洗兩遍，以去除物理吸附的多余的PP2A酶，最后將制得的固定化PP2A酶電極在4°C下保存?zhèn)溆谩?br>[0049]實(shí)施例5:
[0050]將15ul直徑為300nmN1-1DA磁性納米粒子膠狀懸浮液加入預(yù)裝有150ul結(jié)合緩沖液的微管中，充分混勻后，將該微管放置在磁力架上，以去除微管中的液體，這樣就完成了磁性納米粒子的清洗，按照上述步驟重復(fù)清洗一次，以充分去除非特異性結(jié)合，其中該結(jié)合緩沖液為PH7.5的20mM Tris溶液，溶液含有500mM NaCl和0.09%疊氮化鈉。
[0051]N1-1DA磁性納米粒子充分清洗后，將0.5mll個(gè)單位/ul PP2A酶溶液加入到微管中，以800轉(zhuǎn)/min速轉(zhuǎn)速震搖微管15min，以使磁性納米粒子膠狀懸浮液與基因工程PP2A酶充分進(jìn)行偶聯(lián)吸附結(jié)合，反應(yīng)結(jié)束后將微管放置在磁力架上以去除溶液，制得磁性納米粒子修飾的PP2A酶。用上述結(jié)合緩沖液清洗制得的磁性納米粒子修飾的PP2A酶，以去除為與磁性納米粒子結(jié)合的PP2A酶。
[0052]清洗表面具有工作電極、參比電極和對(duì)電極的PVC膜基體，烘干備用。將0.1g瓊脂糖加入到100ml pH8.4的Tris - HCl緩沖液中，55°C加熱6min，充分溶解后得瓊脂糖溶液。將制得的瓊脂糖溶液室溫下放涼，待該瓊脂糖溶液降溫至25°C時(shí)，將磁性納米粒子修飾的PP2A酶加入到瓊脂糖溶液中并充分混合形成I個(gè)單位/ul酶混合液。上述混合液4°C放置12h后，取3ul滴涂于工作電極表面，室溫下干燥成膜5h。干燥后用雙蒸水沖洗兩遍，以去除物理吸附的多余的PP2A酶，最后將制得的固定化PP2A酶電極在4°C下保存?zhèn)溆谩?br>[0053]實(shí)施例6:
[0054]將20ul直徑為270nmN1-1DA磁性納米粒子膠狀懸浮液加入預(yù)裝有200ul結(jié)合緩沖液的微管中，充分混勻后，將該微管放置在磁力架(Adem Mag SV magnetic support,法國(guó))上，以去除微管中的液體，這樣就完成了磁性納米粒子的清洗，按照上述步驟重復(fù)清洗一次，以充分去除非特異性結(jié)合，其中該結(jié)合緩沖液為PH7.5的20mM Tris溶液，溶液含有500mM NaCl和0.09%疊氮化鈉。
[0055]N1-1DA磁性納米粒子充分清洗后，將0.5mll個(gè)單位/ul PP2A酶溶液加入到微管中，以800轉(zhuǎn)/min速轉(zhuǎn)速震搖微管20min，以使磁性納米粒子膠狀懸浮液與基因工程PP2A酶充分進(jìn)行偶聯(lián)吸附結(jié)合，反應(yīng)結(jié)束后將微管放置在磁力架上以去除溶液，制得磁性納米粒子修飾的PP2A酶。用上述結(jié)合緩沖液清洗制得的磁性納米粒子修飾的PP2A酶，以去除為與磁性納米粒子結(jié)合的PP2A酶。
[0056]清洗表面具有工作電極、參比電極和對(duì)電極的PVC膜基體，烘干備用。將0.2g瓊脂糖加入到200ml pH8.0的Tris - HCl緩沖液中，60°C加熱4min，充分溶解后得瓊脂糖溶液。將制得的瓊脂糖溶液室溫下放涼，待該瓊脂糖溶液降溫至27°C時(shí)，將磁性納米粒子修飾的PP2A酶加入到瓊脂糖溶液中并充分混合形成I個(gè)單位/ul酶混合液。上述混合液5°C放置Ilh后，取2.5ul滴涂于工作電極表面，室溫下干燥成膜6h。干燥后用雙蒸水沖洗兩遍，以去除物理吸附的多余的PP2A酶，最后將制得的固定化PP2A酶電極在4°C下保存?zhèn)溆谩?br>[0057]實(shí)施例7:
