專利名稱：用于單端孢菌毒素真菌毒素檢測的方法和試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及農(nóng)作物，食物，飼料等中的單端孢菌毒素(trichothecene)真菌毒素的免疫測定，涉及用于免疫測定的試劑和試劑盒，以及其中使用的單克隆抗體。
背景領(lǐng)域真菌毒素被定義為真菌(經(jīng)由食物或飼料對人類或動物有一些有害效應(yīng)的)產(chǎn)生的次生代謝物，并區(qū)別于細(xì)菌毒素及其諸如此類的毒素。真菌毒素，不同于細(xì)菌毒素，是低分子量物質(zhì)，包括各種已知物質(zhì)。在其化學(xué)結(jié)構(gòu)和對生活的有機(jī)體有害效應(yīng)方面有相當(dāng)?shù)淖兓?。不只是一些真菌毒素對人類有害；某些在人體中表現(xiàn)高的急性毒性，其它的被認(rèn)為在腎和肝臟具有致癌性或致瘤性。由于其低分子量，真菌毒素在食品加工或烹調(diào)的一般條件下很難分解或除去。而且，當(dāng)通過飼料攝取進(jìn)入食用動物體內(nèi)時，真菌毒素的高穩(wěn)定性使其保留在這些動物的肉與牛奶產(chǎn)品中，當(dāng)攝入人體之后最終表現(xiàn)出毒性。
真菌毒素污染能通過各種途徑發(fā)生，但廣義上被分為作物的初級污染(在作物的栽培，收獲，儲藏和加工過程中通過真菌的侵染發(fā)生)和家畜和海產(chǎn)品(例如，肉，奶，蛋)的次級污染。根據(jù)諸如作物種類(真菌的底物)，存在于栽培環(huán)境中的真菌種類以及環(huán)境條件(例如，溫度，濕度和降雨量)的因素，初級污染表現(xiàn)出局部特征。
單端孢菌毒素真菌毒素是污染主要的禾谷類作物(如大麥，小麥，黑麥，燕麥和玉米)的代表性真菌毒素。脫氧瓜萎鐮菌醇(DON)，瓜萎鐮菌醇(NIV)，T-2毒素(T-2)是代表性的單端孢菌毒素真菌毒素。主要產(chǎn)生它們的真菌，禾谷鐮孢、黃色鐮孢、擬枝孢鐮孢，一般存在于土壤中，如果自然條件如溫度，濕度以及降雨滿足的話，容易侵染農(nóng)作物，導(dǎo)致傳播農(nóng)作物的真菌毒素污染。為了防止食品和飼料的污染，許多國家正式通過了關(guān)于食品和飼料中的單端孢菌毒素真菌毒素殘余濃度的法規(guī)。因此，迅速和準(zhǔn)確地測定食品和飼料中的單端孢菌毒素真菌毒素是很重要的。
以前用于測定單端孢菌毒素真菌毒素的方法包括層析，高效液相色譜，氣相色譜，質(zhì)譜和使用動物的生物測定，這些方法以單獨(dú)地或結(jié)合的方式進(jìn)行測定。而且，最近提出的免疫測定開始使用。免疫測定(是迅速和簡單地執(zhí)行分析的方法，具有非常好的特異性和靈敏度)被廣泛地應(yīng)用于各個領(lǐng)域，包括測定激素和生物物質(zhì)。尤其，用于制備單克隆抗體的技術(shù)促進(jìn)了免疫測定方法的較大進(jìn)展。
也存在一些單端孢菌毒素真菌毒素的衍生物，它們也具有毒性。因此，為了了解單端孢菌毒素真菌毒素污染的程度，優(yōu)選地是以某些共同地而不是個別地測定這些衍生物。測定的實(shí)驗(yàn)材料包括非常廣泛范圍的物質(zhì)，例如，如受單端孢菌毒素真菌毒素侵染的大麥，小麥，黑麥，燕麥以及玉米的禾谷類，用感染的禾谷類飼喂的家畜的肉和奶，從感染的肉和奶產(chǎn)生的加工的食物。而且，由于在加工過程中真菌毒素的濃度被稀釋，有必要測定低濃度的單端孢菌毒素真菌毒素。因此，需要一種具有較高靈敏度的測定方法。
另一方面，為了了解污染的地點(diǎn)和情況，單獨(dú)地測定3種主要的單端孢菌毒素真菌毒素DON，NIV和T-2是重要的。為了建立能夠測定這些單端孢菌毒素真菌毒素的免疫測定，將有利地使用對欲測定的單端孢菌毒素真菌毒素具有高親和性和高特異性的抗體，尤其是單克隆抗體。
在各種出版物中公開了單端孢菌毒素真菌毒素的單克隆抗體。日本出版檢查的專利申請43358/93公開了對T-2具有特異性的單克隆抗體和用抗體對T-2類型測定的方法，該單克隆抗體是通過用一種免疫原(通過把T-2結(jié)合到一種載體蛋白上制備的)免疫老鼠而獲得的。Dietrich等獲得了T-2的單克隆抗體和3-乙酰DON的單克隆抗體(天然毒素，3288-293，1995)。美國專利4879248公開了在第8個位置上使用取代基作為接頭，通過結(jié)合一種載體蛋白產(chǎn)生抗體。然而，這些出版物都沒有公開適合于本發(fā)明的對象的具有高親和性和特異性的單克隆抗體。
應(yīng)用和環(huán)境的微生物學(xué)，1993年5月，591264-1268公開了4，15-二乙酰NIV的多克隆抗體(通過使用一種免疫原制備，其中載體蛋白質(zhì)結(jié)合在第3-位置的碳原子上)，但沒有公開利用類似的免疫原產(chǎn)生單克隆抗體。此外，T-2和DON的單克隆抗體在食品添加劑污染(5629，(1988))和農(nóng)業(yè)食品化學(xué)雜志(36663(1988))中予以公開。
根據(jù)本發(fā)明的單克隆抗體具有下列特征，并且優(yōu)于以上提及的已知的單克隆抗體。
與Dietrich等的抗體(3E2)(天然毒素，3288，1995)相比較，249-KTM有相當(dāng)高的親和性，和高度的靈敏性(T-2的檢測限ca.0.0001ng/ml)。KTM-249表現(xiàn)出與乙酰T-2，HT-2和T-2相同程度的反應(yīng)性，因此適合于本發(fā)明的對象。
KTM-2與HT-2和T-2的反應(yīng)性在同一水平(T-2＝HT-2＝100％)，與乙酰T-2的反應(yīng)為78％。另一方面，美國專利4772551中公開的抗T-2單克隆抗體IVI-10092對T-2的0.023顯示出50％的抑制值，乙酰T-2的0.094顯示出50％的抑制值，(反應(yīng)性0.023/0.094＝25％，根據(jù)對T-2的50％抑制值，為100％)，對HT-2的1顯示出50％的抑制值(反應(yīng)性0.023/1＝2.3％)。這表明KTM-249能夠檢測廣泛范圍的T-2衍生物，即，對T-2具有高度的選擇性但與DON或NIV衍生物沒有反應(yīng)性，而IVI-10092僅僅對T-2有選擇性。
KTM-240表現(xiàn)出明顯不同于Dietrich的抗體(天然毒素，3288，1995)的反應(yīng)性。例如，5B2與二乙酰-DON的反應(yīng)性是與三乙酰-DON的反應(yīng)性約6倍，它與三乙酰-DON的反應(yīng)性小于與3-乙酰-DON的反應(yīng)性的，而KTM-240與二乙酰-DON的反應(yīng)性是其與15-乙酰-DON的反應(yīng)性的約50倍，它與三乙酰-DON的反應(yīng)性是與15-乙酰-DON的反應(yīng)性的約兩倍。此外，KTM-240與乙酰化的NIV具有強(qiáng)烈的反應(yīng)性，而5B2與這樣的化合物不能反應(yīng)，因此不能用于DON和NIV的同時檢測。
日本出版的審查過的專利申請43358/93中描述的抗-T-2毒素單克隆抗體表現(xiàn)出與HT-2的交互反應(yīng)性為3％。另一方面，KTM-249表現(xiàn)出與所有的HT-2，T-2，和乙酰T-2相同水平的反應(yīng)性，因此適合于測定總的T-2相關(guān)的毒素，KTM-249是本發(fā)明的一個對象。
Chiba等的抗體(食品添加劑污染5629，(1988))與HT-2的反應(yīng)性不到與T-2反應(yīng)性的0.5％，而本發(fā)明的KTM-249也與HT-2強(qiáng)烈地進(jìn)行反應(yīng)。
Casale等的抗體DON-1(農(nóng)業(yè)食品化學(xué)雜志36663(1988))和本發(fā)明的KTM-240在反應(yīng)性方面有明顯的不同。DON-1強(qiáng)烈地與3-乙酰-DON起反應(yīng)，與DON有很好的反應(yīng)性，與NIV具較弱的反應(yīng)性，但不與15-乙酰-DON起反應(yīng)。KTM-240不與DON或NIV起反應(yīng)，但與二乙酰-BON和三乙酰-DON強(qiáng)烈反應(yīng)。KTM-240也與15-乙酰-DON起反應(yīng)，且它與15-乙酰-DON的反應(yīng)性比它與3-乙酰-DON的反應(yīng)性更強(qiáng)。
本發(fā)明的內(nèi)容在單端孢菌毒素真菌毒素的免疫測定中使用的抗體要求能夠共同地測定單端孢菌毒素真菌毒素及其許多衍生物，要求具有足夠的特異性用于單獨(dú)地測定3種主要的類型(即，DON類型，NIV類型和T-2類型)，也要求有高的親和性，能夠測定低濃度的抗原。而且，考慮到產(chǎn)率和重復(fù)性以及為本發(fā)明的目所要求的恒定的特異性，本發(fā)明的抗體優(yōu)選地是單克隆抗體或其片段。
抗體片段包括Fab，F(xiàn)ab’和F(ab)2。
通過把雜交瘤產(chǎn)生的抗體用胰蛋白酶或其類似物經(jīng)酶處理，或經(jīng)還原可獲得本發(fā)明的抗體片段。通過從雜交瘤提取mRNA，把從mRNA制備的cDNA插入到原核或真核表達(dá)載體中，把載體導(dǎo)入原核或真核細(xì)胞中，然后在其中表達(dá)所需的產(chǎn)物也可獲得抗體片段。
單端孢菌毒素真菌毒素低分子量物質(zhì)，它們是所謂的半抗原，只具有較低的免疫原性。因此，為了產(chǎn)生單端孢菌毒素真菌毒素的抗體，有必要把真菌毒素改變成為生物可識別的一種抗原形式，例如，在免疫接種之前，通過把它結(jié)合到載體物質(zhì)上。本發(fā)明發(fā)明人注意到這樣的事實(shí)在制備載體物質(zhì)和單端孢菌毒素真菌毒素的綴合物中，結(jié)合位點(diǎn)的差異影響產(chǎn)生的抗體的親和性和特異性。因?yàn)閱味随呔舅卣婢舅睾苌倏扇芩冢淙芤阂话阌糜袡C(jī)溶劑制備。本發(fā)明發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，通過將以式(I)所代表的單端孢菌毒素真菌毒素 (其中R1代表OH或酰氧基；R2，R3和R4可以相同或者不同，每個代表H，羥基或酰氧基；以及Z1代表OCOCH2CH(CH3)2和Z2代表H，或Z1和Z2一起代表＝O，[在下文以式(I)為代表的化合物稱為化合物(I)]溶解在不含有機(jī)溶劑的水溶液中，通過在該化合物的3-位使用取代基作為接頭把化合物(I)結(jié)合在一種栽體物質(zhì)上，以及使用獲得的綴合物作為免疫原，可以獲得高親和性的抗體。
本發(fā)明發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)通過利用乙?；膯味随呔舅卣婢舅刈鳛槊庖咴梢垣@得具有高特異性和親和性的單克隆抗體。
