一種可用于減緩單分子熒光漂白現(xiàn)象的除氧試劑及其應(yīng)用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及單分子熒光檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種可用于減緩單分子熒光漂白 現(xiàn)象的除氧試劑及其應(yīng)用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 單分子熒光檢測是近年來迅速發(fā)展起來的一種超靈敏的檢測技術(shù)，自從1976年 Hirschfeld第一次嘗試用全內(nèi)反射熒光法實(shí)現(xiàn)以來，單分子熒光檢測技術(shù)逐漸在化學(xué)分 析、DNA測序、醫(yī)學(xué)診斷、分子動力學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。
[0003] 然而單分子熒光在檢測過程中由于受激發(fā)光的照射，存在光漂白淬滅效應(yīng)。光漂 白會導(dǎo)致檢測時(shí)長和檢測到的總光子數(shù)減少。對單個單分子而言，發(fā)射出的總光子數(shù)決定 了單分子熒光的信噪比，發(fā)光的時(shí)長決定了樣品可檢測時(shí)長。以基因測序?yàn)槔?，單分子熒?可檢測時(shí)長決定了 DNA測序的讀度，因此減緩單分子熒光漂白，增加樣品的可檢測時(shí)長有 重要意義。
[0004] 研究表明，氧分子是單分子熒光發(fā)生漂白的主要原因，它導(dǎo)致單分子熒光漂白的 方式有兩種：一是直接與激活狀態(tài)的熒光分子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，二是通過產(chǎn)生自由基間接地 反應(yīng)。為減緩單分子熒光漂白，必須盡可能地降低溶液中氧分子和氧自由基濃度。常用的 除去溶液中氧分子和氧自由基的方法有以下兩種：一種是在溶液中加入適當(dāng)濃度的還原劑 去除氧分子的化學(xué)方法，但還原劑與氧分子的反應(yīng)容易引起溶液中PH值的改變；另一種通 過加入去氧酶試劑的生物方法，但是體系中溫度、pH值、離子濃度均對酶活性都影響較大， 使用有較大的局限性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種操作簡單、效果顯著的減緩單分子熒光漂白 現(xiàn)象的除氧試劑及其應(yīng)用方法，可以有效增加單分子檢測時(shí)長。
[0006] 第一方面，本發(fā)明提供了一種可用于減緩單分子熒光漂白現(xiàn)象的除氧試劑，所述 除氧試劑包括的各組分及其體積份數(shù)為：pH = 7. 1-9. 0、濃度為20-400mM的Tris-HCl緩沖 液74-86份，濃度為50-300mM的抗壞血酸鈉溶液8-12份，濃度為20-200mM的酪氨酸溶液 2-6份，濃度為5-50mM的還原谷胱甘肽溶液4-8份。
[0007] 優(yōu)選地，所述除氧試劑包括的各組分及其體積份數(shù)為：pH = 7. 1-9.0、濃度為 20-400mM的Tris-HCl緩沖液81份，濃度為50-300mM的抗壞血酸鈉溶液10份，濃度為 20-200mM的酪氨酸溶液4份，濃度為5-50mM的還原谷胱甘肽溶液5份。
[0008] 更優(yōu)選地，所述除氧試劑包括的各組分及其體積份數(shù)為：pH = 8、濃度為IOOmM的 Tris-HCl緩沖液81份，濃度為200mM的抗壞血酸鈉溶液10份，濃度為50mM的酪氨酸溶液 4份，濃度為50mM的還原谷胱甘肽溶液5份。
[0009] 優(yōu)選地，所述抗壞血酸鈉溶液是pH = 7. 1-9. 0、濃度為20-400mM的Tris-HCl緩沖 液作為溶劑配制而成。
