時(shí)間分辨激光誘導(dǎo)熒光光譜系統(tǒng)及其用圖
【專利說明】時(shí)間分辨激光誘導(dǎo)熒光光譜系統(tǒng)及其用途 政府權(quán)利
[0001] 本發(fā)明在由國立神經(jīng)疾病和中風(fēng)研究所授予的NS060685號(hào)資助下由政府支持獲 得。政府對(duì)本發(fā)明享有某些權(quán)利。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明通常涉及通過分析來自標(biāo)記或未標(biāo)記生物分子的激光誘導(dǎo)光發(fā)射來表征 生物材料的技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0003] 本文所引用的所有參考仿佛完全闡述一般以整體方式并入。除非另外定義， 否則本文所使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所了解 的意義相同的意義。下述文獻(xiàn)為本領(lǐng)域中技術(shù)人員提供用于本申請(qǐng)的許多術(shù)語的通 用指導(dǎo)：A1 Ien 等人，〈〈Remington:The Science and Practice of Pharmacy》第 22 版·，英國醫(yī)藥出版社（Pharmaceutical Press) (2012 年 9 月 15 日）；Hornyak 等人， 《Introduction to Nanoscience and Nanotechnology》，CRC 出版社（2008) ；Singleton 和 Sainsbury,《Dictionary of Microbiology and Molecular Biology》第 3 版·，修訂 版·，約翰·威利出版社（J.Wiley&Sons)(紐約，NY 2〇〇6) ;Smith,《March' s Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure〉〉第 7 版·，約翰·威利出 版社（紐約，NY 2013) ;Singleton,《Dictionary of DNA and Genome Technology》第 3版·，威立布萊克維爾出版社（Wiley-Blackwell) (2012年11月28日）；以及Green 和 Sambrook,《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》第 4 版·，冷泉港出版社 (Cold Spring Harbor Laboratory Press)(冷泉港，紐約2012)。關(guān)于如何制備抗體的 參考，參見如下文獻(xiàn)：Greenfield,《Antibodies A Laboratory Manual》第 2版·，冷泉 港出版社（冷泉港，紐約 2013) (Cold Spring Harbor NY，2013) ; KShler 和 Milstein， ((Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion》，歐洲免疫學(xué)雜志（Eur.J. Immunol. ) 1976 年 7 月，6(7) :511-9 ;Queen 和 Selick,《Humanized immunoglobulins》，美國專利號(hào) 5,585, 089 (1996 年 12 月）；以及 Riechmann 等人，((Reshaping human antibodies for therapy)),自然（Nature) 1988 年 3 月 24 日，332(6162):323-7。
[0004] 激光誘導(dǎo)熒光光譜（LIFS)已被廣泛地應(yīng)用于復(fù)雜的生物系統(tǒng)以診斷疾病，例如 腫瘤或動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，以及分析有機(jī)物的化學(xué)或生物化學(xué)成分。LIFS的益處包括其在 活體內(nèi)獲取定性和定量的生物系統(tǒng)信息的無創(chuàng)性途徑（noninvasive approach)。LIFS的 其他優(yōu)勢(shì)包括波長可調(diào)諧性、窄帶激發(fā)、指向性和短脈沖激發(fā)。另外，LIFS能夠選擇性并有 效地激發(fā)有機(jī)物中的熒光團(tuán)并極大地提升熒光選擇性和可檢測(cè)性。
