一種檢測(cè)小分子G蛋白R(shí)ap1活性的方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于分子生物領(lǐng)域，一種檢測(cè)小分子G蛋白R(shí)apl活性的方法及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]小分子G蛋白R(shí)apI屬于Ras家族，其結(jié)構(gòu)類似于Ras，當(dāng)結(jié)合GTP后處于活性狀態(tài)(Rap 1-GTP )，結(jié)合GDP后則處于非活性狀態(tài)(Rap 1-⑶P)。在細(xì)胞內(nèi)，Rap I通過(guò)Rap 1-GTP與Rapl-GDP之間的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)換起分子開關(guān)的作用，胞外信號(hào)通過(guò)特異性鳥嘌呤核苷酸交換因子調(diào)控Rap I與GTP結(jié)合，從而激活RapI ；胞內(nèi)特異性GTP酶激活蛋白促進(jìn)GTP水解，從而使Rap I失活?；罨腞apl信號(hào)通過(guò)其下游不同的信號(hào)分子調(diào)控不同的生物學(xué)功能。胞外刺激因子例如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、趨化因子以及第二信使Ca2+、DAG、cAMP等，可通過(guò)鳥嘌呤核苷酸交換因子激活Rapl從而調(diào)控不同的信號(hào)通路;而活化的大麻素受體可以通過(guò)下調(diào)GTP酶激活蛋白使已被激活的Rapl信號(hào)始終處于激活狀態(tài)。因此，Rapl信號(hào)介導(dǎo)的生理功能呈現(xiàn)出多樣性，對(duì)細(xì)胞增殖、分化、粘附、迀移等起不同的調(diào)控作用。1^?1通過(guò)1^^/^孤1/2、？38/^^1(/CREB或PI3K調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖，還能通過(guò)調(diào)節(jié)鈣粘著蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞粘附作用而影響腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和迀移；在淋巴系統(tǒng)中，Rapl的病理性持續(xù)激活導(dǎo)致骨髓白血病;在神經(jīng)系統(tǒng)中Rapl信號(hào)能促進(jìn)神經(jīng)元極性建立和軸突生長(zhǎng)，還能調(diào)節(jié)神經(jīng)突生長(zhǎng)。Rapl信號(hào)能夠調(diào)控神經(jīng)突觸結(jié)構(gòu)和功能的可塑性變化，與神經(jīng)元的迀移也具有相關(guān)性。因此，檢測(cè)Rapl蛋白的活性對(duì)于了解腫瘤的增殖和迀移，以及研究其在神經(jīng)系統(tǒng)中的功能具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的發(fā)明目的之一在于是提供一種檢測(cè)小分子G蛋白R(shí)apl活性的方法，利用該方法可檢測(cè)組織或體外培養(yǎng)的細(xì)胞系中Rapl的活性水平。
[0004]本發(fā)明的目的之二在于利用上述方法檢測(cè)小分子G蛋白R(shí)apl活性的的試劑盒。
[0005]為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供包含谷胱甘肽瓊脂糖凝膠珠、IPbuffer、SDS-PAGEloading buffer、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑及可特異性結(jié)合Rapl-GTP的GST-RalGDS-RBD融合蛋白與可特異性識(shí)別Rapl抗體的試劑盒及檢測(cè)方法。
[0006]其技術(shù)解決方案如下:一種檢測(cè)小分子G蛋白R(shí)apl活性的方法，根據(jù)人RalGDS基因的Rapl結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RBD)能夠特異結(jié)合Rapl-GTP的特性，構(gòu)建GST-RalGDS-RBD原核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)誘導(dǎo)純化得到GST-Ral⑶S-RK)蛋白，并利用GST pull-down和Western-Blot方法檢測(cè)小分子G蛋白R(shí)apl活性的方法；
其具體步驟如下:
步驟I構(gòu)建GST-Ral⑶S-RK)原核表達(dá)質(zhì)粒