[0010] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述抗壞血酸鈉溶液是pH = 8、濃度為20-400mM的TriS-HCl緩沖 液作為溶劑配制而成。
[0011] 更優(yōu)選地，所述抗壞血酸鈉溶液是pH = 8、濃度為IOOmM的TriS-HCl緩沖液作為 溶劑配制而成。
[0012] 優(yōu)選地，所述酪氨酸溶液、所述還原谷胱甘肽溶液是采用雙蒸水作為溶劑配制而 成。
[0013] 如本發(fā)明所述，如無特殊說明，上述化學(xué)品均指市售藥品。
[0014] 如本發(fā)明所述的，所述各溶液的濃度均是指在混合前，各溶液自身的物質(zhì)的量濃 度。
[0015] 本發(fā)明中，所述pH = 8、濃度為50mM的Tris-HCl緩沖液是采用如下方法配制：將 50mL、0.1 M的三羥甲基氨基甲烷（Tris)溶液與29. 2mL的0.1 M的鹽酸混勻后，加水稀釋至 IOOmL0
[0016] IUpH = 8、濃度為0.1 M的Tris-HCl緩沖液：稱量12. Ilg的三羥甲基氨基甲烷， 加入700mL雙蒸水，攪拌溶解。并加入IM的濃鹽酸調(diào)節(jié)pH，并實(shí)時(shí)觀察溫度穩(wěn)定在25°C， 調(diào)節(jié)pH值至8. 0,轉(zhuǎn)入IL容量瓶，定容至1L。
[0017] 本方法中提供的可用于減緩單分子熒光漂白的除氧試劑中，Tris-HCl緩沖液可以 有效地穩(wěn)定了溶液環(huán)境中的PH值；抗壞血酸鈉、酪氨酸都是比較溫和的還原劑，還原谷胱 甘肽能很好的除去溶液中的氧分子和氧自由基，所述除氧試劑的各組分之間是協(xié)同的統(tǒng)一 整體，各個組分缺一不可，且各個組分的含量既不是越多越好，也不是越少也好，本申請通 過調(diào)整除氧試劑中各組分的濃度及其比例，既可以有效除去溶液中氧分子和氧自由基，又 不會引起體系PH值的變化?？梢詫⑺龀踉噭┯糜趩畏肿訜晒鈾z測領(lǐng)域，減緩單分子熒 光漂白現(xiàn)象，有效增加單分子檢測時(shí)長，提高檢測準(zhǔn)確度和靈敏度。
[0018] 第二方面，本發(fā)明還提供了一種可用于減緩單分子熒光漂白現(xiàn)象的除氧試劑的應(yīng) 用方法，包括如下步驟：
[0019] (1)分別配制pH = 7. 1-9. 0、濃度為20-400mM的Tris-HCl緩沖液，濃度為 50-300mM的抗壞血酸鈉溶液，濃度為20-200mM的酪氨酸溶液，濃度為5-50mM的還原谷胱甘 肽溶液；
[0020] (2)取體積份數(shù)如下的上述各組分：pH = 7. 1-9. 0、濃度為20-400mM的Tris-HCl 緩沖液74-86份，濃度為50-300mM的抗壞血酸鈉溶液8-12份，濃度為20-200mM的酪氨酸 溶液2-6份，濃度為5-50mM的還原谷胱甘肽溶液4-8份；
[0021] 將上述各組分混合均勻，得到可用于減緩單分子熒光漂白現(xiàn)象的除氧試劑；
[0022] (3)將所述除氧試劑栗入裝有待測單分子熒光物質(zhì)的單分子熒光檢測體系的腔 室，進(jìn)行單分子熒光檢測。
[0023] 優(yōu)選地，步驟（1)中，所述抗壞血酸鈉溶液是采用pH = 7. 1-9. 0、濃度為20-400mM 的Tris-HCl緩沖液作為溶劑配制而成。
[0024] 更優(yōu)選地，所述抗壞血酸鈉溶液是pH = 8、濃度為20-400mM的Tris-HCl緩沖液作 為溶劑配制而成。
[0025] 優(yōu)選地，步驟（1)中，所述酪氨酸溶液、所述還原谷胱甘肽溶液是采用雙蒸水作為 溶劑配制而成。
[0026] 優(yōu)選地，步驟⑵中，所述除氧試劑包括的各組分及其體積份數(shù)為：pH = 7. 1-9. 0、 濃度為20-400mM的Tris-HCl緩沖液81份，濃度為50-300mM的抗壞血酸鈉溶液10份，濃 度為20-200mM的酪氨酸溶液4份，濃度為5-50mM的還原谷胱甘肽溶液5份。
