以多糖作為信號(hào)放大媒介體的核酸電化學(xué)生物分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及以多糖作為信號(hào)放大媒介體的核酸電化學(xué)生物分析方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展以及人們對(duì)生活質(zhì)量要求的逐步提高與追求，核酸分析技術(shù)已經(jīng)逐漸成為環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品安全、醫(yī)藥衛(wèi)生，以及生物技術(shù)等領(lǐng)域的主要分析手段。以納米粒子為基礎(chǔ)的電化學(xué)分析技術(shù)成為了不可或缺的技術(shù)核心，而以此為基礎(chǔ)發(fā)展出來的微量的和超靈敏的分析技術(shù)手段具有相當(dāng)廣泛的應(yīng)用前景。
[0003]傳統(tǒng)的核酸定量分析方法主要包括定磷法、定糖法、分光光度法、熒光光譜法、紫外吸收光譜法、高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法以及共振光散射法等，但都具有靈敏度低、選擇性差、設(shè)備復(fù)雜或檢測(cè)成本高等缺點(diǎn)，而電化學(xué)方法用于核酸的定量分析時(shí)具有靈敏度高、檢測(cè)成本低、檢測(cè)周期短等優(yōu)良特性。
[0004]傳統(tǒng)的信號(hào)放大策略主要包括酶促放大法、目標(biāo)循環(huán)法、滾環(huán)擴(kuò)增放大法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增法、以及用納米粒子進(jìn)行標(biāo)記等。這些方法雖然都能顯著地降低核酸電化學(xué)生物分析的檢測(cè)下限，但都具有操作過程復(fù)雜、檢測(cè)成本高、費(fèi)時(shí)、費(fèi)力等缺陷。多糖作為普遍存在的生物原料，具有方便易得，成本低廉，綠色環(huán)保等特點(diǎn)，但對(duì)其開發(fā)并使之應(yīng)用于生物分析領(lǐng)域的努力還處于萌芽階段。在本方法中，結(jié)合多糖生物原料的方便易得和成本低廉，以及納米粒子分析的高靈敏特點(diǎn)，開發(fā)了一種全新的核酸電化學(xué)生物分析方法。該方法簡(jiǎn)便，便利，成本低，靈敏度高，應(yīng)用范圍廣，具有十分重要的意義。
[0005]文獻(xiàn)10.1021/ac800334y公布了一種以多糖為模板形成銀納米線用于實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸的超靈敏電學(xué)檢測(cè)的方法。該方法首先在芯片表面刻劃出一系列交叉指型電極，然后利用3-氨丙基三乙氧基硅烷以及對(duì)苯二異硫氰酸酯將芯片表面活化，將修飾有氨基末端的肽核酸連接到芯片表面作為捕獲探針，與待測(cè)寡核苷酸片段雜交后，利用鋯離子的配位化學(xué)作用將果膠分子連接到雜交形成的異源雙螺旋骨架上，用高碘酸鈉將果膠分子中的鄰位羥基氧化成醛基，生成的醛基將銀離子還原成銀納米粒子沉積在交叉指型電極間，通過檢測(cè)電極間導(dǎo)電性的變化來實(shí)現(xiàn)對(duì)特異性寡核苷酸片段的定量檢測(cè)。該方法的檢測(cè)下限可以達(dá)到1.0fM，但其交叉指型電極制造過程復(fù)雜，捕獲探針固定化過程相當(dāng)繁瑣，其芯片也不能重復(fù)利用，故在實(shí)際應(yīng)用時(shí)有一定的局限性；此外，在實(shí)際檢測(cè)時(shí)，其檢測(cè)下限和檢測(cè)結(jié)果的可重現(xiàn)性也不是相當(dāng)理想。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為解決現(xiàn)有技術(shù)中信號(hào)放大方法所存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種以多糖作為信號(hào)放大媒介體的高靈敏核酸電化學(xué)生物分析方法。