而且，本發(fā)明發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)當(dāng)把樣品中的單端孢菌毒素真菌毒素轉(zhuǎn)化成為以式(II)所代表的化合物后，通過利用本發(fā)明的抗體可以測定DON，NIV，和T-2的總量，或DON，NIV，和T-2中的3種主要的類型。 (其中R1a，R3a和R4a可以相同或者不同，每個代表羥基或酰氧基)[在下文以式(II)所代表的化合物稱為化合物(II)]，以式(III)所代表的化合物 (其中R1B，R3B和R4B可以相同或者不同，每個代表羥基或酰氧基；R2B代表H，OH，或酰氧基，前提是R2B是H或OH，至少R1B，R3B和R4B其中一種是酰氧基)，[在下文以式(III)所代表的化合物稱為化合物(III)]，以式(IV)所代表的化合物 (其中R1c，R2c和R3c可以相同或者不同，每個代表羥基或酰氧基，前提是R1c，R2c和R3c至少其中一種是酰氧基)，在這些發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
在上述式中的基團(tuán)定義中，酰氧基中的酰基是指一個取代的或非取代的低級?；鶊F(tuán)，或是一個取代的或非取代的芳香?；鶊F(tuán)。低級?；鶊F(tuán)是指具有1至12個碳原子的直鏈或支鏈的烷酰基團(tuán)，如甲?；阴；?，丙?；?，丁酰基，異丁酰基，纈草酰基，異纈草?；?，新戊酰，己?；；?，辛?；?，癸?；褪榛７枷沲；ū郊柞；良柞；?。在被取代的低級酰基基團(tuán)中的取代基的例子是羥基和羧基。在被取代的低級芳香酰基基團(tuán)中的取代基的例子是低級烷基，羥基，低級烷氧基，鹵素和羧基。低級烷基和低級烷氧基是指的低級烷基部分是指具有1-6個碳原子烷基直鏈或支鏈的低級?；?，如甲基，乙基，丙基，異丙基，丁基，異丁基，仲-丁基，叔丁基，戊基，己基。鹵素是指氖，氯，溴或碘。
NIV類型的真菌毒素包括瓜萎鐮菌醇(NIV)，4-乙酰瓜萎鐮菌醇，3，4-二乙酰瓜萎鐮菌醇，4，15-二乙酰瓜萎鐮菌醇，3，4，15-三乙酰瓜萎鐮菌醇，4，7，15-三乙酰瓜萎鐮菌醇，和3，4，7，15-四乙酰瓜萎鐮菌醇；DON類型的真菌毒素包括脫氧瓜萎鐮菌醇(DON)，3-乙酰脫氧瓜萎鐮菌醇，3-乙酰脫氧瓜萎鐮菌醇，15-乙酰脫氧瓜萎鐮菌醇，3，15-二乙酰脫氧瓜萎鐮菌醇和3，7，15-三乙酰脫氧瓜萎鐮菌醇；T-2類型的真菌毒素包括HT-2，T-2和乙酰T-2。本發(fā)明涉及下列(1)-(40)(1)一種單克隆抗體或其片段，其對式(II)代表的化合物具有親和性 (其中R1a，R3a和R4a可以相同或者不同，每個代表羥基或酰氧基)，并且其實(shí)質(zhì)上不與以式(A)代表的化合物 (其中R1A，R3A和R4A可以相同或者不同，每個代表羥基或酰氧基)或式(B)代表的化合物進(jìn)行反應(yīng) (其中R1B，R2B和R3B可以相同或者不同，每個代表羥基或酰氧基)，所說的親和性(對式(II)代表的化合物)以下列順序遞減化合物1-1＞化合物1-2＞化合物1-3，其中化合物1-1是式(II)代表的化合物，其中R1a和R3a是OCOCH3，R4a是OH，化合物1-2是式(II)代表的化合物，其中R1a和R4a是OH，R3a是OCOCH3，以及化合物1-3是式(II)代表的化合物，其中R1a，R3a和R4a是OCOCH3。
(2)根據(jù)上述(1)的單克隆抗體或其片段，其中所說的單克隆抗體是由雜交瘤KTM-205產(chǎn)生的單克隆抗體KTM-205。
(3)一種單克隆抗體或其片段，其對以式(III)代表的化合物具有親和性 (其中R1b，R3b和R4b可以相同或者不同，每個代表羥基或酰氧基；R2b代表H，OH，或酰氧基，前提是R2b是H或OH，至少R1b，R3b和R4b其中一種是酰氧基)，并且其實(shí)質(zhì)上不與以式(C)代表的化合物進(jìn)行反應(yīng) (其中R1C，R2C和R3C可以相同或者不同，每個代表羥基或酰氧基)，所說的親和性(對以式(III)代表的化合物)以下列順序遞減化合物2-1＞化合物2-2＞化合物2-3，其中化合物2-1是以式(III)代表的化合物，其中R1b和R3b是OCOCH3，R2b是H，和R4b是OH，化合物2-2是以式(III)代表的化合物，其中R1b，R3b和R4b是OCOCH3，R2b是H，以及化合物2-3是以式(III)代表的化合物，其中R1b和R4b是OH，R2b和R3b是OCOCH3。
(4)根據(jù)上述(3)的單克隆抗體或其片段，其中所說的單克隆抗體是由雜交瘤KTM-240產(chǎn)生的單克隆抗體KTM-240。
(5)一種單克隆抗體或其片段，其對以式(IV)代表的化合物具有親和性 (其中R1c，R2c和R3c可以相同或者不同，每個代表羥基或酰氧基；前提是R1c，R2c和R3c至少其中一種是酰氧基)，并且其實(shí)質(zhì)上不與以式(D)代表的化合物進(jìn)行反應(yīng) (其中R1D，R3D和R4D可以相同或者不同，每個代表羥基或酰氧基，以及R2D是H，OH或酰氧基)，所說的親和性(對以式(IV)代表的化合物)以下列順序遞減化合物3-1＞化合物3-2，其中化合物3-1是以式(IV)代表的化合物，其中R1c是OH，R2c和R3c是OCOCH3，化合物3-2是以式(IV)代表的化合物，其中R1c，R2c和R3c是OCOCH3。
(6)根據(jù)上述(5)的單克隆抗體或其片段，其中單克隆抗體是由雜交瘤KTM-249產(chǎn)生的單克隆抗體KTM-249。
(7)一種能夠產(chǎn)生根據(jù)上述(1)或(2)的單克隆抗體的雜交瘤。
(8)一種能夠產(chǎn)生根據(jù)上述(3)或(4)的單克隆抗體的雜交瘤。
(9)一種能夠產(chǎn)生根據(jù)上述(5)或(6)的單克隆抗體的雜交瘤。
(10)根據(jù)上述(7)的雜交瘤，以保藏號FERM BP-6835保藏于國立生物科學(xué)和人類技術(shù)研究所工業(yè)科學(xué)和技術(shù)機(jī)構(gòu)。
(11)根據(jù)上述(8)的雜交瘤，以保藏號FERM BP-6836保藏于國立生物科學(xué)和人類技術(shù)研究所工業(yè)科學(xué)和技術(shù)機(jī)構(gòu)。
(12)根據(jù)上述(9)的雜交瘤，以保藏號FERM BP-6837保藏于國立生物科學(xué)和人類技術(shù)研究所工業(yè)科學(xué)和技術(shù)機(jī)構(gòu)。
(13)一種用于產(chǎn)生雜交瘤的方法，該雜交瘤產(chǎn)生根據(jù)上述1-6任一的單克隆抗體，該方法包括通過給動物施用一種從以式(I)代表的化合物 (其中R1代表H或酰氧基；R2，R3和R4可以相同或者不同，每個代表H，羥基或酰氧基；以及Z1代表OCOCH2CH(CH3)2，和Z2代表H，或Z1和Z2一起代表＝O，假如R1，R2，R3，和R4中的至少其中一種是OH)通過把其中的至少一個羥基基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)轷Ｑ趸⑼ㄟ^把一種載體物質(zhì)結(jié)合到其3-位碳原子上制備的物質(zhì)免疫動物，并通過把一種永久生長細(xì)胞與一種從免疫動物中獲得的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞相融合，以獲得雜交瘤。
(14)根據(jù)上述13的方法，其中式(I)中的R2是酰氧基。
(15)根據(jù)上述13的方法，其中，通過把至少其中一個羥基基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)轷Ｑ趸?，通過在3-位使用一個取代基作為接頭，把載體物質(zhì)結(jié)合到從一種以式(I)代表的化合物制備的化合物的3-位碳原子上。
(16)根據(jù)上述13的方法，其中，將從以式(I)代表的化合物通過把至少其中一個羥基基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)橐設(shè)R所代表的基團(tuán)(其中R代表一個取代的或未取代的低級酰基或取代的或未取代的芳香酰基)制備的化合物溶解于溶劑(該溶劑不是有機(jī)溶劑或不包含有機(jī)溶劑)中，然后結(jié)合到載體物質(zhì)上。
(17)根據(jù)上述16的方法，其中不是有機(jī)溶劑或不包含有機(jī)溶劑的該溶劑是水。
(18)用于測定樣品中單端孢菌毒素真菌毒素的免疫測定方法，包括使至少一種根據(jù)上述(1)-(6)的單克隆抗體和其片段作用于包含單端孢菌毒素真菌毒素的樣品。
(19)用于測定樣品中單端孢菌毒素真菌毒素的免疫測定方法，包括把化合物(具有至少一個羥基基團(tuán)的、以式(I)所代表的)中的至少一個羥基基團(tuán)轉(zhuǎn)變成以O(shè)R所代表的基團(tuán)(其中R代表一個取代的或未取代的低級?；蛞粋€取代的或未取代的芳香?；?，并且使至少一種根據(jù)上述(1)-(6)的單克隆抗體和其片段作用于包含單端孢菌毒素真菌毒素的樣品。
(20)根據(jù)上述(18)或(19)的免疫測定方法，其中單端孢菌毒素真菌毒素選自下組脫氧瓜萎鐮菌醇(DON)，瓜萎鐮菌醇(NIV)，T-2毒素(T-2)及其衍生物。
(21)一種測定樣品中DON，NIV，T-2及其衍生物的總量的方法，該方法包括使用根據(jù)上述(3)或(4)的單克隆抗體或者片段、從根據(jù)上述(18)或(19)的免疫測定方法獲得的值或使用根據(jù)上述(5)或(6)的單克隆抗體或者片段、從根據(jù)上述(18)或(19)的免疫測定方法獲得的值計算總量。
(22)一種測定樣品中NIV及其衍生物的方法，該方法包括使用根據(jù)上述(1)或(2)的單克隆抗體或者片段、根據(jù)上述(18)或(19)實(shí)施免疫測定。
(23)一種測定樣品中DON，NIV及其衍生物的方法，該方法包括使用根據(jù)上述(3)或(4)的單克隆抗體或者片段、根據(jù)上述(18)或(19)實(shí)施免疫測定。
(24)一種測定樣品中DON及其衍生物的方法，該方法包括使用根據(jù)上述(3)或(4)的單克隆抗體或者片段、從根據(jù)上述(18)或(19)的免疫測定獲得的值或使用根據(jù)上述(1)或(2)的單克隆抗體或者片段、從根據(jù)上述(18)或(19)的免疫測定獲得的值計算DON及其衍生物的量。
(25)一種測定樣品中T-2及其衍生物的方法，該方法包括使用根據(jù)上述(5)或(6)的單克隆抗體或者片段、根據(jù)上述(18)或(19)實(shí)施免疫測定。
(26)根據(jù)上述(18)或(19)的免疫測定方法，其中免疫測定方法選自下組放射免疫測定，酶免疫測定，熒光免疫測定和發(fā)光免疫測定。
(27)根據(jù)上述(18)或(19)的免疫測定方法，其中免疫測定方法選自下組競爭免疫測定和夾心免疫測定。
