雙重定量真菌毒素量子點(diǎn)熒光免疫層析試紙條及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及免疫層析技術(shù)，具體地說，是涉及同時(shí)對(duì)食品中兩種真菌毒素同時(shí)進(jìn)行檢測的以量子點(diǎn)標(biāo)記真菌毒素特異性單克隆抗體和熒光顯色為基礎(chǔ)的免疫層析試紙條的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)階段常發(fā)的各類中毒事件，除了某些由無機(jī)化合物如氰化鉀、砒霜引起外，絕大部分都是來自生物毒素，而微生物毒素是最常見的，食物中毒絕大部分是細(xì)菌毒素或真菌毒素引起的，真菌毒素由于污染范圍廣、毒性強(qiáng)等特點(diǎn)日益受到食品安全監(jiān)測領(lǐng)域的高度重視。
[0003]真菌毒素是真菌產(chǎn)生的小分子次級(jí)代謝產(chǎn)物，是糧食和飼料中的重要污染物。真菌毒素的檢測常見的方法是酶聯(lián)免疫法（ELISA)，雖然酶聯(lián)免疫法操作簡單，結(jié)果易獲取，但需要配套的設(shè)備，如恒溫培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀等等，且往往耗時(shí)較長，不能用于臨床或現(xiàn)場的快速診斷。相比ELISA，免疫層析試紙條可用于現(xiàn)場的快速檢測，并且不需要其他輔助儀器，可彌補(bǔ)其他檢測方法復(fù)雜而耗時(shí)的缺點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)中酶標(biāo)免疫技術(shù)耗時(shí)長和常規(guī)膠體金免疫層析試紙條靈敏度不高以及單通道等缺點(diǎn)，提供了一種檢測真菌毒素的量子點(diǎn)熒光免疫層析試紙條及制備方法。
[0005]為解決技術(shù)問題，本發(fā)明的解決方案是：
[0006]提供一種同時(shí)檢測兩種真菌毒素的量子點(diǎn)熒光免疫層析試紙條，包括作為基材的黑色長條狀聚氯乙烯背板，在沿背板長度方向在其表面依次布置樣品墊、量子點(diǎn)抗體標(biāo)記物固定墊、硝酸纖維素膜和吸收墊，相鄰墊或膜間彼此搭接；在硝酸纖維素膜上，設(shè)有與背板同寬的彼此間隔的兩條檢測線和一條質(zhì)控線，其中質(zhì)控線位于吸水墊一側(cè)；
[0007]在量子點(diǎn)抗體標(biāo)記物固定墊上，以噴涂、敷涂或浸泡的方式固定有真菌毒素單克隆抗體與羧基水溶性量子點(diǎn)的標(biāo)記復(fù)合物；所述質(zhì)控線是將山羊抗鼠多克隆抗體噴涂于硝酸纖維素膜上形成，所述檢測線是將待檢真菌毒素偶聯(lián)抗原噴涂于硝酸纖維素膜上形成，兩條檢測線所含真菌毒素偶聯(lián)抗原是不同的。
[0008]本發(fā)明中，所述量子點(diǎn)抗體標(biāo)記物固定墊上的真菌毒素單克隆抗體與羧基水溶性量子點(diǎn)的標(biāo)記復(fù)合物，其制備方法是：
[0009]以濃度為0. 01M、pH = 7. 4的硼酸鹽緩沖液分別配置偶聯(lián)劑1_(3_ 二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)溶液，濃度均為10mg/ml ;取50 y 1羧基修飾的水溶性量子點(diǎn)至2ml EP管，加200 y 1濃度為0. 05M、pH = 6的2- (N-嗎啉代）乙磺酸（MES)緩沖液，并根據(jù)水溶性量子點(diǎn)上的羧基數(shù)目加入EDC和NHS溶液；室溫?fù)u床活化30min后15000rpm離心30min棄上清后加入1ml含5 y g特異性真菌毒素單克隆抗體的pH = 6、0.05M的MES緩沖液；室溫?fù)u床反應(yīng)2h后15000rpm離心30min棄上清，并用Iml 0.0lM,pH = 7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，離心，洗去未反應(yīng)的抗體；重復(fù)上述的重懸、離心操作三次；最終加100 μ I的0.05Μ、pH = 8.0的硼酸鹽緩沖液作為保存液，得到真菌毒素單克隆抗體與羧基水溶性量子點(diǎn)的標(biāo)記復(fù)合物，在4°C放置，備用。
[0010]本發(fā)明中，所述真菌毒素單克隆抗體所對(duì)應(yīng)的真菌毒素，是赭曲霉毒素A、黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素等中的任意一種。
[0011]本發(fā)明中，該試紙條的寬度為0.4cm，樣品墊、量子點(diǎn)抗體標(biāo)記物固定墊、硝酸纖維素膜和吸收墊的長度分別為1.7cm、0.8cm、2.5cm、l.7cm ;其中，樣品墊與量子點(diǎn)抗體標(biāo)記物固定墊的搭接重合長度為0.2cm，量子點(diǎn)抗體標(biāo)記物固定墊與硝酸纖維素膜的搭接重合長度為0.2cm，硝酸纖維素膜與吸收墊的搭接重合長度為0.3cm ;在硝酸纖維素膜上，兩條檢測線及檢測線-2與質(zhì)控線之間的間距分別為0.4cm,0.4cm。
[0012]本發(fā)明進(jìn)一步提供了制備前所述量子點(diǎn)熒光免疫層析試紙條的方法，包括下述步驟:
