長效單鏈胰島素類似物的制作方法
【專利說明】長效單鏈胰島素類似物
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考 本申請(qǐng)要求2012年11月5日提交的未決美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/722, 350的權(quán)益。
[0002] 關(guān)于聯(lián)邦資助的研究或開發(fā)的聲明 本發(fā)明是由 National Institutes of Health 在經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目編號(hào) DK040949 和 DK074176 下在合作協(xié)議下政府支持完成。美國政府對(duì)本發(fā)明可能享有某些權(quán)利。
[0003] 發(fā)明背景 本發(fā)明涉及多肽激素類似物，其表現(xiàn)出增強(qiáng)的藥理學(xué)性質(zhì)，如提高的熱力學(xué)穩(wěn)定性、增 強(qiáng)的對(duì)高于室溫的熱纖維化的抗性、降低的絲裂原活性和/或改變的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效動(dòng) 力學(xué)性質(zhì)，即相對(duì)于相應(yīng)野生型人激素的可溶性制劑提供更長的作用持續(xù)時(shí)間或更快速的 作用持續(xù)時(shí)間。更特別地，本發(fā)明涉及由單一多肽鏈組成的胰島素類似物，所述單一多肽鏈 在A和B結(jié)構(gòu)域之間含有新的一類縮短的連接（C)結(jié)構(gòu)域。這種類別的C結(jié)構(gòu)域具有6-11 個(gè)殘基的長度，由N-末端酸性元素和衍生自人IGF-II的連接結(jié)構(gòu)域的C-末端片段組成。 本發(fā)明的單鏈胰島素類似物在A或B結(jié)構(gòu)域中的其它位點(diǎn)處可以任選含有標(biāo)準(zhǔn)或非標(biāo)準(zhǔn)的 氨基酸置換。
[0004] 非標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（包括治療劑和疫苗）的工程改造可以具有廣泛的醫(yī)療和社會(huì)益處。 天然存在的蛋白質(zhì)一一如通常在人類、其它哺乳動(dòng)物、脊椎生物、無脊椎生物或真核細(xì)胞的 基因組中編碼的那樣一一常常賦予多種生物活性。衍生蛋白質(zhì)的益處在于獲得選擇性活 性，如降低的與不期望和不利的副作用（如促進(jìn)癌細(xì)胞生長）相關(guān)的同源細(xì)胞受體的結(jié)合。 社會(huì)益處的另一實(shí)例是對(duì)室溫下或高于室溫的降解的抗性提高，有利于運(yùn)輸、分布和使用。 胰島素提供了治療性蛋白質(zhì)的一個(gè)實(shí)例。不管通過RNA剪接的替代方式或通過翻譯后糖基 化的替代模式生成的受體同種型，結(jié)合到胰島素受體的野生型人胰島素和在其它哺乳動(dòng)物 基因組中編碼的胰島素分子是多器官和多種類型的細(xì)胞。野生型胰島素還以低親和力與同 源1型胰島素樣生長因子受體（IGF-IR)結(jié)合。