(28)一種用于測定單端孢菌毒素真菌毒素的免疫測定的試劑，包含至少一種根據(jù)上述(1)至(6)的單克隆抗體及其片段作為活性成分。
(29)一種用于測定單端孢菌毒素真菌毒素的免疫測定的試劑盒，包含根據(jù)上述(28)的試劑和一個固定抗原的固相平板。
(30)一種用于測定單端孢菌毒素真菌毒素的免疫測定的試劑盒，包含根據(jù)上述(28)的試劑和一個固定抗原的固相平板，一種與根據(jù)上述(1)至(6)任一的單克隆抗體及其片段起反應(yīng)的標(biāo)記的抗體或抗體片段，以及一種用于檢測所說抗體或抗體片段標(biāo)記的試劑。
(31)一種用于測定單端孢菌毒素真菌毒素的免疫測定的試劑盒，包含根據(jù)上述(28)的試劑和一個固定抗原的固相平板，一種被標(biāo)記的根據(jù)上述(1)至(6)任一的單克隆抗體及其片段，以及一種用于檢測所說抗體或抗體片段標(biāo)記的試劑。
(32)一種用于測定單端孢菌毒素真菌毒素的免疫測定的試劑盒，包含根據(jù)上述(28)的試劑和一種預(yù)處理樣品(使以式(I)代表的化合物中的羥基轉(zhuǎn)變成為以O(shè)R(其中R具有如上述限定的相同的含義)代表的基團(tuán))的溶液。
(33)一種用于測定單端孢菌毒素真菌毒素的免疫測定的試劑盒，包含根據(jù)上述(28)的試劑，一個固定抗原的固相平板，和一種預(yù)處理樣品(使以式(I)代表的化合物中的一個羥基轉(zhuǎn)變成為以O(shè)R(其中R具有如上述限定的相同的含義)代表的基團(tuán))的溶液。
(34)一種用于測定單端孢菌毒素真菌毒素的免疫測定的試劑盒，包含根據(jù)上述(28)的試劑，一個固定抗原的固相平板，一種與根據(jù)上述(1)至(6)中的任何單克隆抗體及其片段起反應(yīng)的標(biāo)記的抗體或抗體片段，一種用于檢測所說抗體或抗體片段標(biāo)記的試劑，以及一種預(yù)處理樣品(使以式(I)代表的化合物中的羥基轉(zhuǎn)變成為以O(shè)R(其中R具有如上述限定的相同的含義)代表的基團(tuán))的溶液。
(35)一種用于測定單端孢菌毒素真菌毒素的免疫測定的試劑盒，包含一個固定抗原的固相平板，一種根據(jù)上述(1)至(6)中被標(biāo)記的任何單克隆抗體及其片段，一種用于檢測所說抗體或抗體片段標(biāo)記的試劑，以及一種預(yù)處理樣品(使以式(I)代表的化合物中的一個羥基轉(zhuǎn)變成為以O(shè)R(其中R具有如上述限定的相同的含義)代表的基團(tuán))的溶液。
(36)一種用于測定單端孢菌毒素真菌毒素的方法，該方法包括用包含有機(jī)溶劑的溶液處理包含單端孢菌毒素真菌毒素的樣品，以從樣品中提取單端孢菌毒素真菌毒素，以及通過根據(jù)上述(18)或(19)的免疫測定方法測定提取的單端孢菌毒素真菌毒素。
(37)根據(jù)上述(36)的方法，其中有機(jī)溶劑是一種水溶性的有機(jī)溶劑。
(38)根據(jù)上述(36)或(37)的方法，其中水溶性的有機(jī)溶劑至少是選自下組的一個成員甲醇，乙醇，丙醇，乙腈，二甲基亞砜，二甲基甲酰胺。
(39)一種通過免疫測定檢測樣品中產(chǎn)生單端孢菌毒素真菌毒素的微生物的方法，該方法包括向培養(yǎng)基中接種包含產(chǎn)生單端孢菌毒素真菌毒素的微生物的樣品，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)該微生物，以及使根據(jù)上述(1)至(6)的至少一種單克隆抗體及其片段作用于培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的單端孢菌毒素真菌毒素。
(40)一種通過免疫測定鑒定樣品中產(chǎn)生單端孢菌毒素真菌毒素的微生物的方法，該方法包括向培養(yǎng)基中接種包含產(chǎn)生單端孢菌毒素真菌毒素的微生物的樣品，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)該微生物，以及使根據(jù)上述(1)至(6)的至少一種單克隆抗體及其片段作用于培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的單端孢菌毒素真菌毒素。1、產(chǎn)生單端孢菌毒素真菌毒素的單克隆抗體的方法產(chǎn)生本發(fā)明的單端孢菌毒素真菌毒素的單克隆抗體的方法描述如下。
單克隆抗體可由下列方法制備，該方法包括把一種產(chǎn)生抗體的細(xì)胞(從通過施用免疫原免疫的動物中獲得)與永久生長細(xì)胞如骨髓瘤細(xì)胞相融合，培養(yǎng)雜交瘤或把雜交瘤施用給動物以便造成腹水腫瘤，和從產(chǎn)生的培養(yǎng)物或腹水中分離和純化單克隆抗體。
為了獲得本發(fā)明的單端孢菌毒素真菌毒素的單克隆抗體，有必要使用供免疫接種的一種抗原的綴合物作為免疫原以及高分子量的載體(也稱載體物質(zhì))。用于免疫接種的抗原可通過從樣品中純化或通過化學(xué)合成獲得。在此過程中，使用乙?；膯味随呔舅卣婢舅亍Ｍㄟ^使用綴合物(在真菌毒素的3-位利用取代基作為接頭，通過把高分子量載體結(jié)合到乙酰化的單端孢菌毒素真菌毒素上制備的)作為免疫原能有效獲得根據(jù)本發(fā)明的所需的單克隆抗體。
作為用于免疫的抗原，使用通過把以式(I)所代表的化合物中的一個羥基轉(zhuǎn)變?yōu)橐設(shè)R所代表的基團(tuán)(其中R具有如上述定義的相同的含義)制備的化合物。優(yōu)選地，使用以式(b-1)所代表的化合物 和以式(b-2)所代表的化合物 通過把禾谷鐮孢、黃色鐮孢、擬枝孢鐮孢等的菌株接種到合適的培養(yǎng)基中，并在大致為室溫下培養(yǎng)約20天，再通過合適的方法純化來制備樣品。合適的培養(yǎng)基包括市售的培養(yǎng)基如馬鈴薯-葡萄糖培養(yǎng)基，以及例如通過把磨光的大米與蒸餾水弄濕，然后在滅菌鍋中滅菌配置的培養(yǎng)基。通過用丙酮腈/水(3∶1v/v)提取獲得的培養(yǎng)物并把提取物通過一個用幾層Florisil和無水硫酸鈉包裝或幾層硅膠和無水硫酸鈉填裝的柱子，或借助于再結(jié)晶的方式進(jìn)行純化。樣品也可通過從污染霉菌的谷物中提純獲得。通過任何能夠純化所需物質(zhì)的方法，例如，通過使用TCL板或通過HPLC進(jìn)行純化。市售的樣品也是有用的。
作為高分子量的載體，可使用任何高分子量的物質(zhì)，只要該物質(zhì)具有與免疫接種的抗原中的羧基，氨基，或類似基團(tuán)縮合的反應(yīng)基團(tuán)，并且能夠賦予供免疫接種的抗原以免疫原性或當(dāng)與抗原結(jié)合時提高抗原的免疫原性。
合適的的高分子量物質(zhì)包括蛋白質(zhì)如牛血清白蛋白(BSA)，球蛋白，匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)，甲狀腺球蛋白，多糖如葡萄糖和瓊脂糖，包含聚苯乙烯和丙烯酸膠的膠乳微粒，多核苷酸如多尿苷酸和多腺苷酸，以及合成的高分子量物質(zhì)如MAP(多抗原肽)。高分子量物質(zhì)可通過各種方法結(jié)合到單端孢菌毒素真菌毒素上，如使用Nobuo Sakato，Meneki JikkenSosaho(免疫實(shí)驗(yàn)操作書冊)，第151頁(Shunsuke Migita等編，Nankodo，1995)所描述的方法(碳二酰亞胺法，戊二醛法以及二異氰酸鹽法)，使用羧基的方法(活性酯法，酸酐混合物法以及酰疊氮法)，使用巰基的方法(MBS法和SPDP法)以及使用羥基的方法(溴化氰法和過碘酸氧化法)。在這些方法中，重要的是在含水的培養(yǎng)基中，而不是在有機(jī)溶劑中或包含有機(jī)溶劑的溶液中溶解單端孢菌毒素真菌毒素，以便使其在動物中產(chǎn)生充分的免疫原性。
免疫原施用到動物如小鼠，大鼠，倉鼠，野兔，豚鼠，山羊，棉羊，馬或家禽，優(yōu)選施用到小鼠，大鼠或倉鼠體內(nèi)。
根據(jù)在Saido和Toyoshima，Shin Seikagaku Jikken Koza(生化實(shí)驗(yàn)新講義，1389(1990)，Tokyo Kagaku Dojin等)中所描述的方法可以實(shí)行免疫接種。例如，免疫原用完全或者不完全的Freund氏佐劑乳化，產(chǎn)生的乳化液通過腹腔，皮下或肌肉注射到動物體內(nèi)。施用1.0至300μg的免疫原2次或多次，優(yōu)選地定期間隔7至30天施用2至4次，優(yōu)選地12-16天完成免疫接種。
產(chǎn)生抗體的細(xì)胞可從免疫接種動物的脾，淋巴結(jié)，外周血液等等獲得。產(chǎn)生抗體的細(xì)胞也可通過所謂的“體外免疫接種”獲得，即，通過直接免疫接種負(fù)責(zé)產(chǎn)生抗體的細(xì)胞(從免疫接種動物的脾，淋巴結(jié)，外周血液等收集)[Arai與Ohta等等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)藥，643(1988)]。
至于用于與產(chǎn)生抗體的細(xì)胞融合的骨髓瘤細(xì)胞沒有特定的限制，但優(yōu)選地是使用來源于與產(chǎn)生抗體的細(xì)胞相同的動物的細(xì)胞系。
優(yōu)選地還使用具有特定的藥物標(biāo)記的骨髓瘤細(xì)胞，以便有效地選擇合適地進(jìn)行融合的細(xì)胞。例如，優(yōu)選地抗-8-氮鳥嘌呤的骨髓瘤細(xì)胞，因?yàn)樗鼈儾荒茉诤吸S嘌呤，氨基蝶呤和胸苷培養(yǎng)基(HAT培養(yǎng)基)上生長，由這些骨髓瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞融合產(chǎn)生的融合細(xì)胞能在HAT培養(yǎng)基中生長，因而可從未融合的骨髓瘤細(xì)胞區(qū)別開來。特定的例子是P3×63-Ag，P3×-Ag8-U1和SP2/O-Ag14。這些骨髓瘤細(xì)胞從物理化學(xué)研究所的細(xì)胞庫中可以獲得。
通過應(yīng)用Kohler和Milstein開發(fā)的方法[Nature 256495(1975)]及其快捷和各種各樣的修正方法可以實(shí)行細(xì)胞融合。在一通常使用的方法中，產(chǎn)生抗體的細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞以10至3∶1的比例相混合，并用30至50％的聚乙二醇(平均分子量1500至6000)作為融合因子處理。也可通過電穿孔實(shí)施融合[Ohkouchi等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)藥，650(1988)]。
經(jīng)細(xì)胞融合處理的細(xì)胞懸浮于選擇培養(yǎng)基中并在有利于選擇所需細(xì)胞的培養(yǎng)器皿中如96孔的培養(yǎng)皿培養(yǎng)，選擇性地使融合的細(xì)胞生長。