[0007]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)解決方案為:一種以多糖作為信號(hào)放大媒介體的高靈敏核酸電化學(xué)生物分析方法，包括以下步驟:
[0008]步驟一、將金電極表面打磨至鏡面，清洗干凈后，在水虎魚酸中浸泡，清洗后，在稀硫酸中對(duì)電極表面進(jìn)行電化學(xué)預(yù)處理，清洗干凈后用氮?dú)獯蹈桑?br>[0009]步驟二、將修飾有巰基末端的肽核酸的水溶液滴加到上述預(yù)處理過的金電極表面，進(jìn)行反應(yīng)，將殘余的肽核酸清洗干凈，用巰基己醇對(duì)電極表面進(jìn)行封閉，封閉結(jié)束后沖洗干凈，用氮?dú)獯蹈桑?br>[0010]步驟三、將含待測(cè)寡核苷酸片段的溶液滴加到步驟二所得的電極表面，雜交反應(yīng)結(jié)束后，將未參與雜交反應(yīng)的寡核苷酸片段清洗干凈，用氮?dú)獯蹈桑?br>[0011]步驟四、將步驟三所得電極表面浸泡在含過渡金屬離子的溶液中，反應(yīng)完成后清洗干凈，將多糖滴加到電極表面，反應(yīng)結(jié)束后清洗干凈，用氮?dú)獯蹈桑?br>[0012]步驟五、將步驟四所得電極表面浸泡在強(qiáng)氧化性試劑中，反應(yīng)結(jié)束后清洗干凈，將銀離子溶液滴加到電極表面，反應(yīng)結(jié)束后清洗干凈，用氮?dú)獯蹈桑?br>[0013]步驟六、將步驟五所得電極表面沉積的銀納米粒子用電化學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)。
[0014]步驟一中所述的電極表面依次用0.3微米和0.05微米的氧化鋁懸浮液打磨，所述水虎魚酸中濃硫酸與過氧化氫的體積比為3:1，浸泡時(shí)間為lOmin，所用稀硫酸的濃度為0.5M，所述電化學(xué)預(yù)處理采用循環(huán)伏安法，其掃描電位范圍為-0.2?1.5V。
[0015]步驟二中所述的肽核酸的水溶液的濃度為1.0uM,反應(yīng)時(shí)間為90min，巰基己醇濃度為2.0mM，封閉時(shí)間為45min。
[0016]步驟三中所述的待測(cè)寡核苷酸片段的溶液中溶劑為pH=8.0的TE緩沖液，雜交反應(yīng)時(shí)間為 45 ?120min，其中，TE 緩沖液為:10mM Tris-HCl+lmM EDTA0
[0017]步驟四中所述過渡金屬離子為鋯離子，其濃度為5mM，浸泡時(shí)間為45min，所述的多糖為飽和多聚半乳糖醛酸鉀，反應(yīng)時(shí)間為60min。
[0018]步驟五中所述強(qiáng)氧化性試劑為高碘酸鈉，其濃度為25mM，浸泡時(shí)間為120min，所述銀離子溶液為銀氨溶液，其濃度為7?17mM，反應(yīng)時(shí)間為60min。
[0019]步驟六中所述電化學(xué)方法為差分脈沖伏安法，其掃描電位范圍為-0.15?0.25V。
[0020]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:
[0021]①本發(fā)明的以多糖類化合物作為信號(hào)放大媒介體的高靈敏、高選擇性的核酸電化學(xué)生物分析方法，通過采用具有高選擇性和高雜交效率的肽核酸通過自組裝的方式固定在電極表面作為捕獲探針，提高了核酸電化學(xué)生物分析方法的選擇性，簡(jiǎn)化了捕獲探針的固定化過程，并且可以實(shí)現(xiàn)金電極的重復(fù)利用，有利于降低檢測(cè)成本；
[0022]②通過利用過渡金屬離子的配位化學(xué)作用，將多糖類化合物連接到雜交反應(yīng)所形成的異源雙螺旋骨架上，接著在多糖的作用下實(shí)現(xiàn)金屬納米粒子的原位沉積，簡(jiǎn)化了電化學(xué)生物分析方法所面臨的信號(hào)放大難題，同時(shí)也可以降低檢測(cè)成本；
[0023]③通過利用電化學(xué)分析技術(shù)檢測(cè)電極表面沉積的金屬納米粒子，可實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸樣品的高靈敏檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)間短，成本低，設(shè)備簡(jiǎn)單。
