一種人肌鈣蛋白i的超敏定量測定試劑盒及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域，尤其是涉及一種測定人肌f丐蛋白I (Troponin I)含量 的試劑盒及其測試方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 人肌鈣蛋白由肌鈣蛋白I、T、C三亞基構(gòu)成，和原肌球蛋白一起通過調(diào)節(jié)鈣離子對 橫紋肌動蛋白ATP酶的活性來調(diào)節(jié)肌動蛋白和肌球蛋白相互作用。肌鈣蛋白I(TnI)是橫 紋肌的一種關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白。盡管所有橫紋肌TnI的功能都相同，但心肌TnKcTnI，分子質(zhì)量 23. 9kD)與骨骼肌TnI明顯不同。
[0003] 由于組織特異性高，心肌肌鈣蛋白I(CTnI)是心肌損傷的高敏感性標(biāo)志物。CTnI 還可用于鑒別骨骼肌損傷（如橫紋肌溶解、多發(fā)性損傷和非心臟手術(shù)）和心肌損傷。cTnl 已經(jīng)明確是急性冠狀動脈綜合征（ACS)患者的預(yù)后標(biāo)志物，可以預(yù)測近期、中期甚至長期 預(yù)后。
[0004] CTnI和CTnT已確定是預(yù)測ACS后果的最佳獨(dú)立標(biāo)志物。歐洲心臟病協(xié)會（ESC) 和美國心臟病學(xué)會（ACC)聯(lián)合對心肌梗死（MI)進(jìn)行了重新定義。根據(jù)此定義，在臨床急性 缺血的情況下，當(dāng)血中cTnl水平高于參考范圍（健康人群）99百分位值時，即可診斷為MI。 同時要求肌鈣蛋白檢測方法的不精密度（變異系數(shù)X 10%。根據(jù)以上規(guī)定，如果一種檢 測方法在CV小于10%的前提下，可以測量到99%分位或更低的數(shù)值，我們就可以稱之為超 敏肌鈣蛋白。應(yīng)用第99百分位數(shù)參考上限時，其臨界值為0. 02ng/ml，而在CV < 10%時， 最低測量值至少應(yīng)不大于〇. 〇15ng/ml。
[0005] 根據(jù)MI的重新定義，已經(jīng)發(fā)表了許多關(guān)于心肌肌鈣蛋白檢測在ACS患者中的作用 的建議。在UAP和非ST段抬高型心肌梗死（NSTEMI)患者中，檢測到的心肌肌鈣蛋白水平與 高死亡率有關(guān)。因此，肌鈣蛋白的檢測對這些患者的危險分級非常有用，也是ACC/AHA (美 國心臟病學(xué)會）對UAP和NSTEMI患者處理導(dǎo)則的一部分。cTn具有相當(dāng)長的診斷窗口期 (cTnl 7至9天，CTnT更長），因此很快檢測出結(jié)果很重要。從檢測角度上來說，目前臨床 上用于測定cTnl的方法主要有放免法、膠體金免疫層析法、ELISA法、化學(xué)發(fā)光法等?；瘜W(xué) 發(fā)光法檢測時間短、靈敏度高、準(zhǔn)確性高。
[0006] 磁微粒酶促化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)是一種以磁性微粒為固相分離載體，將免疫磁微粒 分離技術(shù)與酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)相結(jié)合而建立的一種新型免疫檢測方法。傳統(tǒng)ELISA方法， 抗原、抗體的結(jié)合反應(yīng)是在固相（ELISA板反應(yīng)孔）表面進(jìn)行的。磁微粒分離酶聯(lián)免疫檢測 方法，抗原、抗體的結(jié)合反應(yīng)在近似液相的條件下進(jìn)行，因而反應(yīng)快速、徹底。與傳統(tǒng)ELISA 相比具有靈敏度高，檢測用時少等優(yōu)點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 因此，根據(jù)本申請的一方面，提供一種肌鈣蛋白I的檢測試劑盒，其包含：表面上 結(jié)合有第一抗cTnl單克隆抗體的磁微粒；表面上結(jié)合有第二抗cTnl單克隆抗體的磁微粒； 酶標(biāo)記的第三抗cTnl單克隆抗體；和/或酶標(biāo)記的第四抗cTnl單克隆抗體，其中所述第 一、第二、第三和第四單克隆抗體分別特異于人肌鈣蛋白I的不同表位。