術(shù)語“選擇性培養(yǎng)基”是指允許具有特定的藥物標(biāo)記或類似物的細(xì)胞選擇性生長的培養(yǎng)基。例如，通過使用HAT選擇性培養(yǎng)基(補(bǔ)充有10％FCS和含有1×10-4mol/l次黃嘌呤，4×10-7mol/l氨基蝶呤和2×10-5mol/l胸苷培養(yǎng)基)或類似的培養(yǎng)基，在骨髓瘤細(xì)胞的8-氮鳥嘌呤的抗性基礎(chǔ)上有效地選擇從產(chǎn)生抗體的細(xì)胞與P3×63-Ag骨髓瘤細(xì)胞相融合產(chǎn)生的融合細(xì)胞。
通過一種如酶免疫測定或放射免疫測定的方法，在融合細(xì)胞的上清培養(yǎng)基中檢測所需抗體的存在，可從選擇性生長的融合細(xì)胞中選擇對目標(biāo)物質(zhì)產(chǎn)生抗體的細(xì)胞。從所選擇的細(xì)胞中獲得的單細(xì)胞克隆通過有限稀釋的方法，軟瓊脂培養(yǎng)法或類似的方法以獲得產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤。
雜交瘤在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，或通過腹膜移植到動物上，并使其在腹水中生長。從收集的培養(yǎng)物或腹水可以獲得單克隆抗體。如果必要的話，提純之后可使用培養(yǎng)物或腹水中的抗體?？赏ㄟ^各種方法進(jìn)行純化，例如，單獨(dú)地或結(jié)合用硫酸胺鹽析分離，使用離子交換層析，凝膠過濾柱層析，利用蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)C的親和柱層析，利用固定抗原的凝膠柱層析。
通過以上描述的方法可獲得抗-單端孢菌毒素真菌毒素的單克隆抗體。由此獲得的單克隆抗體分別包括指定為KTM-205，KTM-240和KTM-249的單克隆抗體。
單克隆抗體KTM-205對以式(1I)所代表的化合物具有親和性，實(shí)質(zhì)上并不與以式(A)或(B)所代表的化合物起反應(yīng)。其對化合物1-1，化合物1-2，化合物1-3的親和性具有以下遞減的順序化合物1-1＞化合物1-2＞化合物1-3。
單克隆抗體KTM-240對以式(III)所代表的化合物具有親和性，實(shí)質(zhì)上并不與以式(C)所代表的化合物起反應(yīng)。其對化合物2-1，化合物2-2，化合物2-3的親和性具有以下遞減的順序化合物2-1＞化合物2-2＞化合物2-3。
單克隆抗體KTM-249對以式(IV)所代表的化合物具有親和性，實(shí)質(zhì)上并不與以式(D)所代表的化合物起反應(yīng)。其對化合物3-1，化合物3-2的親和性具有以下遞減的順序化合物3-1＞化合物3-2＞。2、測定單端孢菌毒素真菌毒素的方法包含在樣品中的單端孢菌毒素真菌毒素可通過任何一種能夠測定單端孢菌毒素真菌毒素的免疫測定方法測定，但優(yōu)選地是使用本發(fā)明的單克隆抗體或單克隆抗體片段測定。
包含真菌毒素的樣品包括所有可能包含真菌毒素的物質(zhì)，例如，農(nóng)作物，通過加工農(nóng)作物獲得的產(chǎn)品，以及栽培農(nóng)作物的環(huán)境因子。
農(nóng)作物可以是任何農(nóng)作物，例如，水稻，大麥，小麥，黑麥，燕麥，大豆，玉米和土豆。農(nóng)作物包括生長在栽培田間如農(nóng)場和市場上的那些作物。
通過加工農(nóng)作物所獲得的產(chǎn)品包括所有通過加工農(nóng)作物所獲得的食品與飲料。
包含真菌毒素的樣品也包括飼料，即，家畜的飼料，家禽如豬，牛的肉，奶，蛋，和家禽的飼料，以及通過加工如肉，奶，蛋所獲得的產(chǎn)品。
農(nóng)作物栽培的環(huán)境因子包括構(gòu)成農(nóng)作物環(huán)境的各種因子，例如無機(jī)因子如濕度和土壤，粘附在無機(jī)因子上生活的微生物，飄浮在空中的微生物孢子，以及有機(jī)殘余物如植物的殘樁或者殘茬。
包含真菌毒素的大多數(shù)上述提到的樣品是固體。因此，樣品可以經(jīng)過預(yù)處理從樣品中收集真菌毒素，并且制成適合于一般免疫測定的液態(tài)樣品，除非不必要提取真菌毒素。以下列方式實(shí)行預(yù)處理。
通過處理包含真菌毒素的樣品可以收集真菌毒素，照這種方法或被破碎以后，用有機(jī)溶劑提取真菌毒素和收集提取物。
樣品可用任何方法破碎，只要真菌毒素通過破碎處理不分解或不消失。合適的方法包括用研缽和研杵，通過超聲波搗碎或通過碾磨機(jī)和杵錘，或用刀切碎。
樣品照此或由上述方法處理之后，用有機(jī)溶劑處理，例如，通過直接把樣品浸沒在有機(jī)溶劑中。通過操作如攪拌和超聲處理可以提高提取效率。
盡管可以使用任何有機(jī)溶劑，優(yōu)選的有機(jī)溶劑是水溶性的，如甲醇，乙醇，丙醇，丙酮腈，二甲亞砜和二甲基甲酰胺。整個提取物中的有機(jī)溶劑的含量為25％或更多，優(yōu)選地為50％或更多，更優(yōu)選地為75％或更多。
通過蒸發(fā)溶劑或把提取物通過柱子可收集有機(jī)溶劑提取的單端孢菌毒素真菌毒素。
根據(jù)本發(fā)明的預(yù)處理過程可進(jìn)一步包括把單端孢菌毒素真菌毒素的一部分轉(zhuǎn)化成為它們的衍生物的步驟，例如，部分的?；饔貌襟E，優(yōu)選地部分的乙?；饔谩Ｒ阴；饔玫牟襟E描述如下。
通過把試驗(yàn)化合物溶解在一種合適的溶劑中，并加入乙酸酐和堿使其反應(yīng)進(jìn)行乙?；饔谩：线m的溶劑包括含鹵素有機(jī)溶劑如二氯甲烷和三氯甲烷，以及不與乙酸酐進(jìn)行反應(yīng)的一般溶劑如二乙基酯，DMF，DMSO和二氯甲烷。
在反應(yīng)中有用的堿包括有機(jī)堿如嘧啶和三乙基胺，以及無機(jī)堿，如碳酸氫鈉和碳酸鉀鹽。優(yōu)選的為嘧啶，既可作為堿，也可作為溶劑。
在部分的乙酰化作用中為了只使所需的部分乙?；?，有必要控制乙酸酐的濃度，反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間。優(yōu)選的是樣品在乙?；饔弥俺浞指稍?，反應(yīng)溫度不應(yīng)太高，且在反應(yīng)期間保持恒定，反應(yīng)時間保持恒定。
此外，有必要使反應(yīng)在合適的時間終止，以避免過度進(jìn)行反應(yīng)。
乙酸酐的濃度是干燥樣品重量的0.1至10000倍，優(yōu)選地為0.5至10倍，并且根據(jù)增加的有機(jī)溶劑的量必須加以調(diào)整。
在使用的溶劑的冰點(diǎn)和沸點(diǎn)之間的任何溫度可進(jìn)行反應(yīng)，但優(yōu)選地在30℃至50℃進(jìn)行，更優(yōu)選地在45℃進(jìn)行。只要能達(dá)到目的，這些乙?；饔脳l件不需要特別地加以限制。典型地，當(dāng)使用20mg的干燥樣品時，用50μl的嘧啶和25μl的乙酸酐在45℃下進(jìn)行反應(yīng)約45分鐘。
反應(yīng)開始之后可立即終止反應(yīng)，或進(jìn)行一周的時間，但從實(shí)際的觀點(diǎn)看，優(yōu)選地在一小時之內(nèi)終止反應(yīng)。
通過去除堿基和乙酸酐或加入堿可以終止反應(yīng)。破基和乙酸酐可通過蒸發(fā)去除。作為堿，優(yōu)選地使用碳酸氫鈉的水溶液。
只要能達(dá)到目的，以上這些乙?；饔脳l件不需要特別地加以限制。
在上述提到的包含單端孢菌毒素真菌毒素的樣品中，那些有可能包含產(chǎn)生單端孢菌毒素真菌毒素的微生物，例如，無需用有機(jī)溶劑抽提步驟和部分乙?；饔貌襟E中的一個或兩個步驟即可分析栽培作物的環(huán)境因子。即，當(dāng)這些樣品直接地接種到培養(yǎng)基使微生物生長之后，通過免疫測定可測定培養(yǎng)基中產(chǎn)生的式(II)，(III)，(IV)的化合物。也可把這些樣品接種到選擇性培養(yǎng)基上如Komada培養(yǎng)基(1g的K2HPO4，0.5g的KCl，0.5g的MgSO47H2O，0.01g的Fe-EDTA，2g的L-天冬酰胺，20g的D-半乳糖，1g的五氯硝基苯75％水合物，0.5g的膽酸鈉，1g的NaB4O710H2O，0.3的硫酸鏈霉素，15g的瓊脂和1000ml的蒸餾水，pH3.8-4.0)，把在選擇性培養(yǎng)基上生長的微生物接種到培養(yǎng)基中，然后通過免疫測定可測定培養(yǎng)基中產(chǎn)生的式(II)，(III)，(IV)的化合物。
此外，通過把含有Komada培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿放置在高于地面約90cm之上，并敞開在空氣中一定的時間，可以捕獲飄浮在空中的微生物的孢子。把捕獲孢子的培養(yǎng)皿在室溫(20℃-25℃)下培養(yǎng)約一周，出現(xiàn)的菌落可用作樣品。
只要微生物能在其中生長，可以使用任何培養(yǎng)基。優(yōu)選的是通過把精白米與一定量的蒸餾水置于一個能滅菌一段時間使其濕潤的器皿中制備的培養(yǎng)基，然后在滅菌鍋中滅菌。蒸餾水的量優(yōu)選地為精白米的1至10倍。稻米與水優(yōu)選地在滅菌鍋中滅菌15分鐘至半天。
本發(fā)明的免疫測定可以通過任何已知的免疫測定方法實(shí)施。
合適的方法包括各種敏感的免疫測定如利用放射性同位素標(biāo)記的免疫測定，利用酶的酶免疫測定，利用熒光物質(zhì)的熒光免疫測定，和利用發(fā)光物質(zhì)的發(fā)光免疫測定。
在免疫測定中，抗體或者抗原的量利用上述描述的標(biāo)記的抗原或抗體測定。在本發(fā)明中，任何檢測或測定抗原的方法可以用于免疫測定，但競爭性免疫測定和夾心免疫測定最合適的。
此外，上述方法的各種的修飾是已知的。例如，競爭性免疫測定的修飾包括(1)一種使用標(biāo)記的抗原和樣品中的抗原或用于與抗體或抗體片段結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)之間的競爭的方法，(2)一種使用液相樣品中的抗原或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與標(biāo)記的抗體或抗體片段結(jié)合的固定的抗原之間的競爭的方法，(3)一種使用標(biāo)記的抗原和樣品中的抗原或用于與固定的抗體或抗體片段結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)之間的競爭的方法。