Ral⑶S是Rapl下游的效應(yīng)因子，含有Rapl結(jié)合結(jié)構(gòu)域(位于其798-885位氨基酸殘基)，可以直接結(jié)合Rapl-GTP。查詢NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中人RalGDS基因?qū)?yīng)798-885位氨基酸殘基的編碼序列，對(duì)照原核表達(dá)載體PGEX-6P-1的多克隆位點(diǎn)(圖1所示)，選擇其中的BamH I和EcoRI位點(diǎn)作為酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)上游引物(S^CGCGGATCCGCGctgccgctctacaacd')和下游引物(57 - CCGGAATTCCGGtcagaagatgcccttggcaa-37 )，以人肝文庫(kù)為模版，PCR擴(kuò)增得到目的片段。經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離后用凝膠回收試劑盒回收，回收的目的片段和PGEX-6P-1空載體分別經(jīng)BamH I和EcoR I雙酶切后，再次經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離回收，回收的目的片段和載體以5:1的比例混合。然后用T4 DNA連接酶于16°C連接過(guò)夜，隨后用該體系轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌，涂平板并挑選其中的陽(yáng)性克隆，所選的陽(yáng)性克隆經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶切后得到大約418bp的目的片段(圖2所示)XST-RalGDS-RBD原核表達(dá)質(zhì)粒測(cè)序得到的目的片段和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上的編碼序列完全一致(圖3所示)。這表明GST-RalGDS-RBD原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。
[0007]步驟2 GST-RalGDS-RBD融合蛋白的原核表達(dá)和純化
用上述構(gòu)建的GST-RalGDS-RBD質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21大腸桿菌，按1%轉(zhuǎn)接于100 mL LB培養(yǎng)基中，37°C 180 r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(D6Qonm=0.6);隨后按100 μΜ/L終濃度加入IPTG，20°C 180 r/min振蕩誘導(dǎo)過(guò)夜;次日4°C 4000 rpm 1min離心收集菌液，將得到的大腸桿菌用30 mL緩沖液PB[30 mL PBS中含0.5 mM/L DTT^2 yg /mL Aprotimin、2 yg /mLLeupeptinU mM/L PMSFa mM/L Na3V04、10 mM/L NaF]重懸，然后高壓破碎，隨后超聲波進(jìn)一步破碎。4°C 13000 rpm 1min離心裂解產(chǎn)物，取上清，將預(yù)先經(jīng)過(guò)平衡的300 yL谷胱甘肽瓊脂糖凝膠珠與離心后得到的上清混合，4°C混旋轉(zhuǎn)2h，然后預(yù)冷的PB緩沖液洗滌谷胱甘肽瓊脂糖凝膠珠，利用洗脫緩沖液[5ml配方:250 yL 1M/L Tris-Cl，ph7.6、4.75mL超純水、0.0154g還原型谷胱甘肽]把GST-Ral⑶S-RBD從凝膠珠上洗滌下來(lái)。最后利用SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色方法檢測(cè)純化的GST-RalGDS-RBD融合蛋白(圖4所示，大小約40kDa)。
[0008]步驟3 使用GST pull-down和Western-Blot方法檢測(cè)Rapl的活性水平
將HEK293細(xì)胞接種于100 cm2培養(yǎng)皿，待細(xì)胞長(zhǎng)到80%密度時(shí)，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染質(zhì)粒RaplV12 (rapl基因組成型活性形式，表達(dá)產(chǎn)物相當(dāng)于Rapl-GTP)。2處后收集細(xì)胞，先用PBS洗一次，然后用IP buffer裂解液冰上裂解細(xì)胞，12000 rpm離心10 min，取上清，留取其中2 O %作為對(duì)照。轉(zhuǎn)染R a PIV12的細(xì)胞上清均分為兩份，分別與偶聯(lián)了 G S T空載體和G S T -RalGDS-RBD的谷胱甘肽瓊脂糖凝膠珠混合，置搖床上4°C混旋轉(zhuǎn)Ih，4°C 6000 rpm離心，用IP裂解液洗滌三次，最后用微量進(jìn)樣器吸干Ep管內(nèi)所有剩余液體，加入30 μ? SDS-PAGEloading buffer，煮沸10 min，最后通過(guò)western-blot檢測(cè)目標(biāo)Rapl蛋白。結(jié)果如圖5所示，其中以GST空載體作為陰性對(duì)照，GST-Ral⑶S-RBD能夠與HEK293細(xì)胞中表達(dá)的Rapl-GTP發(fā)生相互作用，并且這種相互作用具有很強(qiáng)的特異性。