[0005] 進(jìn)一步的醫(yī)藥益處的實(shí)例是優(yōu)化蛋白質(zhì)對(duì)伸展或降解的穩(wěn)定性。此類社會(huì)益處將 通過針對(duì)室溫或高于室溫下的降解比標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)更難熔的蛋白質(zhì)工程改造來增強(qiáng)，以用于 電力與制冷不能始終可用的發(fā)展中世界的地區(qū)。由單一多肽鏈組成并任選含有非標(biāo)準(zhǔn)氨基 酸置換的胰島素類似物可以表現(xiàn)出在抗熱降解或降低的絲裂原活性方面優(yōu)異的性質(zhì)。糖尿 病在非洲和亞洲的未決流行加深了其物理降解造成的挑戰(zhàn)。因?yàn)槔w維化造成了高于室溫的 降解的主要途徑，設(shè)計(jì)抗纖維化的制劑可以在此類受挑戰(zhàn)區(qū)域提高胰島素替代療法的安全 性和效率。
[0006] 施用胰島素早已被確定為糖尿病的治療方法。在患有糖尿病的患者中常規(guī)胰島素 替代療法的主要目的是嚴(yán)格控制血葡萄糖濃度以防止其偏離高于或低于健康人的正常范 圍特征。偏離低于正常范圍與即時(shí)腎上腺素或神經(jīng)低血糖癥狀相關(guān)，這在嚴(yán)重發(fā)作時(shí)會(huì)導(dǎo) 致痙攣、昏迷和死亡。偏離高于正常范圍與微血管病變(包括視網(wǎng)膜病、失明和腎衰竭相關(guān)） 的長期風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)。
[0007] 胰島素是在脊椎動(dòng)物的代謝中起到重要作用的小球狀蛋白質(zhì)。胰島素含有兩條 鏈，含有21個(gè)殘基的A鏈和含有30個(gè)殘基的B鏈。該激素以Zn2+-穩(wěn)定化六聚物形式存儲(chǔ) 在膜島β細(xì)胞中，但是以無 Zn2+單體形式在血流中起作用。膜島素是單鏈前體 膜島素 原的產(chǎn)物，其中連接區(qū)（35個(gè)殘基)將B鏈的C-末端殘基(殘基Β30)連接到A鏈的N-末端 殘基（圖1Α)。各種跡象表明，其由胰島素樣核心和無序的連接肽組成（圖1Β)。三種特定的 二硫鍵（Α6-Α11、Α7-Β7和Α20-Β19 ;圖IA和1Β)形成被認(rèn)為偶聯(lián)到粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER)中胰 島素原的氧化折疊。胰島素原在由ER輸出至高爾基體后不久組裝形成可溶性Zn 2+-配位六 聚物。內(nèi)切蛋白酶解消化并轉(zhuǎn)化為胰島素在未成熟的分泌顆粒中發(fā)生，隨后發(fā)生形態(tài)凝聚。 已經(jīng)通過電子顯微鏡法（EM)觀察到成熟貯藏顆粒中鋅胰島素六聚物的結(jié)晶陣列。胰島素序 列以圖示形式顯示在圖IC中。個(gè)別的殘基通過氨基酸同一性(通常使用標(biāo)準(zhǔn)三字母代碼)、 鏈和序列位置(通常為上標(biāo)形式）表示。與本發(fā)明相關(guān)的是長度6-11個(gè)殘基的新型縮短的 C結(jié)構(gòu)域替代人胰島素原的36-殘基野生型C結(jié)構(gòu)域特性的發(fā)明。
[0008] 纖維化，作為在用于治療糖尿病的胰島素和胰島素類似物的制造、儲(chǔ)存與使用中 的嚴(yán)重問題，隨著更高溫度、更低pH、攪拌，或脲、胍、乙醇助溶劑的存在，或疏水性表面而 增強(qiáng)。目前的美國藥物法規(guī)要求，如果以1%或更高的水平發(fā)生纖維化，胰島素要被丟棄。 因?yàn)樵诟邷囟认吕w維化增強(qiáng)，患有糖尿病的患者最好在使用前必須將胰島素保持冷藏。 胰島素或胰島素類似物的纖維化對(duì)使用其中將少量胰島素或胰島素類似物定期注入患者 體內(nèi)的外部胰島素栗的此類患者可能是特別關(guān)注的。