小麥光腥黑粉菌的激光共聚焦顯微鏡檢方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物病害檢測技術(shù)，特別是涉及小麥光腥黑粉菌的激光共聚焦顯微鏡檢方法。
【背景技術(shù)】
[0002]由小麥光腥黑粉菌(Tilletiaf0etida(Wallr.)Lir0，TFL)引起的小麥光腥黑粉病是世界上最具破壞性的小麥病害之一，在我國北方麥區(qū)發(fā)生較多，是北京市補充農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害生物。該病菌屬于擔(dān)子菌綱、半擔(dān)子菌亞綱、黑粉菌目、腥黑粉菌科、腥黑粉菌屬，可被土壤和種子傳播。被該病菌侵染的小麥籽粒具有強烈魚腥臭味，此病菌孢子含量超過0.6%即可引起嚴(yán)重中毒現(xiàn)象，人畜食后重者可引起惡心、嘔吐甚至昏迷等中毒癥狀(Goats，1999;Hoffman，1982)，嚴(yán)重影響小麥品質(zhì)及商業(yè)價值。我國曾嚴(yán)格規(guī)定小麥腥黑穗病粒超過6粒/公斤，將對整批污染的小麥不予收購(張金良等，2000)。該病害在春小麥和冬小麥上均有發(fā)生并遍布世界小麥種植區(qū)，腥黑穗病可侵染70%以上的麥穗，引起25%?50%的減產(chǎn)，嚴(yán)重的甚至絕產(chