專利名稱：一種通過促進(jìn)活性蛋白聚集體解聚提高淀粉脫支酶產(chǎn)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種淀粉脫支酶的發(fā)酵生產(chǎn)方法，特別是一種通過促進(jìn)活性蛋白聚集體解聚提高重組淀粉脫支酶胞外分泌的發(fā)酵生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
淀粉脫支酶(E. C. 3. 2. I. 41)是一類能夠水解支鏈淀粉、a _極限糊精等分子中 a _1，6葡萄糖苷鍵的淀粉水解酶。淀粉脫支酶通常和其它淀粉酶復(fù)配用于生產(chǎn)葡萄糖、果糖、麥芽糖、麥芽糊精、低聚糖等產(chǎn)品。淀粉脫支酶可以切斷淀粉中的分支點(diǎn)，加速后續(xù)酶的反應(yīng)，縮短反應(yīng)時(shí)間，提高淀粉的轉(zhuǎn)化率，降低其它糖化用酶制劑的使用量，從而達(dá)到增加產(chǎn)量、提高設(shè)備利用率、降低生產(chǎn)成本的目的。目前能夠在最適溫度和最適PH上同時(shí)實(shí)現(xiàn)與糖化酶進(jìn)行較好配合的商品化淀粉脫支酶主要是美國(guó)杰能科公司的Optimax L-1000。我國(guó)雖然對(duì)淀粉脫支酶進(jìn)行了大量的研究，但是還沒有實(shí)現(xiàn)該酶的工業(yè)化生產(chǎn)，還需要依賴進(jìn)口。近年來國(guó)內(nèi)外學(xué)者把淀粉脫支酶的開發(fā)研究作為非常重要的研究主題。Bunzo Mikami等對(duì)來源于Klebsiella pneumoniae的淀粉脫支酶蛋白晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析,發(fā)現(xiàn)該酶具有GH13淀粉水解酶家族共有的(P/a)8桶狀結(jié)構(gòu)。近年來國(guó)外學(xué)者從極端嗜熱微生物中分離出具有可以耐受接近100°C高溫的淀粉脫支酶，但是這些酶往往只有在pH 6.0以上才具有較高的活性。R Koch等從Fervidobacterium pennavorans中分離到最適pH在
4.5到5. 0，而且能夠在70°C條件下具有較高穩(wěn)定性的淀粉脫支酶。國(guó)內(nèi)主要研究了產(chǎn)淀粉脫支酶野生菌的篩選鑒定、重組菌構(gòu)建、發(fā)酵條件優(yōu)化以及在淀粉原料酶解中的應(yīng)用。唐寶英等人從土壤中分離出一株產(chǎn)淀粉脫支酶芽孢桿菌，通過誘變和產(chǎn)酶條件優(yōu)化，酶活從
I.6U/mL提高到8. 8U/mL，該酶最適反應(yīng)溫度和pH分別為75°C和4. 6，在55°C反應(yīng)條件下， 在pH4. 0-8. 0范圍內(nèi)活性穩(wěn)定。張明炎等將來源于地衣芽孢桿菌的淀粉脫支酶編碼基因克隆大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶最高達(dá)到6. 5U/mL。蘇品等實(shí)現(xiàn)了來源于Thermotoga maritima的淀粉脫支酶編碼基因在枯草芽孢桿菌中的成功表達(dá)，該酶最適溫度90°C，最適 pH 6.0，發(fā)酵酶活可達(dá)89. lU/mL。但是這些菌株的產(chǎn)酶水平仍然較低，生產(chǎn)成本高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種通過促進(jìn)活性蛋白聚集體解聚提高淀粉脫支酶產(chǎn)量的方法，以解決現(xiàn)有發(fā)酵工藝中胞外酶活較低、生產(chǎn)成本高、無(wú)法實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的問題。為解決上述問題，本發(fā)明的技術(shù)方案如下(I)重組菌構(gòu)建根據(jù)NCBI上登錄的pulB的基因序列(Genbank號(hào)JN872757. I)，采用化學(xué)全合成方法合成淀粉脫支酶基因序列pulB。用于構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體的質(zhì)粒是pET20b (+)，帶有17啟動(dòng)子。將pET20b(+)質(zhì)粒和含有pulB基因的質(zhì)粒分別進(jìn)行Nco I和HindIII雙酶切，酶切產(chǎn)物割膠回收后，再用T4連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng) 37°C培養(yǎng)8h，挑轉(zhuǎn)化子在含有100mg/L氨芐青霉素液體的LB中振蕩培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證得到表達(dá)質(zhì)粒pulB/pET20b (+)。將質(zhì)粒pulB/pET20b(+)轉(zhuǎn)化E.coli BL21 (DE3)宿主菌，涂布含氨芐青霉素 (100mg/L)的LB平板上，37°C培養(yǎng)8h，命名為pulB/pET20b (+)/BL21 (DE3)。