夾心免疫測定一般地包括使固定在固相支持物的一級抗體(即，固定在合適的固相支持物如珠子，試管或平板)與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或樣品中的抗原起反應(yīng)，使結(jié)合在固定抗體(或抗體片段)上的抗原與二級抗體(或抗體片段)起反應(yīng)，以及通過某些適當(dāng)?shù)姆椒z測所形成的固定抗體-抗原-二級抗體(或抗體片段)的三分體復(fù)合物。一般地，通過用各種標(biāo)記的用于檢測的物質(zhì)標(biāo)記二級抗體(或抗體片段)，例如，放射性同位素，酶，熒光物質(zhì)，發(fā)光物質(zhì)和金屬。這些測定主要用于測定溶液中的抗原，但在單端孢菌毒素真菌毒素(存在于組織和細(xì)胞，以及用于檢測的濾膜上如硝酸纖維素濾膜或尼龍膜)的定性或定量的分析中也有用。
本發(fā)明提供用于測定單端孢菌毒素真菌毒素的免疫測定試劑或試劑盒。試劑盒由儀器和/或試劑的組合體組成，在組成或形式上可能有變化，至于其包含的物質(zhì)實(shí)質(zhì)上與以下描述的構(gòu)成成分或其部分相同。
根據(jù)本發(fā)明的免疫測定的試劑包含本發(fā)明的單克隆抗體或其作為活性成分的片段。根據(jù)本發(fā)明的用于樣品分析(需要?；襟E)的試劑盒包括把以式(I)所代表的化合物轉(zhuǎn)變成以式OR(其中R具有如以上所定義的相同的含義)所代表的化合物的預(yù)處理樣品的溶液和本發(fā)明的單克隆抗體或其片段。
根據(jù)本發(fā)明的免疫測定的上述試劑盒還可包含(當(dāng)需要時)樣品的稀釋劑，測定的平板，標(biāo)記的二級抗-鼠抗體，用于檢測標(biāo)記物質(zhì)的試劑，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)等等。
樣品合適的稀釋劑包括包含表面活性劑的溶液，緩沖液和蛋白質(zhì)如BSA或者酪蛋白。作為測定的平板，可以使用一種抗原-固定的96-孔的聚苯乙烯微量滴定板或相似物。合適的標(biāo)記的二級抗-鼠抗體包括對本發(fā)明的抗-單端孢菌毒素真菌毒素的單克隆抗體或抗體片段具有親和性的抗體，例如，兔抗-鼠免疫球蛋白抗體，該抗體用標(biāo)記的酶如辣根過氧化物酶(HRP)，牛小腸堿性磷酸酶和β-半乳糖苷酶，并且與緩沖液，蛋白質(zhì)如BSA或者酪蛋白，防腐劑等相混合。用于檢測標(biāo)記物質(zhì)的試劑可包含按照上述提到的標(biāo)記酶的各種成分；例如，當(dāng)使用辣根過氧化物酶時，試劑主要包含四甲基聯(lián)苯胺，鄰苯二胺，等等。在根據(jù)本發(fā)明的試劑中，也可使用直接用辣根過氧化物酶標(biāo)記的本發(fā)明的抗-單端孢菌毒素真菌毒素的單克隆抗體或抗體片段。此外，根據(jù)本發(fā)明的免疫測定試劑盒不必包含所有上述提到的組分，并且可以包括附加的組分。3、用于鑒定產(chǎn)生單端孢菌毒素真菌毒素的微生物的方法包含產(chǎn)生單端孢菌毒素真菌毒素的微生物的樣品包括栽培農(nóng)作物的環(huán)境因子，例如，濕度，土壤，空氣，飄浮在空中的孢子，以及有機(jī)殘余物如植物殘樁或殘茬。
產(chǎn)生單端孢菌毒素真菌毒素的微生物在栽培田間的殘余植物上形成子囊殼，例如，如水稻殘茬的有機(jī)殘余植物上。當(dāng)滿足如降水和高濕度的環(huán)境條件時，微生物的子囊孢子在空中散落以侵染開花或成熟期的作物。
因此，非常重要的是了解被產(chǎn)生單端孢菌毒素真菌毒素的微生物污染栽培田間的狀況以及它們產(chǎn)生真菌毒素的能力，以便預(yù)見真菌毒素?fù)p害的發(fā)生和采取對策。
產(chǎn)生單端孢菌毒素真菌毒素的菌株，當(dāng)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，特異性地在培養(yǎng)基中產(chǎn)生包括以式(II)，(III)和(IV)所代表的化合物的單端孢菌毒素真菌毒素。產(chǎn)生的單端孢菌毒素真菌毒素的種類和數(shù)量隨著產(chǎn)生單端孢菌毒素真菌毒素的菌株而變化。
因此，通過根據(jù)在上述2中描述的免疫測定，檢測在樣品培養(yǎng)基中的上述化合物的存在可確認(rèn)在樣品中產(chǎn)生單端孢菌毒素真菌毒素的微生物。此外，根據(jù)在上述2中描述的免疫測定，通過定性和定量地分析菌株產(chǎn)生的單端孢菌毒素真菌毒素可鑒定菌株。
根據(jù)在上述2中描述的免疫測定，通過鑒定存在于田間的產(chǎn)生單端孢菌毒素真菌毒素的微生物，還可能了解栽培田間的環(huán)境污染狀況。
上述樣品直接接種到培養(yǎng)基中使微生物生長，測定培養(yǎng)基中以式(II)，(III)和(IV)所代表的化合物以檢測由產(chǎn)生單端孢菌毒素真菌毒素的微生物的污染。也可以把樣品接種到在選擇性培養(yǎng)基如Komada培養(yǎng)基上(1g的K2HPO4，0.5g的KCl，0.5g的MgSO47H2O，0.01g的Fe-EDTA，2g的L-天冬酰胺，20g的D-半乳糖，1g的五氯硝基苯75％水合物，0.5g的膽酸鈉，1g的NaB4O710H2O，0.3的硫酸鏈霉素，15g的瓊脂和1000ml的蒸餾水，pH3.8-4.0)。接種通過在選擇性培養(yǎng)基上生長的微生物至培養(yǎng)基中，然后測定在培養(yǎng)基中產(chǎn)生的(II)，(III)和(IV)的化合物以檢測微生物的污染。此外，通過把含有Komada培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿放置在高于地面約90cm之上，并敞開在空氣中一定的時間，可以捕獲飄浮在空中的微生物的孢子。把捕獲孢子的培養(yǎng)皿在室溫(20℃-25℃)下培養(yǎng)約一周，可以有利地使用出現(xiàn)的菌落。
作為培養(yǎng)基，可以使用各種培養(yǎng)基。優(yōu)選的是通過把精白米與一定量的蒸餾水置于一個能滅菌一段時間使其濕潤的器皿中制備的培養(yǎng)基，然后在滅菌鍋中滅菌。
附圖2表示利用KTM-240測定單端孢菌毒素真菌毒素的校準(zhǔn)曲線。
附圖3表示利用KTM-249測定單端孢菌毒素真菌毒素的校準(zhǔn)曲線。
附圖4表示利用KTM-240和KTM-249測定單端孢菌毒素真菌毒素的校準(zhǔn)曲線。
附圖5表示由ELISA測定的樣品中的根據(jù)本發(fā)明的單端孢菌毒素真菌毒素的量與由GC-MS所測定的相同的樣品中的單端孢菌毒素真菌毒素的量的相關(guān)性。
附圖6表示用KTM-240在禾谷鐮孢培養(yǎng)物(通過在稻米培養(yǎng)基中培養(yǎng)所獲得的)中的單端孢菌毒素真菌毒素的測定結(jié)果。
附圖7表示從不同的栽培田間的水稻主莖上分離的菌株的培養(yǎng)物中的單端孢菌毒素真菌毒素的測定結(jié)果。
獲得的含有式(b-1)和式(b-1)的化合物(各0.5克)的濃縮物，在加入0.01％TritonX-100和探針類型的超聲發(fā)生器的幫助下(Model UR-200P，Tommy Seiko)，分別溶于50μl的10mM的包含140mM氯化鈉(下文簡寫為PBS)的磷酸緩沖液中。每種溶液用0.5ml的無水匙孔血藍(lán)蛋白(下文簡寫為KLH)(20mg/ml)。當(dāng)每種混合物調(diào)整至pH7.5后，向其中加入20mg的EDC[1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基碳二亞胺]，再在室溫下反應(yīng)6小時。當(dāng)反應(yīng)完成之后，在PBS中進(jìn)行透析以獲得作為透析液的單端孢菌毒素真菌毒素衍生物[式(b-1)]-KLH和單端孢菌毒素真菌毒素衍生物[式(b-2)]-KLH的水溶液。通過Lowry蛋白質(zhì)分析試劑盒(Bio-Rad)用牛血清白蛋白(下文簡寫為BSA)作為對照測定水溶液中的蛋白質(zhì)濃度。用BSA代替KLH重復(fù)上述過程，依靠它獲得單端孢菌毒素真菌毒素衍生物[式(b-1)]-BSA綴合物和單端孢菌毒素真菌毒素衍生物[式(b-2)]-BSA綴合物。c)單克隆抗體的制備6周齡的Balb/c雄鼠以1∶1的完全Freund佐劑和單端孢菌毒素真菌毒素衍生物[式(b-1)或式(b-2)]-KLH的混合物以每只動物0.1mg的量在背部皮下注射。以3周的間隔在鼠的背部進(jìn)一步把上述1∶1的混合物(0.1mg/每只動物)皮下注射2次。3周之后，溶解于PBS的單端孢菌毒素真菌毒素衍生物[式(b-1)或式(b-2)]-KLH(0.1mg/每只動物)通過尾部靜脈施藥到該老鼠中，3天之后，以下列方式從脾獲得產(chǎn)生抗體的細(xì)胞。
從免疫接種的動物中無菌地切下脾，在無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(Nissui Pharmaceutical有限公司)中解開，并通過100-篩孔的網(wǎng)釋放脾細(xì)胞。脾細(xì)胞懸浮于低滲溶液中以溶解其中的紅細(xì)胞，并用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基用離心方式洗滌3次以獲得產(chǎn)生抗體的細(xì)胞。
另一方面，P3X-Ag8-U1骨髓瘤細(xì)胞在包含10％的小牛胎兒血清(FCS)的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在對數(shù)生長期時收集細(xì)胞并用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基用離心方式洗滌3次。
獲得的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞懸浮液和P3X-Ag8-U1骨髓瘤細(xì)胞以10∶1的比例相混合，并在1200rpm離心5分鐘，以除去培養(yǎng)液。向獲得的細(xì)胞中慢慢加入1ml的50％的聚乙二醇1500(Boehringer Mannheim GmbH)溶液，然后逐漸加入50ml的無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，再在1200rpm下離心5分鐘，以除去培養(yǎng)基。獲得的細(xì)胞懸浮于HAT培養(yǎng)基中(補(bǔ)充有10％FCS和含有1×10-4M次黃嘌呤，4×10-7M氨基蝶呤和2×10-5M胸苷的RPMI-1640培養(yǎng)基)，密度為1×104細(xì)胞/ml，把細(xì)胞懸浮液置于一個96-孔的微量滴定板中，每個孔200μl。細(xì)胞在37℃于5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)10天之后，在所有的孔中觀察到雜交瘤菌落。