[0005] 時(shí)間分辨技術(shù)使得激光誘導(dǎo)的發(fā)射的實(shí)時(shí)演化被直接地記錄，短（納秒）和極短 (皮秒）脈沖激光的可用性以及高速電子設(shè)備的進(jìn)展使得此直接記錄過程成為可能。由于 光發(fā)射過程發(fā)生在刺激事件后非常短的時(shí)間間隔內(nèi)（例如，熒光衰減時(shí)間大約為幾納秒）， 時(shí)間分辨測(cè)量可提供關(guān)于樣本的分子種類和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的信息。例如，時(shí)間分辨技術(shù)允許 將測(cè)量數(shù)據(jù)中的"早期"過程（典型地為短期狀態(tài)的直接激發(fā)或非?？焖俚暮罄m(xù)反應(yīng)）和 "后期"過程（典型地為長期狀態(tài)，由持續(xù)電子布居或由初始電子過程后的反應(yīng)所導(dǎo)致的延 遲激發(fā)）"分離"。
[0006] 時(shí)間分辨測(cè)量僅從寬范圍的波長中獲取整體效應(yīng)，并且可由激光誘導(dǎo)發(fā)射中的光 譜信息補(bǔ)充，以揭示樣本的額外特征。為了將激光誘導(dǎo)發(fā)射分解成組分波長，同時(shí)仍然能 夠執(zhí)行時(shí)間分辨測(cè)量，一些現(xiàn)有的LIFS技術(shù)使用掃描單色儀從寬頻發(fā)射中選擇波長，每次 一個(gè)波長，并且將選擇的波長組分導(dǎo)向光電探測(cè)器。然而，當(dāng)調(diào)諧單色儀以選擇新波長的時(shí) 候，為了從發(fā)射光譜中分解另一個(gè)波長，樣本需要再次激發(fā)以產(chǎn)生另一個(gè)再發(fā)射。
[0007] 此類現(xiàn)有的技術(shù)會(huì)耗費(fèi)大量的時(shí)間以從寬帶光發(fā)射中分辨出多個(gè)光譜組分。盡管 每個(gè)波長組分都可被實(shí)時(shí)記錄，但是使用單色儀選擇另一個(gè)波長的轉(zhuǎn)換時(shí)間可花費(fèi)數(shù)秒， 這在執(zhí)行實(shí)時(shí)測(cè)量中成為限制因素。另外，如果需要測(cè)量樣本上的大量刺激位置，總體測(cè)量 會(huì)花費(fèi)大量時(shí)間。因此，需要促進(jìn)來自單次樣本激發(fā)引起的光發(fā)射的時(shí)間分辨和波長分辨 信息的接近實(shí)時(shí)記錄的系統(tǒng)和方法。 發(fā)明概述
[0008] 本發(fā)明提供了一種通過分析來自生物樣本的光發(fā)射來表征生物樣本的系統(tǒng)，其 中，生物樣本對(duì)激發(fā)信號(hào)進(jìn)行響應(yīng)而產(chǎn)生所述光發(fā)射。系統(tǒng)首先用激光脈沖輻射生物樣本 以促使生物樣本產(chǎn)生響應(yīng)光發(fā)射。系統(tǒng)隨后使用波長分割裝置將響應(yīng)光發(fā)射分割成不同中 心波長的光譜帶組。隨后向光譜帶組應(yīng)用時(shí)間延遲，使得每個(gè)光譜帶在不同時(shí)間到達(dá)光學(xué) 檢測(cè)器，從而使光學(xué)檢測(cè)器分別瞬時(shí)分辨每個(gè)光譜帶的響應(yīng)光發(fā)射。延遲的光譜帶隨后由 系統(tǒng)在光學(xué)檢測(cè)器的單個(gè)檢測(cè)窗口中捕獲。隨后處理捕獲的光譜帶。
【附圖說明】
[0009] 圖1根據(jù)本發(fā)明的不同實(shí)施方案描述了，（A)多點(diǎn)激發(fā)時(shí)間分辨激光誘導(dǎo)焚光光 譜的原理圖。BS :分光鏡；FB :光纖束；OD :光密度；LPFW :長通道濾光輪；ExF :激發(fā)光纖； CF :收集光纖；PMT :光電倍增管。（B)觸發(fā)同步。
[0010] 圖2根據(jù)本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案描述了示例性多路分配器設(shè)計(jì)的原理圖。
[0011] 圖3根據(jù)本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案描述了探測(cè)器的原理圖。
[0012] 圖4根據(jù)本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案描述了多個(gè)示例性生物分子的熒光發(fā)射。