[0027] 更優(yōu)選地，步驟（2)中，所述除氧試劑包括的各組分及其體積份數(shù)為：pH = 8、濃度 為IOOmM的Tris-HCl緩沖液81份，濃度為200mM的抗壞血酸鈉溶液10份，濃度為50mM的 酪氨酸溶液4份，濃度為50mM的還原谷胱甘肽溶液5份。
[0028] 優(yōu)選地，步驟（3)中，所述待測單分子熒光物質(zhì)包括單分子熒光染料或單分子熒 光染料標(biāo)記的蛋白質(zhì)、DNA。
[0029] 優(yōu)選地，所述單分子焚光染料包括花菁染料Cyanine 3(簡稱Cy3)、Cyanine 5(簡 稱Cy5)和Atto 610中的一種或多種，但不限于此，常用的單分子熒光染料均包含在內(nèi)。
[0030] 所述Cy3、Cy5和Atto 610的結(jié)構(gòu)式如下：
[0032] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0033] (1)本發(fā)明提供的除氧試劑的配比簡單，成本低，所述除氧試劑可有效除去溶液中 氧分子和氧自由基；
[0034] (2)所述可用于減緩單分子熒光漂白的除氧試劑的應(yīng)用方法簡單，操作性強(qiáng)，處理 時(shí)間短，由于采用了所述除氧試劑，可以有效減緩單分子熒光漂白反應(yīng)，增加了單分子檢測 時(shí)長。
【附圖說明】
[0035] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例1制得的除氧試劑及對比實(shí)施例1、2的除氧試劑減緩花菁染 料Cy3的單分子熒光漂白效果圖；
[0036] 圖2是考察放置時(shí)間對本發(fā)明實(shí)施例1制得的除氧試劑對減緩Cy3的單分子熒光 漂白效果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0037] 為了使本發(fā)明要解決的技術(shù)問題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，下面結(jié)合 附圖與較佳實(shí)施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用 以解釋本發(fā)明，不用于限定本發(fā)明。
[0038] 實(shí)施例1 :
[0039] -種可用于減緩單分子熒光漂白現(xiàn)象的除氧試劑的應(yīng)用方法，包括如下步驟：
[0040] (1)配制pH = 8、濃度為IOOmM的Tris-HCl緩沖液，并用上述Tris-HCl緩沖液作 為溶劑配制濃度為50-300mM的抗壞血酸鈉溶液，并用雙蒸水分別配制濃度為50mM的酪氨 酸溶液、濃度為50mM的還原谷胱甘肽溶液；
[0041] (2)取如下體積份數(shù)的上述各組分：pH = 8、濃度為IOOmM的Tris-HCl緩沖液81 份，濃度為200mM的抗壞血酸鈉溶液10份，濃度為50mM的酪氨酸溶液4份，濃度為50mM的 還原谷胱甘肽溶液5份；
[0042] 將上述各組分混合均勻，得到可用于減緩單分子熒光漂白現(xiàn)象的除氧試劑；
[0043] (3)將帶標(biāo)記有Cy3單分子熒光染料的DNA固定在玻璃片上，然后將固定有Cy3的 玻璃片放到帶墊片的槽上組裝成一個小腔室，即流通池，然后將所述除氧試劑栗入這個腔 室，并進(jìn)行Cy3的單分子熒光檢測。
[0044] 本實(shí)施例中，將帶標(biāo)記有Cy3單分子熒光染料的DNA固定在玻璃片，具體是：將3' 端連有cy3、5'端連接有順2的DNA分子與表面修飾上-COOH的玻璃片通過交聯(lián)劑固定在 一起。
[0045] 對比實(shí)施例1-