[0008] 在具體的實(shí)施方式中，第一和第二抗cTnl單克隆抗體共價結(jié)合至磁微粒的表面。 在具體的實(shí)施方式中，第一和第二抗cTnl單克隆抗體可以結(jié)合到同一磁微粒上，也可以分 別結(jié)合至不同的磁微粒上。在具體的實(shí)施方式中，第一和第二抗cTnl單克隆抗體各自獨(dú)立 地包被到磁微粒上。
[0009] 在一些具體的實(shí)施方式中，采用堿性磷酸酶或者辣根過氧化物酶來標(biāo)記抗CTnI 單克隆抗體；優(yōu)選采用堿性磷酸酶標(biāo)記第三和第四抗cTnl單克隆抗體。
[0010] 在一些具體的實(shí)施方式中，本申請的試劑盒還包含堿性磷酸酶的底物、或者辣根 過氧化物酶的底物。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何適當(dāng)?shù)孜锒际窃试S的；作為非限制性的實(shí) 例，例如但不限于二氧雜環(huán)乙燒、二氧雜環(huán)乙烷類似物、魯米諾、魯米諾衍生物。
[0011] 在一些實(shí)施方式中，本申請的試劑盒還包含洗滌液，所述洗滌液包含TriS-HCl緩 沖液和吐溫80。優(yōu)選地，洗滌液含有吐溫80、NaCl、Proclin-300和Tris-HCl緩沖液。在 一些具體的實(shí)施方式中，所述吐溫80的濃度為0. 5g/L至2g/L。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，吐溫 80的濃度為0· 8g/L至lg/L。
[0012] 在一些實(shí)施方式中，第一抗cTnl單克隆抗體在試劑中的濃度是3.2 μ g/ml ;第二 抗cTnl單克隆抗體在試劑中的濃度是3. 2 μ g/ml。
[0013] 在一些實(shí)施方式中，第三抗cTnl單克隆抗體在試劑中的濃度是I. 6 μ g/ml ;第四 抗cTnl單克隆抗體在試劑中的濃度是1. 6 μ g/ml。
[0014] 在一些實(shí)施方式中，磁顆粒的粒徑是0. 5至3. 5 μπι ;優(yōu)選1至3 μπι。
[0015] 在一些實(shí)施方式中，第一和第二抗cTnl單克隆抗體位于相同的容器中。第三和第 四抗cTnl單克隆抗體位于相同的容器中。第一和第二抗cTnl單克隆抗體與第三和第四抗 cTnl單克隆抗體位于不同的容器中。
[0016] 在具體的實(shí)施方式中，本申請的試劑盒包含或者由如下組成：(a)磁分離試劑、 (b)酶標(biāo)記試劑和（c)底物；其中磁分離試劑包含表面上結(jié)合有第一抗cTnl單克隆抗體的 磁微粒和表面上結(jié)合有第二抗cTnl單克隆抗體的磁微粒；所述酶標(biāo)記試劑包含酶標(biāo)記的 第三抗cTnl單克隆抗體和酶標(biāo)記的第四抗cTnl單克隆抗體；所述底物包含魯米諾或其衍 生物。
[0017] 另一方面，本申請?zhí)峁┮环N改善肌鈣蛋白I的檢測靈敏度的方法，其包括如下步 驟：(a)將表面上結(jié)合有第一抗cTnl單克隆抗體的磁微粒和表面上結(jié)合有第二抗cTnl單 克隆抗體的磁微粒混合；以及（b)將酶標(biāo)記的第三抗cTnl單克隆抗體和酶標(biāo)記的第四抗 cTnl單克隆抗體混合；以及任選地（c)將上述步驟所得的混合物和待測樣本接觸；其中所 述第一、第二、第三和第四單克隆抗體分別特異于人肌鈣蛋白I的不同表位；步驟（a)和步 驟（b)順序是可互換的。
[0018] 在具體的實(shí)施方式中，表面上結(jié)合有第一抗cTnl單克隆抗體的磁微粒和表面上 結(jié)合有第二抗cTnl單克隆抗體的磁微粒，按照質(zhì)量比1:1進(jìn)行混合。結(jié)合有第三抗cTnl單 克隆抗體的磁微粒和所述表面上結(jié)合有第四抗cTnl單克隆抗體的磁微粒，按照質(zhì)量比1:1 進(jìn)行混合。