以下列方式通過ELISA篩選培養(yǎng)上清的抗體滴度，為了選擇包含產(chǎn)生所需抗體的細(xì)胞的孔。向96-孔的微量滴定板中的每個孔中加入50μl的單端孢菌毒素真菌毒素衍生物[式(b-1)或式(b-2)]-BSA的綴合物(20μg/ml，0.1M碳酸緩沖液，pH9.5)，讓平板于4℃下過夜，然后用PBS洗滌3次。把250μl的1％BSA/PBS加入到每個孔之后，讓平板在室溫下放置1小時，然后用PBS洗滌3次以準(zhǔn)備反應(yīng)的平板。向該平板的每個孔中加入50μl的用含有0.1％BSA的PBS稀釋11倍的培養(yǎng)上清液，讓該平板在室溫下放置3小時使之進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)完成之后，平板用含有0.05％吐溫20的PBS洗滌5次。然后，向每個孔中加入50μl的過氧化物酶(POD)-標(biāo)記的抗-鼠免疫球蛋白兔IgG(Dako)，緊接著在室溫下反應(yīng)1小時。平板用含有0.05％吐溫20的PBS洗滌5次之后，向每個孔中加入50μl的TMB顯色試劑(Intergen)，緊接著在室溫下反應(yīng)30分鐘。最后，向每個孔中加入50μl的1mol/l的硫酸水溶液，用一個微量板計數(shù)器(MTP-120，Corona電器有限公司)測定450nm的吸光值，選擇吸光值為1或大于1的孔中的細(xì)胞。
通過有限稀釋進(jìn)行克隆。上述選自孔中的細(xì)胞懸浮于包含10％的FCS和1×107細(xì)胞/毫升的胸腺細(xì)胞的RPMI-1640培養(yǎng)基中(細(xì)胞密度為0.5個細(xì)胞/毫升)，把細(xì)胞懸浮液以200μl的量置于一個96-孔的微量滴定板的每個孔中。細(xì)胞在37℃于5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在開始培養(yǎng)后，觀察10至14天，以選擇一些其中可觀察到一個菌落生長的孔。通過上述的ELISA在選擇的細(xì)胞中篩選培養(yǎng)上清的抗體滴度，以選擇包含產(chǎn)生所需抗體的菌株的孔。用單克隆抗體分類試劑盒(Zymet實(shí)驗(yàn)室公司)測定由此獲得菌株的培養(yǎng)上清中的抗體的免疫球蛋白類型。選擇產(chǎn)生IgG1亞類抗體的菌株，不包括那些產(chǎn)生IgG3或IgM亞類的抗體。
8周齡或更長周齡的雄性老鼠用降植烷(2，6，10，14-四甲基戊十碳烷)(0.5ml/每頭動物)腹腔內(nèi)注射，并保留2個星期。
然后向該鼠腹腔內(nèi)注射產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞(1×106細(xì)胞/每頭動物)。
7至14天之后，當(dāng)每個鼠的腹腔內(nèi)積累大量的腹水時，通過一個18G的注射器從腹腔中收集腹水，再通過在3000rpm下離心10分鐘收集上清。獲得的上清用結(jié)合緩沖液(3M NaCl，1.5M甘氨酸，pH8.9)稀釋3倍，并通過一個用結(jié)合緩沖液平衡的蛋白質(zhì)A柱子。當(dāng)柱子用PBS洗滌之后，用50mM甘氨酸/鹽酸緩沖液(pH2.5)洗脫抗體，洗脫液立即用1M的磷酸緩沖液(pH7.5)中和。由此收集的抗體溶液在PBS中充分透析，借此獲得包含純化的單克隆抗體。實(shí)施例2單克隆抗體特異性的檢查向96-孔的微量滴定板中的每個孔中加入實(shí)施例1中制備的50μl的單端孢菌毒素真菌毒素衍生物[式(b-1)或式(b-2)]-BSA的綴合物(20μg/ml，0.1M碳酸緩沖液，pH9.5)溶液，讓平板于4℃下過夜，然后用PBS洗滌3次。把250μl的1％BSA/PBS加入到每個孔之后，讓平板在室溫下放置1小時，然后用PBS洗滌3次以準(zhǔn)備反應(yīng)的平板。向該平板的每個孔中加入50μl的含有0.1％BSA的0.1mol/l的磷酸緩沖液(pH7.4)和各種濃度的各種單端孢菌毒素真菌毒素衍生物以及含有0.1％BSA(對照0％抑制)的0.1mol/l的磷酸緩沖液(pH7.4)，另外，實(shí)施例1中獲得的抗體用含有0.1％BSA的0.1mol/l的磷酸緩沖液(pH7.4)稀釋至100ng/ml的濃度，以每個孔中50μl的的量攪拌加入至平板的每個孔中。使該平板在4℃下過夜使孔中的混合物反應(yīng)。反應(yīng)完成之后，平板用含有0.05％吐溫20的PBS洗滌5次。然后，向每個孔中加入50μl POD-標(biāo)記的抗-鼠免疫球蛋白兔IgG，緊接著在室溫下反應(yīng)1小時。平板用含有0.05％吐溫20的PBS洗滌5次之后，向每個孔中加入50μl的TMB顯色試劑(Intergen)，緊接著在室溫下反應(yīng)30分鐘。最后，向每個孔中加入50μl的反應(yīng)終止液，用一個微量板計數(shù)器測定450nm的吸光值。對反應(yīng)中使用的單端孢菌毒素真菌毒素，制備其單端孢菌毒素真菌毒素濃度/吸光度曲線。從每種單端孢菌毒素真菌毒素衍生物相對于表示為100％的對照吸光度的反應(yīng)抑制率，測定每種抗體與每種單端孢菌毒素真菌毒素的反應(yīng)性。在所獲得的結(jié)果的基礎(chǔ)上，從實(shí)施例1確定的菌株中選擇適合于本目的的產(chǎn)生單克隆抗體的菌株。所選擇的菌株和由它們產(chǎn)生的單克隆抗體分別指定為KTM-205，KTM-240和KTM-249。根據(jù)下面各自的特征選擇實(shí)施例1中的菌株KTM-205，最低濃度的式(II)的化合物的抑制和式(A)或式(B)沒有實(shí)質(zhì)的抑制；KTM-240，最低濃度的式(III)的化合物的抑制和式(C)沒有實(shí)質(zhì)的抑制；以及KTM-249，最低濃度的式(IV)的化合物的抑制和式(D)沒有實(shí)質(zhì)的抑制。抗體的特異性表示于表1。
表1抗體的反應(yīng)性

注)相對反應(yīng)性(基于與表示為1的最大活性物質(zhì)的反應(yīng)性)。*實(shí)質(zhì)上未確認(rèn)的反應(yīng)性產(chǎn)生這些抗體的雜交瘤以KTM-205(FERMBP-6835)KTM-240(FERMBP-6836)和KTM-249(FERMBP-6837)，于1999年8月11日保藏于國立生物科學(xué)和人類-技術(shù)研究所工業(yè)科學(xué)和技術(shù)機(jī)構(gòu)，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki，日本。實(shí)施例3樣品中單端孢菌毒素真菌毒素的測定a)用于反應(yīng)的平板向96-孔的微量滴定板的每個孔中加入實(shí)施例1中制備的50μl的單端孢菌毒素真菌毒素衍生物[式(b-1)或式(b-2)]-BSA的綴合物(20μg/ml，0.1M碳酸緩沖液，pH9.5)溶液。讓該平板于4℃下過夜，然后用PBS洗滌3次。把300μl的1％BSA/PBS或脫脂乳/PBS加入到每個孔之后，讓平板在室溫下放置1小時，然后用PBS洗滌3次以準(zhǔn)備反應(yīng)的平板。b)用于分析的樣品制備向不同產(chǎn)地的小麥粉(每個10克)中加入40ml的甲醇/水(3∶1)，產(chǎn)生的懸浮液在室溫下偶爾攪拌放置90分鐘以用于提取。獲得的提取物通過濾紙過濾，收集過濾液。向2ml的過濾液中加入等量的甲醇，使混合物在4℃下放置4小時，然后于4℃下以3000rpm離心15分鐘。收集上清液并于4℃下保存。
保存的溶液(160μl)置于1ml的帶蓋子的試管中，在氣流中濃縮至干燥，然后把其置于一個真空器中一天一夜讓其完全干燥。向試管中加入50μl的干嘧啶，干燥的物質(zhì)完全地溶解于其中，再加入25μl的乙酸酐。擰緊試管的蓋子，使其在45℃下放置45分鐘。當(dāng)嘧啶和乙酸酐在氣流中完全蒸發(fā)后，加入100μl的乙醇和900μl的吐溫-PBS(含0.05％吐溫-20和140mM NaCl的10mM的磷酸緩沖液，pH7.4)制成待測定的樣品。NIV，DON和T-2的制備物單獨(dú)地用如以上相同的方式進(jìn)行處理，并用吐溫-PBS稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛纫灾苽溆米鳂?biāo)準(zhǔn)溶液的系列稀釋液。c)測定流程向每個用于反應(yīng)的平板的孔中加入50μl的待測樣品，一個標(biāo)準(zhǔn)溶液，或作為對照的吐溫-PBS(含0.05％吐溫-20和140mM NaCl的10mM的磷酸緩沖液，pH7.4)。向每個孔中再加入50μl的(1)KTM-205溶液(300ng/ml，包含0.1％BSA的吐溫-PBS)，(2)KTM-240溶液(300ng/ml，包含0.1％BSA的吐溫-PBS)，(3)KTM-249溶液((300ng/ml，包含0.1％BSA的吐溫-PBS)，或(2)和(3)的1∶1的混合物。當(dāng)充分?jǐn)嚢韬螅字械幕旌衔镌谑覝叵抡鹗幒蛿嚢璺磻?yīng)45分鐘。平板用吐溫-PBS洗滌5次，并向每個孔中加入100μl的HRP-標(biāo)記的抗-鼠免疫球蛋白兔抗體溶液(300ng/ml，包含0.1％BSA的吐溫-PBS)，再在室溫下震蕩和攪拌反應(yīng)30分鐘。當(dāng)平板用吐溫-PBS洗滌5次后，向每個孔中加入100μl的TMB溶液(Intergen)，再在黑暗處于室溫下震蕩和攪拌反應(yīng)30分鐘。然后，通過向每個孔中以50μl/每孔的量加入1mol/l的硫酸水溶液終止反應(yīng)，并用一個平板計數(shù)器(MTP-120，Corona電器有限公司)測定450nm波長的吸光值。d)濃度計算按照下列方程從每個孔的測定結(jié)果計算抑制率。對照的吸光度指孔中的反應(yīng)混合物(其中加入有吐溫-PBS(含0.05％吐溫-20和140mM的NaCl的10mM的磷酸緩沖液，pH7.4)，而不是樣品溶液或標(biāo)準(zhǔn)溶液)中的吸光度。抑制率(％)＝{(對照的吸光度)-(樣品的吸光度)}/(對照的吸光度)×100標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度用X軸上的對數(shù)刻度和Y軸上的抑制率作圖以準(zhǔn)備校準(zhǔn)曲線。校準(zhǔn)曲線表示于附


圖1，2，3，4。通過參照這些校準(zhǔn)曲線，以下列方式從每個樣品的抑制率測定每個樣品中的單端孢菌毒素真菌毒素的濃度。