在此類使用中，胰島素或胰島素類 似物在栗設(shè)備中不保持冷藏，胰島素的纖維化會(huì)導(dǎo)致用于將胰島素或胰島素類似物注入 體內(nèi)的導(dǎo)管堵塞，可能導(dǎo)致血糖水平不可預(yù)測(cè)地波動(dòng)或甚至導(dǎo)致危險(xiǎn)的高血糖癥。在高 于25°C的溫度下，每提高10°C，胰島素表現(xiàn)出10倍或更高的降解速率的提高；因此，指南 要求儲(chǔ)存在<30°C的溫度下并優(yōu)選冷藏儲(chǔ)存。配制為pH小于5的可溶性溶液(如Lantus? (Sanofi-Aventis)，其含有在pH 4. 0下的甘精胰島素和鋅離子的未緩沖溶液）的基礎(chǔ)胰島 素類似物也會(huì)由于在室溫下或高于室溫下的物理降解而限制其自身的壽命；此類制劑中使 用的酸性條件削弱了胰島素自組裝，并減弱了鋅離子的結(jié)合，降低了通過在鋅-蛋白質(zhì)組 裝物中的螯合作用能保護(hù)胰島素類似物的程度。
[0009] 胰島素易于化學(xué)降解，涉及隨分子中原子重排的損失的化學(xué)鍵斷裂或不同胰島素 分子之間的化學(xué)鍵形成?；瘜W(xué)鍵方面的此類變化通常在蛋白質(zhì)的未折疊狀態(tài)下介導(dǎo)，由此， 提高其熱力學(xué)穩(wěn)定性的胰島素的修飾也可能會(huì)延遲或防止化學(xué)降解。胰島素還易于物理降 解。蛋白質(zhì)纖維化的目前的理論認(rèn)為，纖維化機(jī)理經(jīng)由部分折疊的中間狀態(tài)進(jìn)行，其進(jìn)而聚 集形成淀粉樣蛋白的核。在該理論中，有可能的是穩(wěn)定天然狀態(tài)的氨基酸置換可能或可能 不穩(wěn)定該部分折疊的中間狀態(tài)，并可能或可能不提高(或降低）天然狀態(tài)與中間狀態(tài)之間的 自由能壁皇。因此，目前的理論表明，在雙鏈胰島素分子中給定的氨基酸置換提高或降低纖 維化風(fēng)險(xiǎn)的趨勢(shì)是高度不可預(yù)知的。胰島素分子結(jié)構(gòu)模型設(shè)想三-α螺旋的近乎完全展開 (如在天然狀態(tài)中看到的那樣）以及B鏈的連續(xù)堆疊與A鏈的連續(xù)堆疊形成的β折疊的平 行排列；在鏈之間和在A鏈中的天然二硫化物配對(duì)得以保留。此類平行交叉β折疊要求在 A鏈的N末端與B鏈的C末端之間的顯著分離（>30 Α)，這兩個(gè)末端在胰島素單體天然狀態(tài) 中通常非常接近（〈10 Α)。具有縮短的C結(jié)構(gòu)域的單鏈胰島素類似物對(duì)纖維化的顯著抗性 在本領(lǐng)域是已知的，并被認(rèn)為反映了胰島素原絲中平行交叉β折疊的展開結(jié)構(gòu)與具有天 然二硫化物配對(duì)的單鏈胰島素類似物的結(jié)構(gòu)(其中縮短的C結(jié)構(gòu)域?qū)鏈的N末端與B鏈 的C末端之間的距離限制為在原絲中不利）之間的拓?fù)洳幌嗳菪浴?br>[0010] 單鏈胰島素類似物可能因此似乎提供了設(shè)計(jì)抗纖維化胰島素類似物的有利途徑。 但是，過去，此類類似物表現(xiàn)出低活性，其相對(duì)于野生型人胰島素可為1%或更低。(雖然Lee， H. C.等人（2000)聲稱具有長度為57個(gè)殘基或58個(gè)殘基的野生型A-和B-結(jié)構(gòu)域的單鏈 胰島素類似物表現(xiàn)出相對(duì)于人胰島素為30-40%范圍的受體結(jié)合親和力，該出版物因科學(xué) 上的不當(dāng)行為在2009年被撤回；在我們手中，由Lee，Η. C.等人公開的類似物表現(xiàn)出小于 1%的相對(duì)親和力。）