重組人胰島素或其類似物的主要脫氨產(chǎn)物位點的鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及胰島素或其類似物的有關(guān)物質(zhì)的檢測方法，尤其涉及重組人胰島素或 其類似物的主要脫氨產(chǎn)物位點的鑒定方法，屬于胰島素類產(chǎn)品脫氨產(chǎn)物的定性與定量分析 領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿病是已成為嚴(yán)重危害人類健康和生命的一大疾病。隨著人們生活方式的改變 和老齡化進程的加快，糖尿病的患病率逐年上升，尤其是各種急慢性并發(fā)癥的發(fā)生，給患者 個人、家庭及社會帶來沉重負擔(dān)。糖尿病治療最重要的目的是控制血糖水平，1型糖尿病患 者及部分2型糖尿病患者需要使用胰島素來降低血糖。近年來隨著重組DNA技術(shù)的出現(xiàn)， 人們開發(fā)出了具有不同作用時間的重組人胰島素及其類似物，并實現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化，給糖尿病 患者帶來了福音，極大減輕了糖尿病患者的痛苦。
[0003] 重組人胰島素是一種利用重組DNA技術(shù)，經(jīng)重組大腸桿菌或者重組酵母菌發(fā)酵和 純化制備得到的蛋白質(zhì)，廣泛用于2型和1型糖尿病的臨床治療。重組人胰島素由A和B 兩條鏈組成，A鏈含有21個氨基酸，B鏈含有30個氨基酸。兩條鏈之間由兩對二硫鍵相連 (A7-B7和A20-B19)，在A鏈內(nèi)部還有一對二硫鍵（A6-A11)，其一級結(jié)構(gòu)見圖1。
[0004] 二硫鍵的存在對穩(wěn)定胰島素結(jié)構(gòu)及生理活性具有重要作用。隨著人們對胰島素結(jié) 構(gòu)與功能的深入研究以及基因工程技術(shù)和蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用，通過改變或者修飾重組人胰 島素的部分氨基酸序列，可以賦予胰島素新的聚合特性，使其具備速效或長效胰島素的生 理特征，以滿足人們不同類型的胰島素需求。
[0005] 目前市面上的速效重組人胰島素類似物有賴脯胰島素、賴谷胰島素和門冬胰島 素。賴脯胰島素是由人胰島素 B鏈第28位脯氨酸與B鏈第29位賴氨酸相互交換而形成的 一種速效胰島素類似物，能顯著改善2型糖尿病患者的胰島β和α細胞功能，促進胰島素 分泌；賴谷胰島素是賴氨酸替代人胰島素 B鏈第3位天冬酰胺，谷氨酸替代B鏈第29位賴氨 酸而形成的新型速效人胰島素類似物，局部吸收更快。門冬胰島素是人胰島素 B鏈28位脯 氨酸被天門冬氨酸所取代而得到的胰島素類似物，其吸收速率更快，有利于穩(wěn)定餐后血糖。
[0006] 長效重組人胰島素類似物有甘精胰島素和地特胰島素。甘精胰島素在人胰島素 B 鏈C末端增加了 2個精氨酸殘基，A鏈C末端的最后一個天冬氨酸被甘氨酸取代，使其六聚 體結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，通過在注射部位緩慢降解成單體吸收，從而具備了長效胰島素的特性；地特 胰島素是由原型胰島素去除了 B鏈第30位蘇基酸，通過?；饔迷讦?9位賴氨酸側(cè)鏈氨基 連接了一個十四烷基脂肪酸側(cè)鏈而成，其被人體吸收緩慢，作用持續(xù)時間延長，其結(jié)構(gòu)式見 圖2。這些速效和長效重組人胰島素類似物在結(jié)構(gòu)上與重組人胰島素差異較小，但具有較好 的降血糖效果，因此受到廣大糖尿病患者的青睞。
