一種用于診斷乳腺癌的三聯(lián)標(biāo)志物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及臨床診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種用于診斷乳腺癌的三聯(lián)標(biāo)志 物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳腺癌是來源于乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，其發(fā)病率一直呈上升趨勢。據(jù)世 界衛(wèi)生組織估計，全球每年約有140萬婦女被確診患乳腺癌，40萬人死于乳腺癌。我國發(fā) 布的《2013年中國腫瘤登記年報》指出，乳腺癌發(fā)病位居女性惡性腫瘤首位，占所有癌癥總 數(shù)的16. 97% ;大部分乳腺癌患者在就診時已發(fā)展到晚期，手術(shù)后輔以化療，治療效果欠佳。 關(guān)于乳腺癌診斷方法，主要依賴于影像學(xué)診斷和乳房腫塊的觸摸自查，目前尚無有效地針 對乳腺癌的分子診斷檢測方法，如乳腺癌原發(fā)灶的激素受體（ER、PR受體）的檢測因染色的 差異性和主觀程度較大，診斷特異性并不高?，F(xiàn)有文獻(xiàn)已報道多種乳腺癌相關(guān)血清標(biāo)志物， 但這些標(biāo)志物單獨(dú)用于診斷及療效預(yù)測評價時，其敏感性及特異性較低。因此，如何從種類 繁多的腫瘤標(biāo)志物中進(jìn)行恰當(dāng)?shù)倪x擇和組合，提高乳腺癌標(biāo)志物的臨床診斷價值和對新輔 助化療療效的預(yù)測、評估具有重要的臨床意義。
[0003] 煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（Nicotinamide phosphoribosyltransferase，NAMPT) 是細(xì)胞內(nèi)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD)生物合成的限速酶，具有多種生物效應(yīng)。在煙酸胺 合成NAD的過程中，Nampt催化5-磷酸核糖基-1-焦磷酸鹽（PRPP)轉(zhuǎn)移磷酸核糖基團(tuán)給 煙酸胺形成煙酰胺單核苷酸（NMN)和焦磷酸鹽（PPi)，然后NMN再通過煙酰胺單核苷酸腺 苷酰轉(zhuǎn)移酶（Nmnat)催化生成NAD。血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種重要的血管生成因子，它具有雙重功能：一方面通過其受體直接刺激 血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)產(chǎn)生蛋白水解酶、間質(zhì)膠原酶和組織因子來促進(jìn)血管形成；另一 方面，提高血管通透性，促進(jìn)血漿蛋白、促進(jìn)血漿蛋白、纖維蛋白原外滲導(dǎo)致腫瘤聞質(zhì)水腫， 引起細(xì)胞外基質(zhì)改變，從而為腫瘤浸潤及轉(zhuǎn)移提供適合的基礎(chǔ)。近年來國外許多學(xué)者在多 種惡性腫瘤組織中檢測到VEGF的高表達(dá)，并推測其與腫瘤生長和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。人類表皮 生長因子受體 2 (Human epidermal growth factor receptor-2，HER2)屬于人類表皮生長 因子受體EGFR家族的成員，HER2蛋白的過度表達(dá)與乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、肝 癌等十余種惡性腫瘤密切相關(guān)。J1ER2在乳腺癌細(xì)胞的過度表達(dá)，預(yù)示腫瘤惡性程度高，術(shù)后 易發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。檢測腫瘤抗原J1ER2蛋白是否高表達(dá)，對腫瘤的鑒別、診斷、治療和預(yù)后 判斷均有重要意義。
[0004] 中國期刊《中國腫瘤外科雜志》2014年8月第4期刊登的論文《煙酰胺磷酸核糖 基轉(zhuǎn)移酶在乳腺癌中的表達(dá)及臨床意義》，研宄發(fā)現(xiàn)Nampt在乳腺癌中高表達(dá)，其表達(dá)程度 與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)。隨著乳腺癌惡性程度及分期的增高，Nampt的表 達(dá)也隨之增加，這表明Nampt可能參與了乳腺癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程，是乳腺癌進(jìn)展過程中 的重要蛋白，可用來輔助判定乳腺癌的分期或惡性程度。大連醫(yī)科大學(xué)2008年碩士學(xué)位論 文《人乳腺癌中珠蛋白hMAM mRNA、血管內(nèi)皮生長因子VEGF的表達(dá)及臨床意義的研宄》，其 發(fā)現(xiàn)50例乳腺組織中VEGF蛋白的表達(dá)率與乳腺癌腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況和?M分期 密切相關(guān)，與乳癌組織中C-erbB-2表達(dá)相關(guān)，提示VEGF蛋白的表達(dá)在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程 中起著重要的作用，與乳腺癌的浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，VEGF可與人乳腺珠蛋白mRNA -道作 為判斷乳腺癌預(yù)后的參考指標(biāo)。