[0013] 圖5根據(jù)本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案描述了顯示離體腦樣本中持續(xù)NADH監(jiān)測(cè)的使用 的原理圖。
[0014] 圖6根據(jù)本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案描述了這樣的數(shù)據(jù)：該數(shù)據(jù)展示了 TRLIFS裝置在 細(xì)胞暴露于魚藤酮（一種干擾NADH-依賴性ATP產(chǎn)生的化合物）中時(shí)持續(xù)監(jiān)測(cè)NADH水平 的能力。
[0015] 圖7根據(jù)本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案描述了，（A)由TRLIFS系統(tǒng)觀測(cè)到的區(qū)域；(B)來 自于（A)的樣本在用TTC處理后被覆蓋；以及（C)為每個(gè)區(qū)域（點(diǎn)）標(biāo)繪的熒光強(qiáng)度。
[0016] 圖8根據(jù)本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案描述了具有不同濃度甲氨蝶呤的瓊脂/凝膠。
[0017] 圖9根據(jù)本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案描述了，（A)在暴露于具有350nm波長的光20分 鐘之后不同濃度的MTX的熒光，以及（B)在20分鐘內(nèi)的熒光時(shí)間進(jìn)程的曲線圖，其指示由 于形成活性熒光形式而導(dǎo)致MTX的熒光增加。 發(fā)明詳述
[0018] 本文引用的所有參考文獻(xiàn)都如同充分闡述一般以引用方式整體并入。除非另外 定義，否則本文使用的技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員通 常所理解的相同的含義。下述文獻(xiàn)為本領(lǐng)域中的技術(shù)人員提供用于本申請(qǐng)中的許多術(shù)語 的通用指導(dǎo)：Alien 等人，《Remington:The Science and Practice of Pharmacy》第 22 版·，英國醫(yī)藥出版社（2012年9月 15 日）；Hornyak等人，Introduction to Nanoscience and Nanotechnology, CRC 出版社（2008) ;Singleton 和 Sainsbury,《Dictionary of Microbiology and Molecular Biology》第3版·，修訂版，約翰·威利出版社（紐約，NY 2006) ；Smith, ((Marchi s Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure》第 7版·，約翰·威利出版社（紐約，NY 2013) ;Singleton,《Dictionary of DNA and Genome Technology》第3版，威立布萊克維爾出版社（2012年11月28日）；以及 Green和 Sambrook,《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》第4版，冷泉港出版社 (冷泉港，紐約2012)。關(guān)于如何制備抗體的參考，見于下述文獻(xiàn)：Greenfield,《Antibodies A Laboratory Manual》第2版，冷泉港出版社（冷泉港，紐約2013) ;.Kdhler和Milstein, ((Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion》，歐洲免疫學(xué)雜志 1976 年7 月，6(7) :511-9 ;Queen 和 Selick,《Humanized immunoglobulins》，美國專利號(hào) 5, 585, 089(1996 年 12 月）；以及 Riechmann 等人， 《Reshaping human antibodies for therapy》，自然 1988年 3月 24 日，332(6162) :323_7。