從這些孔與KTM-205反應(yīng)的結(jié)果計算NIV及其衍生物的濃度，并從這些孔與KTM-240反應(yīng)的結(jié)果計算NIV，DON及其衍生物的濃度。通過從這些孔與KTM-240反應(yīng)的結(jié)果減去與KTM-205反應(yīng)的結(jié)果計算DON及其衍生物的濃度。從這些孔與KTM-249反應(yīng)的結(jié)果計算T-2及其衍生物的濃度。通過把這些孔與KTM-240反應(yīng)的結(jié)果與KTM-249反應(yīng)的結(jié)果相加計算NIV，DON，T-2及其衍生物的濃度。實(shí)施例4比較實(shí)施例通過GC-MS測定通過GS-GS測定如同實(shí)施例3中相同的樣品(小麥粉)的單端孢菌毒素真菌毒素。a)樣品制備把實(shí)施例3中制備的小麥粉樣品的每種保存溶液(160μl)置于一個1ml的有蓋試管中，在氣流中濃縮至干燥，然后把其置于一個真空器中一天一夜讓其完全干燥。加入25μl的三甲基硅烷基化劑(N-三甲基硅烷基咪唑N，O-雙三甲基硅烷基乙酰胺三甲基氯硅雄酮，3∶3∶2，v/v/v)后，擰緊試管的蓋子，使其在50℃下放置20分鐘。產(chǎn)生的混合物用500μl的n-己烷稀釋和用200μl的水洗滌。n-己烷層(400μl)用等量的n-己烷稀釋。b)用GC-MS測定獲得的每種稀釋液通過氣相色譜-質(zhì)譜儀(GC-MS，Shimadzu GCMS-QP2000)測定單端孢菌毒素真菌毒素。測定條件如下毛細(xì)管柱(ShimadzuHiCap-CBP1)；柱溫度，保持在120℃下持續(xù)5分鐘，以每分鐘8℃提高到280℃；進(jìn)口和界面溫度，280℃；離子源溫度，270℃；電離勢，70eV；掃描率(35-700m/z)，1.5次掃描/秒；上樣率，5點(diǎn)/秒。c)與實(shí)施例3比較如附圖5所示，測定結(jié)果與根據(jù)本發(fā)明的方法的實(shí)施例3所獲得的結(jié)果非常一致。圖5表示通過使用KTM-240同時測定DON和NIV的結(jié)果與通過GC-MS單獨(dú)測定DON和NIV結(jié)果的總和之間的相關(guān)性。實(shí)施例5確認(rèn)產(chǎn)生單端孢菌毒素真菌毒素的微生物的生長a)用于分析的樣品準(zhǔn)備精大米(50g)置于一個500ml的燒瓶中，并加入150ml的蒸餾水。燒瓶在室溫下放置1小時以使大米浸濕，然后在120℃滅菌25分鐘以制備培養(yǎng)基(大米培養(yǎng)基)。禾谷鐮孢(ATCC 15624)接種到該培養(yǎng)基中，并在室溫(20-25℃)下培養(yǎng)。每5天以每份500μl收集培養(yǎng)的上清液。單獨(dú)地，沒有接種任何菌株的培養(yǎng)基保存在室溫(20-25℃)下，每5天以每份500μl收集培養(yǎng)的上清液作為對照。向每個收集的樣品中加入2.5ml的丙酮腈/水(3∶1，v/v)再用勻漿機(jī)(Histcon NS-50，Nichi-on-i Rikakiki)磨碎，并以3000rpm離心10分鐘。獲得的上清立即在-80℃冷凍并作為待測樣品保存。b)微生物生長的確認(rèn)向96-孔的微量滴定板的每個孔中加入實(shí)施例1中制備的50μl的單端孢菌毒素真菌毒素衍生物[式(b-1)]-BSA的綴合物(20μg/ml，0.1M碳酸緩沖液，pH9.5)溶液。讓該平板于4℃下過夜，然后用PBS洗滌3次。把300μl的1％BSA/PBS或脫脂乳/PBS加入到每個孔之后，讓平板在室溫下放置1小時，然后用PBS洗滌3次以準(zhǔn)備反應(yīng)的平板。
冷凍保存的每種樣品于室溫下融化并充分?jǐn)嚢琛Ｈ诨臉悠?160μl)置于一個1ml的有蓋試管中并在氣流中濃縮至干燥。向試管中加入100μl的乙醇和900μl的吐溫-PBS(含0.05％的吐溫-20和140mM的NaCl的10mM的磷酸緩沖液，pH7.4)制成以下描述的待測樣品。
向反應(yīng)平板的每個孔中加入50μl的待測樣品，或作為對照的吐溫-PBS(含0.05％的吐溫-20和140mM的NaCl的10mM的磷酸緩沖液，pH7.4)。向每個孔中再加入50μl的KTM-240溶液(300ng/ml，包含0.1％BSA的吐溫-PBS)。當(dāng)充分?jǐn)嚢韬?，孔中的混合物在室溫下震蕩和攪拌反?yīng)45分鐘。平板用吐溫-PBS洗滌5次，并向每個孔中加入100μl的HRP-標(biāo)記的抗-鼠免疫球蛋白兔抗體溶液(300ng/ml，包含0.1％BSA的吐溫-PBS)，再在室溫下震蕩和攪拌反應(yīng)30分鐘。當(dāng)平板用吐溫-PBS洗滌5次后，向每個孔中加入100μl的TMB溶液(Intergen)，再在黑暗處于室溫下震蕩和攪拌反應(yīng)30分鐘。然后，通過向每個孔中以50μl/每孔的量加入1mol/l的硫酸水溶液終止反應(yīng)，并用平板計數(shù)器(MTP-120，Corona電器有限公司)測定450nm波長的吸光值。
結(jié)果表示于附圖6。吸光度隨著微生物的生長而減少，并且確認(rèn)微生物在生長和生長的微生物是產(chǎn)生單端孢菌毒素真菌毒素的微生物。實(shí)施例6檢測產(chǎn)生單端孢菌毒素真菌毒素菌株的存在向96-孔的微量滴定板的每個孔中加入實(shí)施例1中制備的50μl的單端孢菌毒素真菌毒素衍生物[式(b-1)]-BSA的綴合物(20μg/ml，0.1M碳酸緩沖液，pH9.5)溶液。讓該平板于4℃下過夜，然后用PBS洗滌3次。把300μl的1％BSA/PBS或脫脂乳/PBS加入到每個孔之后，讓平板在室溫下放置1小時，然后用PBS洗滌3次以準(zhǔn)備反應(yīng)的平板。
充分?jǐn)嚢枰陨汐@得的每種樣品。把500μl的每種樣品置于一個1ml的有蓋試管中并在氣流中濃縮至干。向試管中加入50μl的乙醇和450μl的吐溫-PBS(含0.05％的吐溫-20和140mM的NaCl的10mM的磷酸緩沖液，pH7.4)制成以下描述的待測樣品。
向反應(yīng)平板的每個孔中加入50μl的待測樣品，或作為對照的吐溫-PBS(含0.05％的吐溫-20和140mM的NaCl的10mM的磷酸緩沖液，pH7.4)。向每個孔中再加入50μl的(1)KTM-205溶液(300ng/ml，包含0.1％BSA的吐溫-PBS)或(2)KTM-240溶液(300ng/ml，包含0.1％BSA的吐溫-PBS)。當(dāng)充分?jǐn)嚢韬?，孔中的混合物在室溫下震蕩和攪拌反?yīng)45分鐘。平板用吐溫-PBS洗滌5次，并向每個孔中加入100μl的HRP-標(biāo)記的抗-鼠免疫球蛋白兔抗體溶液(300ng/ml，包含0.1％BSA的吐溫-PBS)，再在室溫下震蕩和攪拌反應(yīng)30分鐘。當(dāng)平板用吐溫-PBS洗滌5次后，向每個孔中加入100μl的TMB溶液(Intergen)，再在黑暗處于室溫下震蕩和攪拌反應(yīng)30分鐘。然后，通過向每個孔中以50μl/每孔的量加入lmol/l的硫酸水溶液終止反應(yīng)，并用平板計數(shù)器(MTP-120，Corona電器有限公司)測定450nm波長的吸光值。
結(jié)果表示于附圖7。在從栽培田塊A，B，D的水稻秸桿分離的菌株培養(yǎng)物中被檢測到單端孢菌毒素真菌毒素，而從栽培田塊C的水稻秸桿分離的菌株培養(yǎng)物中沒有檢測到單端孢菌毒素真菌毒素。這些結(jié)果表明栽培田塊A，B，D也被產(chǎn)生單端孢菌毒素真菌毒素的菌株污染的可能性，但否定栽培田間C被污染的可能性。從A，B，D的結(jié)果也證明田塊A主要是由產(chǎn)生DON的菌株污染，田塊B，D是由產(chǎn)生NIV的菌株污染。
工業(yè)實(shí)用性通過使用本發(fā)明的單克隆抗體或其片段可簡單、準(zhǔn)確地檢測或測定作物，食品，飼料等等中的單端孢菌毒素真菌毒素。
權(quán)利要求
1.一種單克隆抗體或其片段，其對式(II)代表的化合物具有親和性。 其中R1a，R3a和R4a可以相同或者不同，每個代表羥基或酰氧基，并且其實(shí)質(zhì)上不與以式(A)代表的化合物 其中R1A，R3A和R4A可以相同或者不同，每個代表羥基或酰氧基或式(B)代表的化合物進(jìn)行反應(yīng) 其中R1B，R2B和R3B可以相同或者不同，每個代表羥基或酰氧基，所說的對式(II)代表的化合物的親和性以下列順序遞減化合物1-1＞化合物1-2＞化合物1-3，其中化合物1-1是式(II)代表的化合物，其中R1a和R3a是OCOCH3，R4a是OH，化合物1-2是式(II)代表的化合物，其中R1a和R4a是OH，R3a是OCOCH3，以及化合物1-3是式(II)代表的化合物，其中R1a，R3a和R4a是OCOCH3。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的單克隆抗體或其片段，其中所說的單克隆抗體是由雜交瘤KTM-205產(chǎn)生的單克隆抗體KTM-205。
3.一種單克隆抗體或其片段，其對以式(III)代表的化合物具有親和性 其中R1b，R3b和R4b可以相同或者不同，每個代表羥基或酰氧基；R2b代表H，OH，或酰氧基，前提是R2b是H或OH，至少R1b，R3b和R4b其中一種是酰氧基，并且其實(shí)質(zhì)上不與以式(C)代表的化合物進(jìn)行反應(yīng) 其中R1C，R2C和R3C可以相同或者不同，每個代表羥基或酰氧基，所說的對以式(III)代表的化合物的親和性以下列順序遞減化合物2-1＞化合物2-2＞化合物2-3，其中化合物2-1是以式(III)代表的化合物，其中R1b和R3b是OCOCH3，R2b是H，和R4b是OH，化合物2-2是以式(III)代表的化合物，其中R1b，R3b和R4b是OCOCH3，R2b是H，以及化合物2-3是以式(III)代表的化合物，其中R1b和R4b是OH，R2b和R3b是OCOCH3。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的單克隆抗體或其片段，其中所說的單克隆抗體是由雜交瘤KTM-240產(chǎn)生的單克隆抗體KTM-240。
5.一種單克隆抗體或其片段，其對以式(IV)代表的化合物具有親和性 其中R1c，R2c和R3c可以相同或者不同，每個代表羥基或酰氧基；前提是R1c，R2c和R3c至少其中一種是酰氧基，并且其實(shí)質(zhì)上不與以式(D)代表的化合物進(jìn)行反應(yīng) 其中R1D，R3D和R4D可以相同或者不同，每個代表羥基或酰氧基，以及R2D是H，OH或酰氧基，所說的對以式(IV)代表的化合物的親和性以下列順序遞減化合物3-1＞化合物3-2，其中化合物3-1是以式(IV)代表的化合物，其中R1c是OH，R2c和R3c是OCOCH3，化合物3-2是以式(IV)代表的化合物，其中R1c，R2c和R3c是OCOCH3。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的單克隆抗體或其片段，其中單克隆抗體是由雜交瘤KTM-249產(chǎn)生的單克隆抗體KTM-249。
7.一種能夠產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1或2的單克隆抗體的雜交瘤。
8.一種能夠產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求3或4的單克隆抗體的雜交瘤。