挑單菌落至液體LB中，37°C培養(yǎng)過夜，保存甘油管。(2)種子制備將_80°C甘油管保存的菌株接入種子培養(yǎng)基中，使用回轉(zhuǎn)恒溫調(diào)速搖床進(jìn)行培養(yǎng)， 控制轉(zhuǎn)速200rpm/min，培養(yǎng)溫度37°C，初始pH值7. 10，培養(yǎng)時(shí)間10小時(shí)。⑶發(fā)酵工藝將活化后的種子培養(yǎng)液接種入發(fā)酵培養(yǎng)基中，通過控制攪拌轉(zhuǎn)速和通風(fēng)量使溶氧維持20-30 %，控制溫度為30土 1°C，流加質(zhì)量濃度為25 %的氨水控制pH 7. 0±0. 5，培養(yǎng) 5-6小時(shí)；待溶氧上升至80-100%，以指數(shù)流加的方式補(bǔ)加補(bǔ)料液使溶氧維持在20-30%， 溫度維持在30± I °C，流加氨水控制pH 7. 0±0. 5，當(dāng)菌體OD6tltl達(dá)到15-30時(shí)補(bǔ)加
0.75-1.5% (m/V)的甘氨酸；繼續(xù)培養(yǎng)至菌體吸光度OD6tltl達(dá)到45-60時(shí)，降溫至23_30°C，通過補(bǔ)加濃度為 200g/L乳糖溶液，使發(fā)酵液剩余乳糖濃度控制在4-6g/L。同時(shí)溶氧控制在20-30 %，控制 pH 7. 0±0. 5，誘導(dǎo)15小時(shí)左右，添加0. 1-1. 0%濃度的Tween 80，繼續(xù)發(fā)酵1-10小時(shí)。所述種子培養(yǎng)基的組成為工業(yè)級(jí)蛋白胨10g/L，工業(yè)級(jí)酵母粉5g/L，NaCL IOg/ L，pH 7. 10，種子培養(yǎng)基還可以添加100mg/L氨芐青霉素。所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為甘油6g/L，工業(yè)級(jí)蛋白胨12g/L，工業(yè)級(jí)酵母粉24g/L， KH2P042. 31g/L，K2HP043H20 16. 43g/L，微量元素液 10mL/L，發(fā)酵培養(yǎng)基還可以添加 100mg/L
氨芐青霉素。所述微量元素液為=FeSO4 7H20 10g/L，ZnSO4 7H20 2. 25g/L，CuSO4 5H20 I. Og/ L, MnSO4 4H20 0. 5g/L, Na2B4O7 IOH20,0. 23g/L, CaCl2 2. Og/L, (NH4)6Mo7O24O. lg/L。所述補(bǔ)料液為甘油500g/L，MgSO4 7H20 20g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉30g/L。所述甘油補(bǔ)料液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50% (500g/L);甘油含量的測(cè)定方法采用HPLC : Zorbax Extend_C18 (4. 6mmX 250mm, 5 u m),柱溫 35 °C，進(jìn)樣量10 u L,差不折光檢測(cè)器溫度35°C,流速1. OmL/min，流動(dòng)相純水；發(fā)酵培養(yǎng)4小時(shí)后，每隔I小時(shí),對(duì)發(fā)酵液中甘油濃度進(jìn)行一次測(cè)定，根據(jù)測(cè)定結(jié)果加入一定體積的補(bǔ)料液，使發(fā)酵液中甘油濃度維持在
2-5g/L。所述發(fā)酵液中乳糖濃度的測(cè)定方法參見GB/T 5413. 5-1997 ;每隔I小時(shí)，對(duì)發(fā)酵液中乳糖濃度進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)結(jié)果加入一定體積的乳糖誘導(dǎo)液，使發(fā)酵液中乳糖濃度維持在 4-6g/L。本發(fā)明采用添加Tween 80結(jié)合其它發(fā)酵控制工業(yè)(如分段控溫發(fā)酵工藝、恒定溶氧控制工藝、PH控制工藝、補(bǔ)料分批發(fā)酵控制工藝、誘導(dǎo)控制工藝)，促進(jìn)重組大腸桿菌活性蛋白聚集體解聚，實(shí)現(xiàn)了胞外高效發(fā)酵生產(chǎn)淀粉脫支酶，發(fā)酵結(jié)束后胞外重組淀粉脫支酶酶活為386U/mL。由于淀粉脫支酶分泌到培養(yǎng)基中，菌體經(jīng)過簡(jiǎn)單的過濾就可得到酶液，工藝簡(jiǎn)單易行，減少了后續(xù)提取成本，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I具體過程如下以構(gòu)建的重組大腸桿菌pulB/pET20b(+)/BL21(DE3)為生產(chǎn)菌種。I、種子培養(yǎng)將_80°C甘油管保存的菌種接入種子培養(yǎng)基(工業(yè)級(jí)蛋白胨10g/L， 工業(yè)級(jí)酵母粉5g/L，NaCL 10g/L, pH 7. 10)中，使用恒溫?fù)u床進(jìn)行培養(yǎng)轉(zhuǎn)速200rpm/min， 溫度37°C，培養(yǎng)8小時(shí)。