[0019] 提供以下描述以使得本領(lǐng)域的任何技術(shù)人員能夠制造和使用本發(fā)明，并在特定申 請(qǐng)和其需求的背景下提供。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將容易明白對(duì)這些實(shí)施方案的各種修改，并 且本文定義的一般原則可以應(yīng)用于其他實(shí)施方案而不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，本 發(fā)明不局限于所示的實(shí)施方案，而是根據(jù)與權(quán)利要求一致的最寬廣的范圍。
[0020] 本發(fā)明涉及通過分析來自（標(biāo)記或未標(biāo)記的）生物分子的激光誘導(dǎo)光發(fā)射來表征 生物材料的技術(shù)。更具體地說，本發(fā)明涉及通過對(duì)來自生物材料的激光誘導(dǎo)的熒光發(fā)射執(zhí) 行時(shí)間分辨分析和波長分辨分析來表征生物材料的方法和裝置。
[0021] 本文所描述的系統(tǒng)可被用于表征多種生理狀態(tài)和疾病狀態(tài)，包括但不限于，評(píng)估 損傷后組織活力、檢測(cè)腫瘤和癌旁組織、持續(xù)監(jiān)測(cè)細(xì)胞新陳代謝、監(jiān)視血漿以便優(yōu)化藥物治 療。系統(tǒng)可根據(jù)被分析的底物/標(biāo)記而適用于不同的應(yīng)用/用途。 系統(tǒng)
[0022] 激發(fā)源為脈沖激光器100。來自脈沖激光器的輸出脈沖以適合用于激發(fā)生物樣本 101而不對(duì)樣本造成傷害的預(yù)定波長和功率電平（power level)福射在生物樣本上。脈沖 激光器由內(nèi)部或外部脈沖控制器裝置或數(shù)字延遲裝置或觸發(fā)裝置102控制，其為每個(gè)激光 脈沖輸出提供精確的時(shí)間。此精確的時(shí)間在每個(gè)脈沖中用光電二極管檢查并用模數(shù)轉(zhuǎn)換器 裝置如NI PCIe-6220更新。在一個(gè)實(shí)施方案中，脈沖激光器發(fā)射紫外（UV)光脈沖以激發(fā) 生物樣本。在另一個(gè)實(shí)施方案中，脈沖激光器發(fā)射可見光脈沖或近紅外光脈沖以激發(fā)生物 樣本。
[0023] 脈沖激光器發(fā)射的激光可被連接/聚焦進(jìn)光纖中，并通過光纖103 (圖3)或透鏡 系統(tǒng)被引導(dǎo)到生物樣本中的特定位置。激光脈沖激發(fā)促使生物樣本產(chǎn)生響應(yīng)光發(fā)射，例如 熒光發(fā)射，其典型地具有包括多個(gè)波長的寬光譜。激光誘導(dǎo)光發(fā)射隨后被一個(gè)或多個(gè)光采 集光纖或透鏡所采集。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，光采集光纖為一束多模式光纖103。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，光采集使用物鏡完成。
[0024] 隨后，光采集光纖將寬帶發(fā)射光導(dǎo)入到波長分離裝置104(圖2)中，其可包括一個(gè) 或多個(gè)波長分離階段。寬帶發(fā)射光經(jīng)歷一系列波長分離處理，使得寬帶信號(hào)能被分解成多 個(gè)窄光譜帶，其中每個(gè)窄光譜帶都具有不同的中心波長。波長分辨光譜帶被連接至相應(yīng)的 延遲裝置105,其在每個(gè)光譜帶朝光電探測(cè)器106行進(jìn)時(shí)對(duì)每個(gè)光譜帶應(yīng)用預(yù)定的時(shí)間延 遲。離開延遲裝置的時(shí)間延遲光譜帶被布置在快速響應(yīng)光電倍增管上，使得包括激光的每 個(gè)波長分辨的光譜帶的熒光衰減曲線都能夠被獨(dú)立記錄并瞬間分辨。應(yīng)用于這些光譜帶的 延遲使得每個(gè)光學(xué)信號(hào)在不同時(shí)間到達(dá)多通道光電倍增管（MCP-PMT)，這使得每個(gè)光譜帶 的衰減曲線都可與激光一起被MCP-PMT分別檢測(cè)到。在一個(gè)實(shí)施方案中，來自MCP-PMT的 輸出可用高速數(shù)字化儀107記錄并顯示。在另一個(gè)實(shí)施方案中，來自MCP-PMT的輸出可用 示波器記錄并顯示。在一個(gè)實(shí)施方案中，MCP-PMT是由門控電路控制的門控MCP-PMT，使得 MCP-PMT僅在MCP-PMT打開時(shí)的窄檢測(cè)窗口中響應(yīng)于光信號(hào)。在一個(gè)實(shí)施方案中，門控電路 和脈沖控制同