9.一種能夠產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求5或6的單克隆抗體的雜交瘤。
10.根據(jù)權(quán)利要求7的雜交瘤，其以保藏號FERM BP-6835保藏于國立生物科學(xué)和人類技術(shù)研究所工業(yè)科學(xué)和技術(shù)機(jī)構(gòu)。
11.根據(jù)權(quán)利要求8的雜交瘤，其以保藏號FERM BP-6836保藏于國立生物科學(xué)和人類技術(shù)研究所工業(yè)科學(xué)和技術(shù)機(jī)構(gòu)。
12.根據(jù)權(quán)利要求9的雜交瘤，其以保藏號FERM BP-6837保藏于國立生物科學(xué)和人類技術(shù)研究所工業(yè)科學(xué)和技術(shù)機(jī)構(gòu)。
13.一種用于產(chǎn)生雜交瘤的方法，該雜交瘤產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1-6任一的單克隆抗體，該方法包括通過給動物施用一種從以式(I)代表的化合物 其中R1代表H或酰氧基；R2，R3和R4可以相同或者不同，每個代表H，羥基或酰氧基；以及Z1代表OCOCH2CH(CH3)2，和Z2代表H，或Z1和Z2一起代表＝O，前提是R1，R2，R3，和R4中的至少其中一種是OH，通過把其中的至少一個羥基基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)轷Ｑ趸?，并通過把一種載體物質(zhì)結(jié)合到其3-位碳原子上制備的物質(zhì)免疫動物，并通過把一種永久生長細(xì)胞與一種從免疫動物中獲得的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞相融合，以獲得雜交瘤。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中式(I)中的R2是酰氧基。
15.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中，通過把至少其中一個羥基基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)轷Ｑ趸?，通過在3-位使用一個取代基作為接頭，把載體物質(zhì)結(jié)合到從一種以式(I)代表的化合物制備的化合物的3-位碳原子上。
16.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中，將從以式(I)代表的化合物通過把至少其中一個羥基基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)橐設(shè)R所代表的基團(tuán)，其中R代表取代的或未取代的低級酰基或取代的或未取代的芳香?；苽涞幕衔锶芙庥谌軇┲?，該溶劑不是有機(jī)溶劑或不包含有機(jī)溶劑，然后結(jié)合到載體物質(zhì)上。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中不是有機(jī)溶劑或不包含有機(jī)溶劑的該溶劑是水。
18.用于測定樣品中單端孢菌毒素真菌毒素的免疫測定方法，包括使至少一種根據(jù)權(quán)利要求1-6的單克隆抗體和其片段作用于包含單端孢菌毒素真菌毒素的樣品。
19.用于測定樣品中單端孢菌毒素真菌毒素的免疫測定方法，包括把具有至少一個羥基基團(tuán)的、以式(I)所代表的化合物中的至少一個羥基基團(tuán)轉(zhuǎn)變成以O(shè)R所代表的基團(tuán)，其中R代表一個取代的或未取代的低級酰基或一個取代的或未取代的芳香?；?，并且使至少一種根據(jù)權(quán)利要求1-6的單克隆抗體和其片段作用于包含單端孢菌毒素真菌毒素的樣品。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19的免疫測定方法，其中單端孢菌毒素真菌毒素選自下組脫氧瓜萎鐮菌醇(DON)，瓜萎鐮菌醇(NIV)，T-2毒素(T-2)及其衍生物。
21.一種測定樣品中DON，NIV，T-2及其衍生物的總量的方法，該方法包括使用根據(jù)權(quán)利要求3或4的單克隆抗體或者片段、從根據(jù)權(quán)利要求18或19的免疫測定方法獲得的值或使用根據(jù)權(quán)利要求5或6的單克隆抗體或者片段、從根據(jù)權(quán)利要求18或19的免疫測定方法獲得的值計算總量。
22.一種測定樣品中NIV及其衍生物的方法，該方法包括使用根據(jù)權(quán)利要求1或2的單克隆抗體或者片段、根據(jù)權(quán)利要求18或19實(shí)施免疫測定。
23.一種測定樣品中DON，NIV及其衍生物的方法，該方法包括使用根據(jù)權(quán)利要求3或4的單克隆抗體或者片段、根據(jù)權(quán)利要求18或19實(shí)施免疫測定。
24.一種測定樣品中DON及其衍生物的方法，該方法包括使用根據(jù)權(quán)利要求3或4的單克隆抗體或者片段、從根據(jù)權(quán)利要求18或19的免疫測定獲得的值或使用根據(jù)權(quán)利要求1或2的單克隆抗體或者片段、從根據(jù)權(quán)利要求18或19的免疫測定獲得的值計算DON及其衍生物的量。
25.一種測定樣品中T-2及其衍生物的方法，該方法包括使用根據(jù)權(quán)利要求5或6的單克隆抗體或者片段、根據(jù)權(quán)利要求18或19實(shí)施免疫測定。
26.根據(jù)權(quán)利要求18或19的免疫測定方法，其中免疫測定方法選自下組放射免疫測定，酶免疫測定，熒光免疫測定和發(fā)光免疫測定。
27.根據(jù)權(quán)利要求18或19的免疫測定方法，其中免疫測定方法選自下組競爭免疫測定和夾心免疫測定。
28.一種用于測定單端孢菌毒素真菌毒素的免疫測定的試劑，包含至少一種根據(jù)權(quán)利要求1至6的單克隆抗體及其片段作為活性成分。
29.一種用于測定單端孢菌毒素真菌毒素的免疫測定的試劑盒，包含根據(jù)權(quán)利要求28的試劑和一個固定抗原的固相平板。
30.一種用于測定單端孢菌毒素真菌毒素的免疫測定的試劑盒，包含根據(jù)權(quán)利要求28的試劑和一個固定抗原的固相平板，一種與根據(jù)權(quán)利要求1至6任一的單克隆抗體及其片段起反應(yīng)的標(biāo)記的抗體或抗體片段，以及一種用于檢測所說抗體或抗體片段標(biāo)記的試劑。
31.一種用于測定單端孢菌毒素真菌毒素的免疫測定的試劑盒，包含根據(jù)權(quán)利要求28的試劑和一個固定抗原的固相平板，一種被標(biāo)記的根據(jù)權(quán)利要求1至6任一的單克隆抗體及其片段，以及一種用于檢測所說抗體或抗體片段標(biāo)記的試劑。
32.一種用于測定單端孢菌毒素真菌毒素的免疫測定的試劑盒，包含根據(jù)權(quán)利要求28的試劑和一種預(yù)處理樣品使以式(I)代表的化合物中的羥基轉(zhuǎn)變成為以O(shè)R代表的基團(tuán)的溶液，其中R具有與如上限定相同的含義。
33.一種用于測定單端孢菌毒素真菌毒素的免疫測定的試劑盒，包含根據(jù)權(quán)利要求28的試劑，一個固定抗原的固相平板，和一種預(yù)處理樣品使以式(I)代表的化合物中的羥基轉(zhuǎn)變成為以O(shè)R代表的基團(tuán)的溶液，其中R具有如以上限定相同的含義。
34.一種用于測定單端孢菌毒素真菌毒素的免疫測定的試劑盒，包含根據(jù)權(quán)利要求28的試劑，一個固定抗原的固相平板，一種與根據(jù)權(quán)利要求1至6中的任何單克隆抗體及其片段起反應(yīng)的標(biāo)記的抗體或抗體片段，一種用于檢測所說抗體或抗體片段標(biāo)記的試劑，以及一種預(yù)處理樣品使以式(I)代表的化合物中的羥基轉(zhuǎn)變成為以O(shè)R代表的基團(tuán)的溶液，其中R具有如權(quán)利要求限定的相同的含義。
35.一種用于測定單端孢菌毒素真菌毒素的免疫測定的試劑盒，包含一個固定抗原的固相平板，一種根據(jù)權(quán)利要求1至6中被標(biāo)記的任何單克隆抗體及其片段，一種用于檢測所說抗體或抗體片段標(biāo)記的試劑，以及一種預(yù)處理樣品使以式(I)代表的化合物中的羥基轉(zhuǎn)變成為以O(shè)R代表的基團(tuán)的溶液，其中R具有如權(quán)利要求限定的相同的含義。
36.一種用于測定單端孢菌毒素真菌毒素的方法，該方法包括用包含有機(jī)溶劑的溶液處理包含單端孢菌毒素真菌毒素的樣品，以從樣品中提取單端孢菌毒素真菌毒素，以及通過根據(jù)權(quán)利要求18或19的免疫測定方法測定提取的單端孢菌毒素真菌毒素。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中有機(jī)溶劑是一種水溶性的有機(jī)溶劑。
38.根據(jù)權(quán)利要求36或37的方法，其中水溶性的有機(jī)溶劑至少是選自下組的一個成員甲醇，乙醇，丙醇，乙腈，二甲基亞砜，二甲基甲酰胺。
39.一種通過免疫測定檢測樣品中產(chǎn)生單端孢菌毒素真菌毒素的微生物的方法，該方法包括向培養(yǎng)基中接種包含產(chǎn)生單端孢菌毒素真菌毒素的微生物的樣品，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)該微生物，以及使根據(jù)權(quán)利要求1至6的至少一種單克隆抗體及其片段作用于培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的單端孢菌毒素真菌毒素。
40.一種通過免疫測定鑒定樣品中產(chǎn)生單端孢菌毒素真菌毒素的微生物的方法，該方法包括向培養(yǎng)基中接種包含產(chǎn)生單端孢菌毒素真菌毒素的微生物的樣品，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)該微生物，以及使根據(jù)權(quán)利要求1至6的至少一種單克隆抗體及其片段作用于培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的單端孢菌毒素真菌毒素。
全文摘要
產(chǎn)生了對單端孢菌毒素真菌毒素DON、NIV和T－2具有高親和性的單克隆抗體,并且采用所說的單克隆抗體集中檢測了單端孢菌毒素真菌毒素。
文檔編號C12P21/08GK1365387SQ00810985
公開日2002年8月21日 申請日期2000年9月7日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月7日
發(fā)明者河野弘明, 橋本百合子, 芳澤宅實(shí) 申請人:協(xié)和梅迪克斯株式會社