[0007] 組成蛋白質(zhì)或多肽的氨基酸中若含有天冬酰胺（Asn)和谷氨酰胺（Gln)殘基，該 蛋白質(zhì)的這兩種氨基酸的側(cè)鏈氨基就有可能發(fā)生脫氨基現(xiàn)象，生成對應(yīng)的天冬氨酸（Asp) 或谷氨酸（Glu)殘基，最終得到與原蛋白結(jié)構(gòu)類似的副產(chǎn)物，這種脫氨基反應(yīng)在酸性溶液 環(huán)境中更為明顯。這些副產(chǎn)物的理化性質(zhì)與原蛋白十分接近，功能與原蛋白相近，但免疫原 性可能存在一定的差異，所以脫氨產(chǎn)物一般作為有關(guān)物質(zhì)（雜質(zhì)）在目的蛋白中的含量有 著嚴(yán)格的限制。重組人胰島素 A鏈含有2個Asn (A18和A21)和2個Gln (A5和A15)，B鏈 中含有1個Asn (B3)和Gln (B4)，而且重組人胰島素制備工藝中經(jīng)常使用到酸性溶液，所以 最終的重組人胰島素產(chǎn)品中會含有一定比例的脫氨產(chǎn)物，含量一般不超過1. 5%。由于重組 人胰島素類似物氨基酸組成與人胰島素的氨基酸基本一致，所以胰島素類似物在生產(chǎn)過程 中這兩種氨基酸殘基也很容易脫掉氨基生成相應(yīng)的雜質(zhì)，進而影響胰島素類似物的純度和 安全性。開發(fā)胰島素類產(chǎn)品脫氨產(chǎn)物的定性與定量分析方法對于保證產(chǎn)品質(zhì)量至關(guān)重要， 不但可以更好保證產(chǎn)品的質(zhì)量安全性，也可以作為生產(chǎn)過程中質(zhì)量控制和工藝優(yōu)化的重要 依據(jù)。特別是對胰島素類似物而言，目前多國藥典中都未收載這類產(chǎn)品，沒有對該藥品質(zhì)量 控制的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和分析方法。目前有文獻報道的鑒定方法是將脫氨產(chǎn)物采用高效液相色譜 的方法將其分離、脫鹽和濃縮制備，然后再進行液質(zhì)分析，操作十分復(fù)雜，特別是采用高效 液相分離目的蛋白和脫氨產(chǎn)物難度較大，很難得到單一產(chǎn)物。因此，建立一種快速簡單的鑒 定脫氨基產(chǎn)物位點的分析方法對藥物研發(fā)人員及質(zhì)控人員來說顯得非常重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種快速、準(zhǔn)確的鑒定重組人胰島素或其類似 物的主要脫氨產(chǎn)物位點的方法
[0009] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
[0010] -種重組人胰島素或其類似物的主要脫氨產(chǎn)物位點的鑒定方法，所述方法包括如 下步驟：
[0011] (1)將待檢測的重組人胰島素或其類似物樣品溶液用蛋白酶進行酶解再用還原劑 還原獲得小的肽段；用高效液相色譜法將小的肽段進行分離，得到分離的多個小肽段；將 分離的各個小肽段進入質(zhì)譜儀在電噴霧正離子模式下進行一級全掃，得到未經(jīng)脫氨基處理 的重組人胰島素或其類似物樣品的總離子流圖；
[0012] (2)將待檢測的重組人胰島素或其類似物進行脫氨基處理后用蛋白酶進行酶解， 再用還原劑還原獲得小的肽段；用高效液相色譜法將小的肽段進行分離，得到分離的多個 小肽段；將分離的各個小肽段進入質(zhì)譜儀在電噴霧正離子模式下進行一級全掃，得到脫氨 基處理的重組人胰島素或其類似物樣品的總離子流圖；