[0058]取90ul不同濃度的大田軟海綿酸標(biāo)準(zhǔn)液(0.l，0.2，0.4，0.8，l，2，4，10，20yg/L，
西格瑪奧德里奇公司，美國(guó))和10ul50mM對(duì)硝基苯磷酸二鈉鹽底液充分混合后滴加在工作電極上，室溫下育溫20min使之形成反應(yīng)層，利用循環(huán)伏安法或計(jì)時(shí)電流法檢測(cè)上述生物傳感器中電流的變化，通過測(cè)定電流值來評(píng)價(jià)試樣中大田軟海綿酸的濃度。由本實(shí)施例可的PP2A酶活性抑制率(％)與標(biāo)準(zhǔn)液中大田軟海綿酸濃度成良好的相關(guān)性(圖4)，檢測(cè)時(shí)，重復(fù)以上步驟，通過測(cè)定加入檢測(cè)樣品時(shí)，電流值的變化來評(píng)價(jià)樣品中大田軟海綿酸的濃度。利用本發(fā)明中的固定化PP2A酶?jìng)鞲衅鳈z測(cè)水產(chǎn)品大田軟海綿酸，其檢出限低于l.0Oyg/L、重現(xiàn)性RSD〈5%，檢測(cè)耗時(shí)小于0.5h。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種用于檢測(cè)大田軟海綿酸的基于磁性納米粒子修飾的酶?jìng)鞲衅鳎ń^緣性基體、形成在該基體上的含有工作電極、參比電極和對(duì)電極的電極系統(tǒng)，其特征在于，所述工作電極上固定有生物酶層，該生物酶層包括磁性納米粒子修飾的蛋白磷酸酶2A (PP2A)以及電子傳遞體，所述磁性納米粒子的直徑為250nm?350nm。2.如權(quán)利要求1所述的酶?jìng)鞲衅鳎涮卣髟谟?，所述磁性納米粒子為鎳修飾磁性納米粒子，而所述PP2A酶蛋白質(zhì)鏈氨基末端修飾有能與所述鎳修飾磁性納米粒子共軛鏈接的hexa—His。3.如權(quán)利要求2所述的酶?jìng)鞲衅?，其特征在于，所述鎳修飾磁性納米粒子的直徑為300nmo4.如權(quán)利要求1所述的酶?jìng)鞲衅?，其特征在于，所述電子傳遞體為對(duì)硝基苯磷酸二鈉鹽。5.如權(quán)利要求1或2或4所述的酶?jìng)鞲衅?，其特征在于，所述參比電極為Ag/AgCl電極，對(duì)電極為石墨電極。6.一種如權(quán)利要求2所述的用于檢測(cè)大田軟海綿酸的基于磁性納米粒子修飾的酶?jìng)鞲衅鞯闹苽浞椒ǎ涮卣髟谟?，首先將鎳修飾的磁性納米粒子與所述PP2A酶偶聯(lián)吸附連接形成磁性納米粒子修飾的PP2A酶，然后將該磁性納米粒子修飾的PP2A酶通過光交聯(lián)法或瓊脂糖包埋法固定在所述工作電極上。7.如權(quán)利要求6所述的酶?jìng)鞲衅鞯闹苽浞椒ǎ涮卣髟谟?，所述鎳修飾的磁性納米粒子與所述PP2A酶偶聯(lián)吸附連接包括以下步驟: (1)將15?30ul的N1-1DA磁性納米粒子膠狀懸浮液加入到預(yù)裝有150?300ul結(jié)合緩沖液的容器中，并用所述結(jié)合緩沖液清洗，以去除非特異性結(jié)合，所述結(jié)合緩沖液的PH為8-8.5，含有Tris-HCl、NaCl以及疊氮化鈉； (2)將I?2個(gè)單位PP2A酶/uI的PP2A酶溶液加入到所述容器中，以600?1000轉(zhuǎn)/min的轉(zhuǎn)速震搖所述容器10-20min，以使所述磁性納米粒子與所述PP2A酶充分偶聯(lián)吸附結(jié)合形成磁性納米粒子修飾的PP2A酶，所述PP2A酶溶液與所述N1-1DA磁性納米粒子膠狀懸浮液的體積比為50?100:3，所述I單位PP2A酶為在25°C下Imin內(nèi)裂解所述對(duì)硝基苯磷酸二鈉鹽所需的酶量； (3)用所述結(jié)合緩沖液清洗所述磁性納米粒子，以去除未結(jié)合的所述PP2A酶。