專利名稱：乳腺癌分子標(biāo)志物miR-30c-1-3p的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腫瘤診斷領(lǐng)域，具體來說涉及ー種乳腺癌分子標(biāo)志物miR-30c-l-3p，其可應(yīng)用于乳腺癌高危人群的篩選、乳腺癌的鑒定、乳腺癌治療狀況的監(jiān)測和乳腺癌預(yù)后的監(jiān)測等領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
microRNA (miRNA)是近年來的研究熱點(diǎn),它是ー種廣泛存在于真核生物中的單鏈小分子RNA，不具編碼功能，但它能夠結(jié)合于基因序列的側(cè)翼區(qū)域阻遏或抑制靶mRNA的翻譯，具有高度的保守性、時(shí)序性和組織特異性。2008年Mitchell等首先發(fā)現(xiàn)許多miRNA穩(wěn)定存在于血漿中，其中miR-141的水平可作為前列腺癌診斷標(biāo)志物。隨后的研究又發(fā)現(xiàn)了結(jié)腸癌診斷標(biāo)志物miR-92a和肝損傷監(jiān)控標(biāo)志物miR-122。乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，近50年來發(fā)病率在全球呈上升趨勢，其發(fā)·病率占全身各種惡性腫瘤的7-10%，且發(fā)病人群呈年輕化趨勢。目前，乳腺癌的臨床診斷方式主要有以下幾種乳腺鑰靶攝片、紅外乳腺掃描、活組織病理檢查、雌激素和孕激素受體測定及超聲顯像。乳腺鑰靶攝片具有簡單、方便、無創(chuàng)傷及費(fèi)用低等特點(diǎn)，是乳腺癌檢查的首選方法之一，它通過顯示腫塊的大小、數(shù)目、位置、密度、邊緣、形態(tài)、有無鈣化以及鈣化的形態(tài)、大小、數(shù)目、分步以及周圍的暈環(huán)、皮膚改變等提供定位及定性征象并判斷病變的性質(zhì)；其局限性是(1)當(dāng)患者的乳腺腺體豐富時(shí)與病變重疊，不能顯示病變的全貌，甚至出現(xiàn)假陰性，(2)對于接近胸壁和致密性乳腺的小癌灶容易漏診，(3)有時(shí)不能提供明確的定性診斷。紅外乳腺掃描操作簡便、直觀、無損傷，與鑰靶攝片有互補(bǔ)的作用，能直接顯示乳腺血管的走行分步及管徑改變，但因其不能顯示腫瘤的內(nèi)部結(jié)構(gòu)及周圍組織所以診斷符合率很低，對乳腺上部及近胸壁的癌灶易于漏診?；罱M織病理檢查因其創(chuàng)傷性、復(fù)雜性不能作為初篩的手段，但是它是乳腺癌確診的金標(biāo)準(zhǔn)，一般與影像學(xué)技術(shù)連用，在對患者進(jìn)行治療前均應(yīng)獲得病理學(xué)診斷依據(jù)。人乳腺癌組織中，有60 70%的組織存在雌激素受體(ER)和/或孕激素受體(PR)，其存在狀況與診斷、治療及判斷預(yù)后有夫，衛(wèi)生部發(fā)布的乳腺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)中所要求的乳腺癌病理報(bào)告至少應(yīng)包括ER、PR和HER-2 (人類表皮生長因子受體_2)；其局限性較大主要表現(xiàn)在(1)技術(shù)和設(shè)備要求高，標(biāo)本量大，故對測定非切除標(biāo)本或腫塊較小的早期乳腺癌難以滿足需要，(2)受體對溫?zé)針O不穩(wěn)定，標(biāo)本必需新鮮，儲存運(yùn)輸不便，
(3)腫瘤組織中受體分布不均勻，邊緣部位含量較中央部位高，故需混合取材。超聲成像對一些缺乏典型征象的實(shí)性良惡性腫塊有較高的誤診率，且不能發(fā)現(xiàn)5_以下的腫塊。近年來的研究表明，乳腺癌和miRNA密切相關(guān)，它們可能參與腫瘤的生成，所以對腫瘤的治療也可能有相應(yīng)的作用。與乳腺癌相關(guān)的miRNA種類較多且作用不一，已有研究表明在乳腺癌患者中上調(diào)的miRNA包括miR-26a，miR-29b, miR-375, miR-92, mir-183,miR-197 等，下調(diào)的 miRNA 包括 miR-145，miR-497，miR-339-5p，miR-22，miR-125b 等。雖然已在該領(lǐng)域進(jìn)行了ー些研究，但是現(xiàn)有的miRNA標(biāo)志物的準(zhǔn)確性、靈敏性方面均有不足，在臨床和研究中仍然存在尋找更加準(zhǔn)確和靈敏的乳腺癌miRNA標(biāo)志物的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種新的乳腺癌相關(guān)的miRNA作為乳腺癌的分子標(biāo)志物，該miRNA為 miR-30c-l-3p，其序列為 5’-CUGGGAGAGGGUUGUUUACUCC-3’ (SEQ ID NO :1)。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，miR-30c-l_3p在乳腺癌患者血清中的含量相比在正常人血清中的含量升高，而在患者接受手術(shù)后，其血清中的miR-30c-l-3p含量回落到正常水平，由此可見，増加的miR-30c-l-3p與腫瘤的存在密切相關(guān)。在上述發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供了 miR-30c-l-3p在制備診斷乳腺癌的診斷試劑中的用途。具體地，所述診斷試劑通過檢測被試者血清中miR-30c-l-3p的含量，并與正常水平相比較來診斷乳腺癌。在ー個(gè)特定的實(shí)施方案中，使用定量PCR的方法來檢測被試者血清中 miR-30c-l-3p 含量。 