目前，關(guān)于NAMPT、VEGF和HER2三者聯(lián)合用于乳腺癌的診 斷以提高乳腺癌的診斷率還未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶、血管內(nèi) 皮生長因子、人類表皮生長因子受體2三者聯(lián)合作為診斷的標(biāo)志物的用途。
[0006] 本發(fā)明的再一的目的是，提供血管煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶、內(nèi)皮生長因子、人類 表皮生長因子受體2或其特異性抗體的用途。
[0007] 本發(fā)明的另一的目的是，提供一種用于檢測乳腺癌的診斷試劑盒。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0009] 煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶、血管內(nèi)皮生長因子、人類表皮生長因子受體2三者聯(lián) 合作為診斷乳腺癌的標(biāo)志物中的應(yīng)用。
[0010] 為實(shí)現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0011] 煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶、血管內(nèi)皮生長因子、人類表皮生長因子受體2或其特 異性抗體的用途，用于制備檢測乳腺癌的診斷試劑或試劑盒。所述的檢測可以是血清檢測。
[0012] 本發(fā)明所用的樣本除血清外，還可以是乳腺癌組織、乳腺癌患者血液、血漿、體液 或細(xì)胞中的一種或多種。
[0013] 所述的診斷試劑盒包含測定血清中NAMPT、VEGF及HER2含量的試劑。
[0014] 所述測定血清中NAMPT含量的試劑為NAMPT的特異性抗體；所述測定血清中VEGF 含量的試劑為VEGF的特異性抗體；所述的測定血清中HER2含量的試劑為HER2的特異性抗 體。
[0015] 在獲知本發(fā)明后，還可以利用多種免疫學(xué)相關(guān)方法來檢測樣本中NAMPT、VEGF或 J1ER2的含量，這些方法均包含在本發(fā)明中。
[0016] 所述的試劑盒中還包括免疫組化試劑。
[0017] 所述的免疫組化試劑包括：顯色試劑、二甲苯、乙醇、H202甲醇液、抗原修復(fù)液、封 閉液、PBS、中性樹脂。
[0018] 為實(shí)現(xiàn)上述第三個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0019] 一種用于檢測乳腺癌的診斷試劑盒，所述的試劑盒包含測定血清中NAMPT、VEGF 及HER2含量的試劑。
[0020] 所述測定血清中NAMPT含量的試劑為NAMPT的特異性抗體；所述測定血清中VEGF 含量的試劑為VEGF的特異性抗體；所述的測定血清中HER2含量的試劑為HER2的特異性抗 體。
[0021] 對于基因/蛋白表達(dá)量的測定，可以使用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)方法。一般基因/蛋 白表達(dá)量典型的是將mRNA量或者蛋白質(zhì)量作為標(biāo)準(zhǔn)來測定。本發(fā)明中也可以同樣的將 NAMPT、VEGF或HER2蛋白/基因的mRNA量或者蛋白質(zhì)量作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行相應(yīng)的表達(dá)量的測 定。
[0022] 本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：
[0023] NAMPT、VEGF和HER2單一診斷乳腺癌的陽性率分別為54%、65%和60%，三者單 一診斷乳腺癌的陽性低且差異不顯著；而三者聯(lián)合診斷乳腺癌的陽性率為90%。采用酶聯(lián) 免疫吸附試驗(yàn)檢測乳腺癌患者手術(shù)前后血清中的表達(dá)情況，檢測結(jié)果表明：乳腺癌患者手 術(shù)前的NAMPT、VEGF和HER2是健康對照組的6. 64、1. 76和2. 52倍（P值均〈0. 001)，手術(shù) 后NAMPT、VEGF和HER2都有下降。
【附圖說明】
[0024] 附圖1為NAMPT、VEGF和HER2在乳腺組織標(biāo)本中免疫組織化學(xué)圖。
[0025] 附圖2為NAMPT、VEGF和HER2在乳腺癌患者手術(shù)前后外周靜脈血中濃度。其中 CTL為正常對照；BN為良性乳腺腫瘤；M-BO為乳腺癌術(shù)前；M-AO為乳腺癌術(shù)后。
[0026] 附圖3為NAMPT、VEGF和HER2的相關(guān)性分析。
[0027] 附圖4為NAMPT、VEGF和HER2手術(shù)前后的血漿濃度與組織染色相關(guān)性比較。