8.如權(quán)利要求7所述的酶?jìng)鞲衅鞯闹苽浞椒?，其特征在于，所述結(jié)合緩沖液為pH7.5的20mM Tris溶液，該Tris溶液含有500mM NaCl和0.09%疊氮化鈉。9.如權(quán)利要求6所述的酶?jìng)鞲衅鞯闹苽浞椒?，其特征在于，所述光交?lián)法包括以下步驟: (1)將所述磁性納米粒子修飾的PP2A酶溶解在pH8?8.5緩沖液A中制成I?2個(gè)單位/ul的固定酶溶液，在該酶溶液中加入PVA-AWP，所述PP2A酶與所述PVA-AWP的質(zhì)量比為I?2:1，均質(zhì)后形成固定溶液，所述緩沖液A包含Tris - HCl、EDTA以及MgCl2，所述I單位磁性納米粒子修飾的PP2A酶為在25°C下Imin內(nèi)裂解所述對(duì)硝基苯磷酸二鈉鹽所需的酶量； (2)然后滴加2.5?3.5ul所述固定溶液至工作電極表面，3?5°C下在功率為12?15W的日光燈下照射3?6h ; (3)光照后，3?5°C下干燥12?24h，干燥后用雙蒸水沖洗，以去除物理吸附的多余的磁性納米粒子修飾的PP2A酶，最后將制得的固定化磁性納米粒子修飾的PP2A酶電極在4°C下保存?zhèn)溆谩?0.如權(quán)利要求6所述的酶?jìng)鞲衅鞯闹苽浞椒ǎ涮卣髟谟?，所述瓊脂糖包埋法包括以下步驟: (1)將0.1?0.2g瓊脂糖加入到50?100ml pH為8?8.7的Tris - HCl緩沖液中，55?65°C加熱4?6min，充分溶解后得瓊脂糖溶液，待該瓊脂糖溶液降溫至20?27°C時(shí)，將磁性納米粒子修飾的PP2A酶加入到瓊脂糖溶液中并充分混合形成混合液，該混合液中磁性納米粒子修飾的PP2A酶的濃度為I?2個(gè)單位PP2A酶/ul，其中所述I單位磁性納米粒子修飾的PP2A酶為在25°C下Imin內(nèi)裂解所述對(duì)硝基苯磷酸二鈉鹽所需的酶量； (2)上述混合液3?5°C放置11?13h后，取2.5?3.5ul滴涂于所述工作電極表面，室溫下干燥成膜5?6h ; (3)干燥后用雙蒸水沖洗，以去除物理吸附的多余的PP2A酶，最后將制得的固定化磁性納米粒子修飾的PP2A酶電極在4°C下保存?zhèn)溆谩?br>【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)大田軟海綿酸的基于磁性納米粒子修飾的酶?jìng)鞲衅?，包括絕緣性基體、形成在該基體上的含有工作電極、參比電極和對(duì)電極的電極系統(tǒng)，所述工作電極上固定有生物酶層，該生物酶層包括磁性納米粒子修飾的蛋白磷酸酶2A（PP2A）以及電子傳遞體，所述磁性納米粒子的直徑為250nm～350nm，還涉及該種酶?jìng)鞲衅鞯闹苽浞椒?。與普通的酶?jìng)鞲衅飨啾?，?jīng)磁性納米粒子修飾的PP2A酶有效提高了工作電極表面PP2A酶的負(fù)載率，使得該酶?jìng)鞲衅鞯碾娏黜憫?yīng)值比普通PP2A酶?jìng)鞲衅魈岣?0倍以上，在用于檢測(cè)水產(chǎn)品大田軟海綿酸時(shí)，檢出限低于0.20μg/L、重現(xiàn)性RSD＜5%，檢測(cè)耗時(shí)小于0.5h。
【IPC分類】G01N27/26, G01N27/327
【公開號(hào)】CN104977339
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410135515
【發(fā)明人】袁高峰, 孫海燕, 方旭波, 金標(biāo)旺
【申請(qǐng)人】浙江海洋學(xué)院
【公開日】2015年10月14日
【申請(qǐng)日】2014年4月4日