[0013] (3)將未經(jīng)脫氨基處理的重組人胰島素或其類似物樣品的總離子流圖和經(jīng)過脫氨 基處理的重組人胰島素或其類似物樣品的總離子流圖進行分析比較，找出出現(xiàn)在經(jīng)過脫氨 基處理的重組人胰島素或其類似物樣品的總離子流圖中但沒有出現(xiàn)在未經(jīng)過脫氨基處理 的重組人胰島素或其類似物樣品的總離子流圖的肽段并確定該肽段離子峰的質(zhì)荷比；
[0014] (4)提取該肽段的母離子峰進行MS/MS二級碎片分析，獲取二級MS圖譜和系列碎 片圖譜，將該肽段的系列碎片離子與其理論碎片離子進行匹配對比，精確定位該肽段是檢 測樣品中哪個位點的脫氨產(chǎn)物，該位點即為檢測樣品的主要脫氨產(chǎn)物位點。
[0015] 所述的脫氨基處理包括將待檢測的重組人胰島素或其類似物樣品溶液用 稀酸制成酸性溶液后再進行加熱處理；所述稀酸可以為鹽酸或醋酸，其濃度優(yōu)選為 0· 01-0. 05mol/L，更優(yōu)選為0· 02mol/L ;所述的加熱處理優(yōu)選采用水浴加熱，其中，水浴加 熱的溫度優(yōu)選為40-60°C，更優(yōu)選為60°C ;所述的加熱時間優(yōu)選為3-6h，更優(yōu)選為4h。
[0016] 優(yōu)選的，將待檢測的重組人胰島素或其類似物樣品溶液用稀酸制成酸性溶液的方 法包括：
[0017] 將重組人胰島素原料藥、賴脯胰島素原料藥、門冬胰島素原料藥、賴谷胰島素原料 藥或地特胰島素原料藥直接用稀酸溶液溶解成3-6mg/ml的溶液（優(yōu)選為5mg/ml);或者將 重組人胰島素注射液、賴脯胰島素注射液、門冬胰島素注射液、賴谷胰島素注射液或地特胰 島素注射液采用Millipore 3KD的超濾管超濾換相濃縮至稀酸溶液中，使樣品的終濃度為 3_6mg/ml (優(yōu)選為 5mg/ml)。
[0018] 步驟（1)或步驟（2)中所述的蛋白酶優(yōu)選為Glu-C蛋白內(nèi)切酶；所述蛋白酶與樣 品的用量之比為1:3~1:8,優(yōu)選為1:5 ;所述酶切時間優(yōu)選為4-8h，更優(yōu)選為6h ;所述酶切 反應(yīng)溫度優(yōu)選為30-40°C，更優(yōu)選為37°C。
[0019] 步驟（1)或步驟（2)中進行酶解時所用到的酶解緩沖液優(yōu)選為Tris-HCl緩沖液 或者HEPES緩沖液；所述Tris-HCl緩沖液的終濃度為15-30mmol/L，優(yōu)選為20mmol/L ;所述 HEPES緩沖液的終濃度為30-70mmol/L，優(yōu)選為50mmol/L ;所述緩沖液的pH值為7. 0-8. 0， 優(yōu)選為7. 5。
[0020] 步驟（1)或步驟（2)中所述的還原劑優(yōu)選為二硫蘇糖醇（DTT)或β -巰基乙醇；所 述還原劑終濃度為5-15mmol/L，優(yōu)選為lOmmol/L ;所述還原溫度為25-35°C，優(yōu)選為30°C ; 所述還原時間為20_40min，優(yōu)選為30min。
[0021] 步驟（1)或步驟（2)中在正離子模式下進行電離之前先將樣品經(jīng)受甲酸酸化。
[0022] 步驟（1)中用高效液相色譜進行分離的參數(shù)優(yōu)選為：流動相A為0. 1 %甲酸溶液， 流動相8為100%乙腈溶液，色譜柱為(：18反相柱（2.111111^100111111，1.7 4111)，流速為0.31111/ min，柱溫為 40°C;洗脫梯度：0 ~25min，2 ~20%B ;25 ~31min，20 ~26%B ;31 ~45min， 26 ~100% B ;45 ~50min，100% B。
[0023] 步驟⑴中用質(zhì)譜儀進行一級掃描的參數(shù)優(yōu)選是：m/z掃描范圍為70-1500,分析 時長4