2、發(fā)酵產(chǎn)酶分批發(fā)酵階段將種子液以8%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(甘油8g/L，蛋白胨lg/L， 酵母粉 2g/L，KH2PO4 13. 5g/L，(NH4)2HPO4 4g/L，檸檬酸 I. 7g/L，MgSO4 0. 68g/L，微量元素液 10mL/L)，通過控制攪拌轉(zhuǎn)速和通風(fēng)量使溶氧維持30%，控制溫度為30°C，流加質(zhì)量濃度為 25%的氨水控制pH 7. 0，培養(yǎng)時(shí)間6個(gè)小時(shí)；補(bǔ)料發(fā)酵階段待溶氧上升至80-100%，批式培養(yǎng)結(jié)束后，以指數(shù)流加的方式補(bǔ)加以甘油為碳源的補(bǔ)料液(甘油500g/L，MgSO4 *7H20 20g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉30g/L)， 使菌體以0. 21T1的比生長(zhǎng)速率進(jìn)行生長(zhǎng)，控制溫度30°C，溶氧維持在30%，當(dāng)菌體0D_達(dá)到15，采用一次性添加的方式，加入0. 75%甘氨酸(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))，流加質(zhì)量濃度為25% 的氨水控制pH 7. 0 ;誘導(dǎo)培養(yǎng)階段當(dāng)菌體0D_達(dá)到50時(shí)，將溫度降為30°C，溶氧維持在30%，連續(xù)補(bǔ)加0. 3g L-1 IT1乳糖,每5h降低10%的乳糖流速,通過補(bǔ)加濃度為200g/L乳糖溶液， 使發(fā)酵液剩余乳糖濃度控制在4-6g/L。同時(shí)溶氧控制在20-30%，控制pH 7.0±0. 5，誘導(dǎo) 20小時(shí)左右。發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，離心獲得菌體和胞外上清液，菌體經(jīng)過超聲破碎后離心，得到超聲破碎上清和超聲破碎沉淀。超聲破碎沉淀用0. IM pH4. 5醋酸buffer懸浮。然后分別測(cè)定胞外上清液、超聲破碎上清和超聲破碎沉淀懸浮液的淀粉脫支酶活力。胞外上清酶活為 15. 5U/mL，超聲破碎上清酶活為98U/mL，超聲破碎沉淀懸浮液酶活為393U/mL。結(jié)果表明，胞外酶活較低，而超聲破碎沉淀中含有大量具有淀粉脫支酶活性的重組蛋白，經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)這些蛋白是具有淀粉脫支酶活性的蛋白聚集體。實(shí)施例2具體過程如下以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的重組大腸桿菌ompA-pulA/pET24a/BL21(DE3) 為生產(chǎn)菌種。I、種子培養(yǎng)將_80°C甘油管保存的菌種接入種子培養(yǎng)基(工業(yè)級(jí)蛋白胨10g/L， 工業(yè)級(jí)酵母粉5g/L，NaCL 10g/L，100mg/L氨芐青霉素，pH 7. 10)中，使用恒溫?fù)u床進(jìn)行培養(yǎng)轉(zhuǎn)速200rpm/min，溫度37°C，培養(yǎng)8小時(shí)。2、發(fā)酵產(chǎn)酶分批發(fā)酵階段將種子液以8%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(甘油8g/L，蛋白胨lg/L， 酵母粉 2g/L，KH2PO4 13. 5g/L, (NH4) 2HP044g/L，檸檬酸 I. 7g/L，MgSO4 0. 68g/L，微量元素液 10mL/L,氨芐青霉素100mg/L)，通過控制攪拌轉(zhuǎn)速和通風(fēng)量使溶氧維持30 %，控制溫度為 30°C，流加質(zhì)量濃度為25%的氨水控制pH 7. 0，培養(yǎng)時(shí)間6個(gè)小時(shí)；
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補(bǔ)料發(fā)酵階段待溶氧上升至80-100%，批式培養(yǎng)結(jié)束后，以指數(shù)流加的方式補(bǔ)加以甘油為碳源的補(bǔ)料液(甘油500g/L，MgSO4 *7H20 20g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉30g/L)， 使菌體以021T1的比生長(zhǎng)速率進(jìn)行生長(zhǎng)，控制溫度30°C，溶氧維持在30%，當(dāng)菌體0D_達(dá)到 15，采用一次性添加的方式，加入0. 75%甘氨酸(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))，流加質(zhì)量濃度為25%的氨水控制pH 7. 0 ；誘導(dǎo)培養(yǎng)階段當(dāng)菌體0D_達(dá)到50時(shí)，將溫度降為25°C，溶氧維持在30%，連續(xù)補(bǔ)加0. 3g L-1 IT1乳糖,每5h降低10%的乳糖流速,通過補(bǔ)加濃度為200g/L乳糖溶液， 使發(fā)酵液剩余乳糖濃度控制在4-6g/L。