本發(fā)明還提供了一種診斷乳腺癌的診斷試劑盒，其包括(I)血清總RNA提取試劑，(2) RNA 加 polyA 試劑，(3) RT-PCR 試劑，(4)定量 PCR 試劑。其中，定量PCR試劑中包括乳腺癌分子標(biāo)志物miR-30c-l_3p的特異性正向引物，優(yōu)選地,其序列為 5’-GGGAGAGGGTTGTTTA-3’ (SEQ ID NO :7)。在ー個(gè)特定的實(shí)施方案中，所述血清總RNA提取試劑中包括序列為5，-CAACCTCCTAGAAAGA-3’ (SEQ ID NO :2)的 External Control-1 ;所述 RNA 加 polyA 試劑中包括序列為 5’-TGAGCAACGCGAACAA-3’ (SEQ ID NO :3)的 External Control-2 ;所述 RT-PCR 試劑中包括序列為 5’ -CAGTGGTATCAACGCACTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’ (SEQ ID NO :4)的 RT-Primer (其中，V 為 A 或 C 或 G，N 為 A 或 T 或 C 或 G);所述定量 PCR 試劑中包括序列分別為 5’-CTCACACGACTCACGACAC-3’ (SEQ ID NO :5)和 5’-CTCACACGACTCACGACACCAGTGGTATCAACGCACTC-3’ (SEQ ID NO :6)的通用反向引物 UPM-short 和UPM-long。使用本發(fā)明的乳腺癌分子標(biāo)志物miR-30c-l-3p診斷乳腺癌具有操作簡單，取材方便，安全無創(chuàng)傷，高特異性，高靈敏性以及易于大量篩查的特點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式I.血清中總RNA的提取抽取5名乳腺癌患者術(shù)前及術(shù)后7天各2ml血液，同時(shí)抽取5名正常人血液各2ml作為正常對照，凝血后進(jìn)行離心，最后取上層血清Iml置于I. 5ml的RNase/DNase-free離心管中。使用RNA提取試劑盒(北京曠博生物技術(shù)有限公司)自血清中提取總RNA，每250 μ I 血清中加入 1μ I (20ηΜ)序列為 5’ -CAACCTCCTAGAAAGA-3’ (SEQ ID NO 2)的External Control-I (上海生エ生物工程技術(shù)有限公司合成)來監(jiān)控血清中RNA的提取質(zhì)量。提取的總RNA使用Thermo NanoDrop 2000c測定濃度。
2.三步法定量檢測血清中的miRNA(I)加 polyA 尾:i.在無RNA酶的PCR管(Axygen公司，200 μ I)中配制加polyA尾的反應(yīng)液，體系為 20 μ I。姆 20 μ I 體系中加入 I μ I (20ηΜ)序列為 5’ -TGAGCAACGCGAACAA-3’ (SEQ IDNO 3)的External Control-2 (上海生エ生物工程技術(shù)有限公司合成)來監(jiān)控miRNA的加
尾及反轉(zhuǎn)錄質(zhì)量。
權(quán)利要求
1.一種乳腺癌分子標(biāo)志物miR-30c-l-3p，其序列如SEQ ID NO :1所示。
2.權(quán)利要求I所述乳腺癌分子標(biāo)志物miR-30c-l-3p在制備診斷乳腺癌的診斷試劑中的用途。
3.權(quán)利要求2所述用途，其中，所述診斷試劑通過檢測被試者血清中miR-30c-l-3p的含量，并與正常水平相比較來診斷乳腺癌。
4.權(quán)利要求3所述用途，其中，使用定量PCR的方法來檢測被試者血清中miR_30c_l_3p 含量。
5.一種診斷乳腺癌的診斷試劑盒，其包括 (1)血清總RNA提取試劑，(2)RNAjJP PolyA 試劑，(3)RT-PCR 試劑， (4)定量PCR試劑； 其中，定量PCR試劑中包括權(quán)利要求I所述乳腺癌分子標(biāo)志物miR-30c-l-3p的特異性正向引物。
6.權(quán)利要求5所述診斷試劑盒，其中，所述血清總RNA提取試劑中包括序列為SEQIDNO 2 的 External Control-1。
7.權(quán)利要求5所述診斷試劑盒，其中，所述RNA加polyA試劑中包括序列為SEQID NO:3 的 External Control-2。
8.權(quán)利要求5所述診斷試劑盒，其中，所述RT-PCR試劑中包括序列為SEQID NO :4的RT-Primer0
9.權(quán)利要求5所述診斷試劑盒，其中，所述定量PCR試劑中包括序列分別為SEQID NO5和6的通用反向引物UPM-short和UPM-long。
10.權(quán)利要求5所述診斷試劑盒，其中，所述乳腺癌分子標(biāo)志物miR-30c-l-3p的特異性正向引物的序列如SEQ ID NO 7所示。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種乳腺癌分子標(biāo)志物miR-30c-1-3p及其在制備診斷乳腺癌的診斷試劑中的用途。miR-30c-1-3p在乳腺癌患者血清中的含量比在正常人血清中的含量升高，而在患者接受手術(shù)后，其血清中的miR-30c-1-3p含量回落到正常水平。本發(fā)明還提供了一種診斷乳腺癌的診斷試劑盒。使用本發(fā)明的乳腺癌分子標(biāo)志物miR-30c-1-3p診斷乳腺癌具有操作簡單，取材方便，安全無創(chuàng)傷，高特異性，高靈敏性以及易于大量篩查的特點(diǎn)。
文檔編號C12N15/113GK102676526SQ201210153448
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月16日
發(fā)明者李同恩, 李啟靖, 栗世鈾 申請人:北京曠博生物技術(shù)有限公司