【附圖說明】
[0024]圖1是本發(fā)明核酸電化學(xué)生物分析方法的制備過程示意圖。(其中，A為在預(yù)處理過的電極表面固定化肽核酸捕獲探針，用巰基己醇對(duì)電極表面進(jìn)行封閉為捕獲探針與待測(cè)寡核苷酸片段雜交；C為在鋯離子的作用下將多糖分子引入到異源雙螺旋骨架上；D為用高碘酸鈉將多糖氧化；E為銀納米粒子的沉積；F為用差分脈沖伏安法檢測(cè)電極表面沉積的銀納米粒子。)
[0025]圖2是本發(fā)明核酸電化學(xué)生物分析方法的差分脈沖伏安圖。
[0026]圖3是本發(fā)明表征電極表面沉積的銀納米粒子形貌的掃描電子顯微鏡圖。
[0027]圖4是本發(fā)明不同雜交反應(yīng)時(shí)間對(duì)本發(fā)明核酸電化學(xué)生物分析方法檢測(cè)結(jié)果的影響。
[0028]圖5是本發(fā)明不同銀離子濃度對(duì)本發(fā)明核酸電化學(xué)生物分析方法檢測(cè)結(jié)果的影響。
[0029]圖6(A)是本發(fā)明采用本發(fā)明核酸電化學(xué)生物分析方法檢測(cè)不同濃度的寡核苷酸片段的響應(yīng)特性。
[0030]圖6(B)是本發(fā)明相應(yīng)寡核苷酸片段濃度下差分脈沖伏安響應(yīng)峰電流大小的校準(zhǔn)曲線。
[0031]圖7是本發(fā)明采用本發(fā)明核酸電化學(xué)生物分析方法檢測(cè)不同寡核苷酸序列的響應(yīng)信號(hào)大小的比較(其中，A是完全互補(bǔ)配對(duì)的寡核苷酸片段，B是具有單堿基錯(cuò)配的寡核苷酸片段，C為完全不互補(bǔ)配對(duì)的寡核苷酸片段)。
【具體實(shí)施方式】
[0032]實(shí)施例1:如附圖1中所示的A，B, C，D，E，F(xiàn)步驟，制備本發(fā)明核酸電化學(xué)生物分析方法。
[0033](I)電極表面的預(yù)處理及捕獲探針的固定化
[0034]首先，將電極表面依次用粒徑為0.3微米和0.05微米的氧化鋁懸浮液打磨至鏡面，清洗干凈后，在水虎魚酸中化學(xué)氧化處理10分鐘，在超純水中超聲清洗后，在0.5M的稀硫酸中用循環(huán)伏安法在-0.2?1.5V的電位范圍內(nèi)對(duì)電極表面進(jìn)行電化學(xué)預(yù)處理，進(jìn)一步除去電極表面吸附的雜質(zhì)并對(duì)電極表面粗糙度進(jìn)行優(yōu)化。將電極表面用超純水超聲清洗后，用氮?dú)獯蹈伞Ｔ陔姌O表面滴加1.0uM的修飾有巰基末端的肽核酸捕獲探針(序列:5，-HS-(CH2)11-AAC CAT ACA ACC TAC TAC CTC A-3’)，在 37°C下靜置約 90min，沖洗干凈后，在37 C條件下，將電極表面在2mM疏基己醇中浸泡約45min，封閉結(jié)束后將電極表面沖洗干凈用氮?dú)獯蹈伞?br>[0035](2)雜交
[0036]將0.1pM待測(cè)寡核苷酸片段(序列:5’-TGA GGT AGT AGG TTG TAT GGT T-3’)滴加到電極表面，37°C下反應(yīng)約90min，反應(yīng)完成后，用pH=8.0的TE緩沖液(1mM Tris-HCl+lmMEDTA)將電極表面清洗干凈用氮?dú)獯蹈伞?br>[0037](3)多糖分子的引入及銀納米粒子的沉積
[0038]將電極表面浸泡在5mM鋯離子溶液中，37°C下反應(yīng)約45min，將電極表面沖洗干凈后用氮?dú)獯蹈?。?2mg/mL的多聚半乳糖醛酸鉀溶液滴加到電極表面，37°C下反應(yīng)約60min，將電極表面清洗干凈后用氮?dú)獯蹈?。將電極表面浸入25mM高碘酸鈉溶液中，室溫下放置約120min后將電極表面清洗干凈，用氮?dú)獯蹈伞?3mM銀氨溶液滴加到上述電極表面，室溫下放置約60min，將電極表面清洗干凈后用氮?dú)獯蹈伞?br>[0039](4)電化學(xué)檢測(cè)
[0040]用飽和甘汞電極作為參比電極，用鉬絲作為對(duì)電極，在1.0M氯化鉀溶液中用差分脈沖伏安法對(duì)電極表面沉