[0013](I)制備量子點(diǎn)抗體標(biāo)記物固定墊
[0014]以濃度為0.01M、pH = 7.4的硼酸鹽緩沖液分別配置偶聯(lián)劑1_(3_ 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶液，濃度均為10mg/ml ;取50 μ I羧基修飾的水溶性量子點(diǎn)至2ml EP管，加200 μ I濃度為0.05Μ、ρΗ = 6的2- (N-嗎啉代)乙磺酸(MES)緩沖液，并根據(jù)水溶性量子點(diǎn)上的羧基數(shù)目加入EDC和NHS溶液；室溫?fù)u床活化30min后15000rpm離心30min棄上清后加入Iml含5 μ g特異性真菌毒素單克隆抗體的0.05M、pH = 6的MES緩沖液；室溫?fù)u床反應(yīng)2h后15000rpm離心30min棄上清，并用Iml 0.01M,pH = 7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，離心，洗去未反應(yīng)的抗體；重復(fù)上述重懸、離心操作三次；最終加100 μ I的0.05Μ、pH = 8.0的硼酸鹽緩沖液作為保存液，得到真菌毒素特異性單克隆抗體與羧基修飾水溶性量子點(diǎn)的標(biāo)記復(fù)合物4°C放置，備用；
[0015]以噴涂、敷涂或浸泡的方式，將真菌毒素特異性單克隆抗體與羧基修飾水溶性量子點(diǎn)的標(biāo)記復(fù)合物固定在量子點(diǎn)抗體標(biāo)記物固定墊上，在37°C干燥2小時(shí)備用；
[0016](2)取硝酸纖維素膜貼于作為基材的長條狀聚氯乙烯背板上，點(diǎn)膜儀在硝酸纖維素膜上同時(shí)噴涂兩條檢測線和一條質(zhì)控線，其中質(zhì)控線位于一側(cè)；質(zhì)控線的噴涂液為山羊抗鼠多克隆抗體，兩條檢測線的噴涂液是不同種類的待檢真菌毒素偶聯(lián)抗原；在37°C干燥2小時(shí)后，置于聚乙二醇溶液中浸泡30分鐘，晾干后在37°C干燥2小時(shí)備用；
[0017](3)將樣品墊、量子點(diǎn)抗體標(biāo)記物固定墊和吸收墊布置于聚氯乙烯背板上，并使樣品墊、量子點(diǎn)抗體標(biāo)記物固定墊、硝酸纖維素膜和吸收墊依次排列，硝酸纖維素膜的質(zhì)控線位于吸水墊一側(cè)，且相鄰墊或膜間彼此搭接；
[0018](4)將聚氯乙烯背板及其貼附的材料切成4_寬的層析條，將層析條放入塑料板卡內(nèi)，用壓卡機(jī)壓實(shí)。
[0019]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
[0020]本發(fā)明以量子點(diǎn)熒光材料取代常規(guī)的膠體金對(duì)真菌毒素特異性單克隆抗體進(jìn)行標(biāo)記，采用競爭法原理對(duì)真菌毒素進(jìn)行定性檢測和定量分析，硝酸纖維素膜上同時(shí)包被兩條檢測線，分別為待檢真菌毒素偶聯(lián)抗原，可同時(shí)對(duì)兩種真菌毒素進(jìn)行檢測，所制備的層析試紙條具有良好的靈敏度和穩(wěn)定性，且操作簡便快捷，特別適用于現(xiàn)場的快速診斷。
【附圖說明】
[0021]圖1為本發(fā)明中量子點(diǎn)熒光免疫層析試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0022]圖中附圖標(biāo)記:1、樣品墊；2、量子點(diǎn)抗體標(biāo)記物固定墊；3、硝酸纖維素膜；4、吸收墊；5、檢測線-1 ;6、檢測線-2 ;7、質(zhì)控線。
【具體實(shí)施方式】
[0023]發(fā)明原理描述:
[0024]本發(fā)明中的量子點(diǎn)熒光免疫層析試紙條基于量子點(diǎn)熒光材料與免疫層析技術(shù)。此種免疫層析條以羧基修飾的水溶性砸化鎘/硫化鋅量子點(diǎn)(CdSe/ZnS) (CdSe為核心，ZnS為殼層，量子點(diǎn)表面經(jīng)過羧基官能團(tuán)修飾后可與特定生物分子進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián))取代常規(guī)的膠體金，在偶聯(lián)劑^3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的作用下與真菌毒素單克隆抗體進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)，采用競爭法原理對(duì)食品中真菌毒素含量進(jìn)行定性檢測和定量分析。
[0025]該可同時(shí)檢測兩種真菌毒素的量子點(diǎn)熒光免疫層析試紙條，包括作為基材的黑色長條狀聚氯乙烯背板，在沿背板長度方向在其表面依次布置樣品墊(I)、量子點(diǎn)抗體標(biāo)記物固定墊(2)、硝酸纖維素膜(3)和吸收墊(4)，相鄰墊或膜間彼此搭接；在硝酸纖維素膜(3)上，設(shè)有與背板同寬的彼此間隔的檢測線(5)、檢測線(6)和質(zhì)控線(7)，其中質(zhì)控線(7)位于吸水墊(4)的一側(cè)；在量子點(diǎn)抗體標(biāo)記物的固定墊(3)上，以噴涂、敷涂或浸泡的方式固定有真菌毒素特異性單克隆抗體與羧基修飾水溶性量子點(diǎn)標(biāo)