[OOO9 ]利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染質(zhì)粒Rap IV12 (rap I基因組成型活性形式，表達(dá)產(chǎn)物相當(dāng)于Rap 1-GTP)或RaplN17(rapl基因組成型失活形式，表達(dá)產(chǎn)物相當(dāng)于Rapl-GDP)到HEK293細(xì)胞中。24h后收集細(xì)胞，先用PBS洗一次，然后用IP裂解液冰上裂解細(xì)胞，12000 rpm離心10 min，取上清，留取其中20%作為對(duì)照。偶聯(lián)了GST-RalGDS-RBD的谷胱甘肽瓊脂糖凝膠珠分別與轉(zhuǎn)染RaplV12的細(xì)胞上清和轉(zhuǎn)染RaplN17的細(xì)胞上清混合，置搖床上4°C混旋轉(zhuǎn)lh，4°C 6000 rpm離心，用IP裂解液洗滌三次，最后用微量進(jìn)樣器吸干Ep管內(nèi)所有剩余液體，加入30 μ? SDS-PAGE loading buffer，煮沸10 min，最后通過(guò)western-blot檢測(cè)目標(biāo)Rapl蛋白。結(jié)果如圖6所示，GST-RalGDS-RBD能夠與HEK293細(xì)胞中表達(dá)的Rapl-GTP發(fā)生相互作用，但不和HEK293細(xì)胞中表達(dá)的Rap 1-GDP結(jié)合。本發(fā)明的基本原理
小分子G蛋白R(shí) a P I活性檢測(cè)試劑盒基于谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(g I u t a t h i ο n e S-transferase，GST)親和層析和GST pul Ι-down方法。首先利用重組技術(shù)將谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶與含有Rapl結(jié)合區(qū)域(Rapl binding domain, RBD)的RalGDS-RBD融合。GST-Ral⑶S-RBD融合蛋白能通過(guò)GST與固相化在載體上的谷胱甘肽(Glutath1ne, GTH)親和結(jié)合，也可以通過(guò)Rapl結(jié)合區(qū)域結(jié)合Rapl-GTP。當(dāng)GST-RalGDS-RBD融合蛋白親和結(jié)合在谷胱甘肽固化瓊脂糖凝膠珠時(shí)，該固相載體能把Rapl-GTP從細(xì)胞或組織裂解液中pul Ι-down下來(lái)。IP裂解液洗去未與固相載體結(jié)合的蛋白后，然后制成供SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白樣品。利用Western Blot的檢測(cè)方法，使用Rapl抗體，S卩可特異性檢測(cè)病理組織或細(xì)胞中Rapl的活性水平。
[0010]本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn):
1.本發(fā)明采用的檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單，易于標(biāo)準(zhǔn)化。
[0011]2.本發(fā)明采用的GST-RalGDS-RBD融合蛋白純度高，特異性好。
[0012]3.本發(fā)明采用的磷酸酶抑制劑混合物能很好地抑制Rapl-GTP降解，從而保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性。
[0013]本發(fā)明試劑盒的組成:
I.GST-Ral⑶S-RK)融合蛋白
規(guī)格:600 yg，可供30次pulΙ-down實(shí)驗(yàn)，蛋白純化濃度>75% (圖4所示)。
[0014]保存條件:溶解于50 mM Tris-HCl，10%甘油，0.02% NaN3中，保存在_80°C。用途:GST-RalGDS-RBD融合蛋白能通過(guò)GST與固相化在載體上的谷胱甘肽親和結(jié)合，也可以通過(guò)Rap I結(jié)合區(qū)域結(jié)合Rap 1-GTP。
[0015]1.1P buffer規(guī)格:200 ml
用途:1P buffer用于病理組織或細(xì)胞裂解，保存在4°C。
[0016]注:使用時(shí)加蛋白酶抑制劑cocktail (1:500)以及磷酸酶抑制劑。
[0017]1.Washing buffer
washing buffer用于洗滌谷胱甘肽瓊脂糖凝膠珠，保存在4°C。
[0018]注:使用時(shí)加蛋白酶抑制劑cocktail (1:500)以及磷酸酶抑制劑。
[0019]2.谷胱甘肽瓊脂糖凝膠珠規(guī)格:450 μ?,保存在4°C。
[0020]用途:作為固相載體，用于結(jié)合GST-RalGDS-RBD融合蛋白。
[0021]3.SDS-PAGE loading buffer規(guī)格:1 ml,室溫保存。
[0022]用途:含有4% SDS (w/v),2% glycerol和0.05%溴酚藍(lán)，用于蛋白制樣，保存在4?C。
[0023]4.Rap I 抗體
規(guī)格:ant1-Rapl (50 μ?, Sc~65,Santa Cruz公司)
用途:用于Western blot檢測(cè)。
[0024]5.蛋白酶抑制劑Cocktail (50 μ?)，保存在_20°C。
[0025]6.磷酸酶抑制齊IJ 500 mM NaF (100 μ1)、100 mM Na3V04 (100 μ?)，保存在