可以通過引入AspB1° (-種本領(lǐng)域已知的用于提高胰島素對(duì)胰島素受體 的親和力的置換)以部分恢復(fù)親和力。我們此前已經(jīng)描述過具有C結(jié)構(gòu)域接頭GGGPRR的含 有Asp B1°的57個(gè)殘基的單鏈胰島素。但是，在A結(jié)構(gòu)域和/或B結(jié)構(gòu)域中使用縮短的C結(jié) 構(gòu)域和此類置換可以令結(jié)合比例向著相對(duì)于IR-B對(duì)IR-A的結(jié)合提高的比例傾斜，如題為 "Isoform-Specific Insulin Analogues" 的美國專利申請(qǐng)?zhí)?12/989, 399 (經(jīng)此引用并入 本文）中所公開的那樣。描述了具有高受體結(jié)合親和力的單鏈胰島素類似物，其中縮短的C 結(jié)構(gòu)域是胰島素樣生長因子I (IGF-I ;序列GYGSSSRRAPQT ;SEQ ID NO: 12)的12個(gè)殘基 的C結(jié)構(gòu)域，產(chǎn)生嵌合蛋白。但是，此類嵌合分子表現(xiàn)出對(duì)IGF-IR提高的相對(duì)和絕對(duì)親和 力。此類改變，如同與Asp B1°和在BlO位置處的其它置換相關(guān)的那些，由于可能與攝取此類 類似物的動(dòng)物或人類患者中提尚的癌癥風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)而引起了廣泛的關(guān)注。針對(duì)基礎(chǔ)膜島素 類似物，即設(shè)計(jì)為隨從皮下積存的12-24小時(shí)胰島素吸收狀況和12-24小時(shí)胰島素作用狀 況每日一次給藥的那些，此類關(guān)注尤為顯著。
[0011] 本發(fā)明出于醫(yī)療和社會(huì)需求，工程改造一種每日一次型基礎(chǔ)單鏈胰島素類似物， 其結(jié)合了（ i)對(duì)降解的抗性，與（ii)實(shí)質(zhì)上體內(nèi)降糖效力，以及（iii)降低的對(duì)IGF-IR的 交叉結(jié)合，和（iv)類似于野生型人胰島素的對(duì)該胰島素受體的A-和B-同種型的親和力比。 后一目標(biāo)反映了胰島素在人體內(nèi)的多效功能和靶組織。胰島素作用的經(jīng)典范例集中于作為 該激素的靶組織的脂肪細(xì)胞(其中胰島素調(diào)節(jié)甘油三酯液滴形式的燃料儲(chǔ)存)、肝臟(其中 胰島素調(diào)節(jié)經(jīng)由葡萄糖新生的葡萄糖生產(chǎn)，并調(diào)節(jié)糖原形式的燃料儲(chǔ)存）和肌肉（其中胰島 素調(diào)節(jié)葡萄糖由血流經(jīng)由運(yùn)輸注入GLUT4的質(zhì)膜)的器官特異性功能。但是，最近的研究已 經(jīng)揭示，胰島素在其它器官和組織中具有生理作用，如在大腦的下丘腦中，其中胰島素響應(yīng) 性神經(jīng)回路影響肝代謝、食欲、飽腹感，并有可能影響理想體重的設(shè)定點(diǎn)。盡管人類基因組 含有編碼該胰島素受體的單個(gè)基因，含有胞質(zhì)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白，其前信使RNA 經(jīng)歷選擇性剪接以產(chǎn)生不同的A和B同種型，其分布分?jǐn)?shù)在各器官中可能不同，并且其信號(hào) 傳導(dǎo)功能在相同細(xì)胞中可能不同。
[0012] 該A和B同種型(指定為IR-A和IR-B)在對(duì)胰島素的親和力方面