[0019] 又一方面，本申請?zhí)峁┮环N制備本申請所述檢測試劑盒的方法，其包括如下步驟： 將表面上結(jié)合有第一抗人肌鈣蛋白I單克隆抗體的磁微粒和表面上結(jié)合有第二抗人肌鈣 蛋白I單克隆抗體的磁微粒混合；以及將酶標(biāo)記的第三抗人肌鈣蛋白I單克隆抗體和酶標(biāo) 記的第四抗人肌鈣蛋白I單克隆抗體混合，其中所述第一、第二、第三和第四單克隆抗體分 別特異于人肌鈣蛋白I的不同表位。在具體的實(shí)施方式中，表面上結(jié)合有第一抗CTnI單克 隆抗體的磁微粒和表面上結(jié)合有第二抗cTnl單克隆抗體的磁微粒，按照質(zhì)量比1:1進(jìn)行混 合。結(jié)合有第三抗cTnl單克隆抗體的磁微粒和所述表面上結(jié)合有第四抗cTnl單克隆抗體 的磁微粒，按照質(zhì)量比1:1進(jìn)行混合。
【附圖說明】
[0020] 圖1 :本申請試劑盒和對比試劑的相關(guān)性（橫縱坐標(biāo)的單位為ng/ml，橫坐標(biāo)為對 比試劑的測值，縱坐標(biāo)為本申請試劑盒測值）。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 實(shí)施例
[0022] 實(shí)施例1.磁分離試劑的制備過程
[0023] 一、試劑的配制操作步驟：
[0024] 1、結(jié)合緩沖液：
[0025] 稱取2L 32g MES加約800ml純水使之溶解，過后用NaOH調(diào)pH至5. 0,定容至1L。
[0026] 2、清洗液：
[0027] 稱取Tris 3. 025g、NaCl 9g加約800ml純水使之溶解，過后用HCl調(diào)pH至L 2后， 加入0· 5g Tween-20混勾后，定容至IL0
[0028] 3、交聯(lián)試劑：
[0029] 含10mg/ml EDC的冰冷結(jié)合緩沖液，臨用現(xiàn)配。
[0030] 4、封閉液：
[0031] Biolipidure-203 或 _206〇
[0032] 5、儲存液：
[0033] 稱取Tris (λ 605g、NaCl 0· 9g加約80ml純水使之溶解，過后用HCl調(diào)pH至7. 2 后，加入 〇· Ig BSA、0.1 g Tween-20 混勾后，定容至 100mL0
[0034] 二、磁分離試劑的制備過程
[0035] 1、將磁顆粒EMl-100140(Merck，粒徑0. 93 μπι，也允許使用其它市售等同磁顆粒， 如Thermo的產(chǎn)品）重懸后取Iml于15ml離心管中。
[0036] 2、置于磁力架上磁分離Imin后小心移走上清。
[0037] 3、加入IOml結(jié)合緩沖液充分重懸磁顆粒后，置于磁力架上磁分離Imin后小心移 走上清，此步重復(fù)二次。
[0038] 4、加入IOml結(jié)合緩沖液充分重懸磁顆粒后，加入1ml交聯(lián)試劑混勻，室溫避光混 勾反應(yīng)30min。
[0039] 5、置于磁力架上磁分離Imin后小心移走上清。
[0040] 6、加入IOml結(jié)合緩沖液清洗一次，置于磁力架上磁分離Imin后小心移走上清，加 入IOml結(jié)合緩沖液后加入I. 5mg第一抗cTnl單克隆抗體（購自Hytest，貨號916)混勾， 室溫避光混勻反應(yīng)3h。
[0041] 7、加入IOml清洗液清洗磁顆粒3次，最后一次移走上清后加入5ml封閉液混勻， 室溫避光混勻反應(yīng)過夜。
[0042] 8、加入IOml清洗液清洗三次。
[0043] 9、加入IOml儲存液混勻后4°C儲存。
[0044] 第二抗cTnl單克隆抗體（購自Hytest，貨號3C7)按照上述步驟1至9進(jìn)行同樣 包被。
[0045] 實(shí)施例2.酶標(biāo)記抗體制備過程
[0046] 一、試劑的配置步驟：
[0047] U0.1 M PBS pH 7. 4 ：
[0048] 稱取 ΚΗ2Ρ042· 4g、Na2HP0414. 4g、NaCl 8g、KCl 0· 2g 加 800ml 純水溶解后，