評價丙烯酰胺短期暴露的巰基尿酸加合物檢測方法及應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種評價膳食丙烯酰胺短期體內(nèi)暴露的巰基尿酸加合物同步檢測方 法及其應用，屬于食品安全領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 丙烯酰胺（Acrylamide)是一種無色無味的白色晶體小分子物質(zhì)，是一種重要的 化工原料，用于合成聚合物和凝膠劑。國際癌癥研究機構(gòu)（IARC)將丙烯酰胺列為2A類 致癌物（對人類很可能有致癌性），其具有神經(jīng)毒性、生殖毒性、基因毒性等。2002年，瑞 典國家食品管理局和斯德哥爾摩大學的研究人員共同宣稱在油炸食品和焙烤食品中發(fā) 現(xiàn)了高含量的丙稀酰胺（Swedish National Food Administration, Information about acrylamide in food, 2002, 4)。隨后的研究證明熱加工食品中丙稀酰胺的形成源自美拉德 反應（Maillard reaction)。高碳水化合物含量的食品，如薯類油炸食品、面包類焙烤食品、 漢堡類快餐食品以及餅干類休閑食品等，是人體攝入丙烯酰胺的直接來源也是主要來源。
[0003] 目前，食品中丙烯酰胺的分析主要以色譜分離以及質(zhì)譜分析技術(shù)為檢測手段，液 相色譜-質(zhì)譜（LC-MS)聯(lián)用技術(shù)應用尤其廣泛。為排除復雜食品基質(zhì)中雜質(zhì)的干擾，通 過脫脂、提取、萃取、旋蒸、重溶和過濾等前處理步驟提取食品中的丙烯酰胺（一種提取食 品中丙烯酰胺的預處理方法，CN103499478A，2014 ; -種烘烤食品中丙烯酰胺檢測樣品的 提取方法，CN103389235A，2013)。Ros6n和HellcnSs首次報道了采用同位素稀釋的LC-MS 技術(shù)檢測熱加工食品中丙烯酰胺的含量，確定了多重反應監(jiān)測（MRM)的定量模式下丙烯 酰胺的母離子、定性離子和定量離子（R〇s6n，J·，Hdieniis，K.E. Analysis of acrylamide in cooked foods by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Analyst 2002, 127:880-882)。此后，大量的研究報道在此基礎(chǔ)上優(yōu)化了基于質(zhì)譜技術(shù)的丙烯酰胺 檢測方法。隨著超高效液相色譜的廣泛應用，基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-MS/ MS)的檢測丙烯酰胺的方法也迅速被開發(fā)（同時檢測食品中的丙烯酰胺和雜環(huán)胺的方法， CN103149316A，2013)。除此之外，還有基于丙烯酰胺偶聯(lián)蛋白質(zhì)后具有抗原性的免疫學檢 測方法而開發(fā)的快速檢測試劑（一種丙烯酰胺快速檢測卡，CN202330398U，2012)和經(jīng)過對 熱加工食品的前處理，采用熒光手段對丙烯酰胺的檢測方法（一種食品中丙烯酰胺的檢測 方法，CN101303304,2008)。該兩種方法由于受抗體特異性及熒光檢測靈敏度方面的局限 性，并未得到廣泛適用。
[0004] 對于丙烯酰胺的風險評估研究，現(xiàn)有研究主要是采用外暴露的評估方式，即通過 測定各類食物中丙烯酰胺的含量進行膳食丙烯酰胺的攝入水平調(diào)查，但這種評估方式不能 準確反映丙烯酰胺進入人體內(nèi)的真正暴露水平。為能準確評估膳食丙烯酰胺對人體的暴露 風險，須采用體內(nèi)暴露的評估方式，即通過丙烯酰胺體內(nèi)代謝生物標志物的測定對丙烯酰 胺進行風險評估。與膳食丙烯酰胺外暴露相比，基于生物標志物的內(nèi)暴露水平研究可以更 準確地評估丙烯酰胺的日常攝入量并為流行病學的研究提供更可靠的依據(jù)。
[0005] 目前基于毒代動力學水平的丙烯酰胺體內(nèi)代謝已經(jīng)在動物和人群實驗中有一定 的研究。丙烯酰胺進入體內(nèi)，在細胞色素 P4502E1酶的作用下，一部分迅速轉(zhuǎn)化成環(huán)氧活性 的物質(zhì)環(huán)氧丙酰胺。環(huán)氧丙酰胺在環(huán)氧化物水解酶的作用下，一部分轉(zhuǎn)化成無毒的2, 3-二 羥基丙酰胺。同時，丙烯酰胺和環(huán)氧丙酰胺在體內(nèi)都能夠與谷胱甘肽（GSH)、血紅蛋白以及 DNA進行結(jié)合，形成相應的加合物，如圖1所示。丙烯酰胺和環(huán)氧丙酰胺與GSH結(jié)合進而 轉(zhuǎn)化成巰基尿酸加合物，包括N-乙酰-S-(2-氨基甲酰乙基）-L-半胱氨酸（AAMA)、N-乙 酰-S_(2-氨基甲酰乙基）-L-半胱氨酰亞砜（AAMA亞砜）、N(R，S)_乙酰-S-(2-氨基甲 酰-2-羥乙基）-L-半胱氨酸（GAMA)以及N-乙酰-S-(l-氨基甲酰-2-羥乙基）-L-半胱氨 酸（異GAMA)，并通過尿液排出體外。另外，丙烯酰胺和環(huán)氧丙酰胺都可以與血紅蛋白形成 共價化合物，即丙烯酰胺-Hb和環(huán)氧丙酰胺-Hb加合物。這兩種加合物被認為是評估丙烯 酰胺體內(nèi)暴露劑量的兩個重要的生物標志物。環(huán)氧丙酰胺和丙烯酰胺還能與DNA進行結(jié)合 形成DNA加合物，但是環(huán)氧丙酰胺與DNA的結(jié)合率遠高于丙烯酰胺與DNA發(fā)生結(jié)合作用的 效率。目前已經(jīng)有四種環(huán)氧丙酰胺DNA加合物被確認，即Nl- (2-羧基-2-羥乙基）-2'-脫 氧腺苷（Nl-GA-dA)、N3- (2-氨基甲酰-2-羥乙基）-腺嘌呤（N3-GA-Ade)、N7- (2-氨基 甲酰-2-羥乙基）-鳥嘌呤（N7-GA-Gua)以及N6-(2-羧基-2-羥乙基）-2'-脫氧腺苷 (N6-GA-dA)〇