同時(shí)溶氧控制在20-30%，控制pH 7.0±0. 5，誘導(dǎo) 15小時(shí)左右，添加0. 5%濃度的Tween 80，繼續(xù)發(fā)酵5小時(shí)。發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，離心獲得菌體和胞外上清液，菌體經(jīng)過超聲破碎后離心，得到超聲破碎上清和超聲破碎沉淀，沉淀用0. IM pH4. 5醋酸buffer懸浮。分別測(cè)定胞外上清液、 超聲破碎上清和超聲破碎沉淀懸浮液的淀粉脫支酶活力。胞外上清酶活為386U/mL，超聲破碎上清酶活為82U/mL，超聲破碎沉淀懸浮液酶活為51U/mL。結(jié)果表明，TweenSO的添加促進(jìn)了胞內(nèi)活性蛋白聚集體的解聚，提高了淀粉脫支酶的胞外分泌效率。
權(quán)利要求
1.一種通過促進(jìn)活性蛋白聚集體解聚提高淀粉脫支酶產(chǎn)量的方法，其特征在于以含有重組淀粉脫支酶編碼基因的大腸桿菌為生產(chǎn)菌株，發(fā)酵工藝如下將活化后的種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，通過控制攪拌轉(zhuǎn)速和通風(fēng)量使溶氧維持 20-30%，控制溫度為25-37 °C，流加氨水控制pH 7. 0±0. 5，培養(yǎng)5_6小時(shí)；待溶氧上升至80-100%，以指數(shù)流加的方式補(bǔ)加補(bǔ)料液使溶氧維持在20-30%，溫度維持在25-37°C，流加氨水控制pH 7. 0±0. 5，當(dāng)菌體0D600達(dá)到15-30時(shí)補(bǔ)加0. 75-1. 5% (m/V)的甘氨酸；繼續(xù)培養(yǎng)至菌體吸光度0D600達(dá)到45-60時(shí)，降溫至23_30°C，通過補(bǔ)加乳糖溶液，使發(fā)酵液剩余乳糖濃度控制在4-6g/L ;同時(shí)溶氧控制在20-30%，控制pH 7. 0±0. 5，誘導(dǎo)5_20 小時(shí)，添加吐溫80后再繼續(xù)發(fā)酵1-10小時(shí)。
2.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述Tween80的添加量為l_10g/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特在在于菌體吸光度0D600達(dá)到45-60時(shí)，降溫至 25。。。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于種子活化用培養(yǎng)基的組成為工業(yè)級(jí)蛋白胨 10g/L，工業(yè)級(jí)酵母粉 5g/L，NaCL 10g/L, pH 7. 10。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為甘油6g/L，工業(yè)級(jí)蛋白胨 12g/L，工業(yè)級(jí)酵母粉 24g/L，KH2P04 2. 31g/L，K2HP04 3H20 16. 43g/L，微量元素液 10mL/Lo
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述種子培養(yǎng)基中還含有氨芐青霉素，濃度為 100mg/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基中還含有氨芐青霉素濃度為 100mg/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種通過促進(jìn)活性蛋白聚集體解聚提高淀粉脫支酶產(chǎn)量的方法，屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以重組大腸桿菌pulB/pET20b(+)/BL21(DE3)為生產(chǎn)菌株，在工業(yè)級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)基中連續(xù)流加甘油進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵，發(fā)酵后期通過添加Tween 80來促進(jìn)活性蛋白聚集體解聚提高酶的分泌，發(fā)酵35小時(shí)，胞外酶活可達(dá)386U/mL。采取本策略進(jìn)行發(fā)酵實(shí)現(xiàn)了酶的高效胞外表達(dá)，大幅提高了生產(chǎn)強(qiáng)度。由于酶分泌到培養(yǎng)基中，菌體經(jīng)過簡(jiǎn)單的過濾就可得到酶液，工藝簡(jiǎn)單易行，減少了后續(xù)提取成本，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12R1/19GK102533701SQ201210035298
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月16日
發(fā)明者吳敬, 段緒果, 陳堅(jiān), 陳晟 申請(qǐng)人:江南大學(xué)