成熟破骨細(xì)胞功能抑制的活性為5.5U/mg，并由此可以判斷OPG的主要作用機(jī)理在于破骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的抑制，而對成熟破骨細(xì)胞功能抑制的作用機(jī)制位于其次。
權(quán)利要求
1.一種測定藥物抑制骨吸收生物活性的方法，其特征在于所述的方法包括A.建立體外誘導(dǎo)培養(yǎng)破骨細(xì)胞的方法或者用該方法誘導(dǎo)培養(yǎng)出成熟的破骨細(xì)胞；B.在誘導(dǎo)培養(yǎng)體系或培養(yǎng)體系中加入不同濃度的藥物；C.破骨細(xì)胞生長狀態(tài)或細(xì)胞活性功能狀態(tài)測定；D.待測藥物生物活性單位的計(jì)算。
2.如權(quán)利要求1所述的測定藥物抑制骨吸收生物活性的方法，其特征在于細(xì)胞狀態(tài)測定方法為MTS法、MTT法，臺芬蘭染色、CCK-8法、XTT法及抗酒石酸酸性磷酸酶底物反應(yīng)顯色法，并以IC50值計(jì)算活性單位。
3.如權(quán)利要求1所述的測定藥物抑制骨吸收生物活性的方法，其特征在于所述藥物為抑制破骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化成熟或/和抑制成熟破骨細(xì)胞功能活性的藥物。
4.如權(quán)利要求1所述的測定藥物抑制骨吸收生物活性的方法，其特征在于所述的生物活性單位計(jì)算是以IC50作為一個(gè)活性單位。
5.如權(quán)利要求1所述的測定藥物抑制骨吸收生物活性的方法，其特征在于該方法用于對細(xì)胞不同階段的測定中，在誘導(dǎo)培養(yǎng)體系或培養(yǎng)體系中加入藥物，通過藥物對不同階段細(xì)胞抑制能力的活性單位比較，可研究藥物的作用環(huán)節(jié)和機(jī)制。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種測定抑制骨吸收藥物活性的方法，該方法具體涉及對破骨細(xì)胞抑制性藥物的活性進(jìn)行定量的測定。主要步驟為1.建立體外誘導(dǎo)培養(yǎng)破骨細(xì)胞的方法或者并由此方法誘導(dǎo)培養(yǎng)出成熟的破骨細(xì)胞；2.在誘導(dǎo)培養(yǎng)體系或培養(yǎng)體系中加入不同濃度的藥物；3.細(xì)胞生長狀態(tài)或細(xì)胞活性功能狀態(tài)測定；4.待測藥物生物活性單位的計(jì)算。本發(fā)明方法可以對破骨細(xì)胞抑制性藥物的活性進(jìn)行定量測定，具有精確、可靠、方便、經(jīng)濟(jì)和簡單可行等特點(diǎn)?？捎糜诤Y選新的化合物，確定其是否具有抑制破骨細(xì)胞活性并進(jìn)而推斷是否可以治療骨質(zhì)疏松候選藥物。
文檔編號C12N5/08GK101020920SQ20071003825
公開日2007年8月22日 申請日期2007年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月21日
發(fā)明者楊子義, 遲志永, 高景燕, 張晴妮, 徐驥, 朱閃 申請人:上海富純中南生物技術(shù)有限公司