[0006] 膳食丙烯酰胺體內(nèi)短期暴露水平通過丙烯酰胺和環(huán)氧丙酰胺的巰基尿酸加合 物含量水平反映。對于丙烯酰胺巰基尿酸加合物的檢測方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián) 用法（GC-MS) ( V5丨kc-丨，W·，A·，Dekant，W. Gas chromatography-negative ion chemical ionization mass spectrometry as a powerful tool for the detection of mercapturic acids and DNA and protein adducts as biomarkers of exposure to halogenated olefins. Journal of Chromatography A 1999,847:35-46)、 高效 液相色譜-紫外檢測法（HPLC-UV) (Perbellini，L·，Maestri, L·，Veronese, N.，et al. Analysis of urinary N-acetyl-S-(N-methylcarbamoyl)cysteine, the mercapturic acid derived from N,N-dimethylformamide. Journal of Chromatography B 2001，759:349-354)、高效液相色譜-熒光檢測法（冊1^：40))(]\&168廿丨，1^，611丨《〇4,5· ,Imbriani, M. Determination of urinary mercapturic acids of styrene in man by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection. Journal of Chromatography B 1996,687:387-394)等。由于丙稀酰胺的疏基尿酸加合物在尿液中的含 量在數(shù)ng到數(shù)百ng之間，LC-MS/MS具有高度的靈敏性以及特異性，被認為是首選的定量方 法，預期能夠?qū)崿F(xiàn)對尿液中低含量丙烯酰胺巰基尿酸加合物的定量研究，然而目前LC-MS/ MS法在丙烯酰胺巰基尿酸加合物的定量分析方面卻鮮有報道。
[0007] 目前現(xiàn)有的LC-MS/MS法為：采用LC-MS/MS法同時測定AAM和GAM兩種 加合物，并采用D 3-AAM和D3-GAM作為各自的同位素內(nèi)標（Bjellaas，T.，Stolen, L. Η. , Haugen,Μ.,et al. Urinary acrylamide metabolites as biomarkers for short-term dietary exposure to acrylamide.Food and Chemical Toxicology 2007, 45:1020-1026)。由于測定方法的自身條件的限制，因此該方法不能同時測定另兩種 加合物：異GAMA和AAMA亞砜。
[0008] 尿液中四種巰基尿酸加合物（AAMA、GAMA、異GAMA和AAMA亞砜）為主要生物標志 物。目前的定量分析方法并未實現(xiàn)對四種巰基尿酸加合物進行同步定量分析。同時，上述 提到的HPLC等方法分析的時間較長，且檢測靈敏度十分有限，不利于對大批量生物樣本的 檢測和低含量樣本的檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種評價膳食丙烯酰胺短期體內(nèi)暴露的巰基尿 酸加合物同步檢測方法。
[0010] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種評價丙烯酰胺短期暴露的巰基尿酸加合 物檢測方法，包括以下步驟：
[0011] 1)、對待測尿液進行前處理；
[0012] 2)、將經(jīng)前處理后的尿液進行色譜檢測；
[0013] 色譜條件以及質(zhì)譜條件如下：
[0014] (一）色譜條件：
[0015] 流速：0· 2mL/min ;柱溫：40°C ;
[0016] 梯度洗脫程序如下：
[0019] A為0~1% (體積％ )甲酸水，B為乙腈，其體積配比為90:10~98:2 ;
[0020] 所述色譜柱種類及規(guī)格為 ACQUTITY UPLC? BEH AMIDE (2. IXlOOmm i.d.，1.7ym)、ACQUTITY UPLC? BEH Shield RP(2.1X150mm i.d.，1.7ym)或 ACQUTITY UPLC# HSS T3 (2. I X 150mm i. d.，I. 8 μ m);
[0021] 所述進樣體積為I~10 μ L ;
[0022] 備注說明：上述梯度洗脫程序最佳如表3所述；
[0023] (二）質(zhì)譜條件：
[0024] 儀器：三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀；質(zhì)譜定量方法：多重反應監(jiān)測（MRM);離子源：電 噴霧（ESI)負離子掃描方式；鞘氣溫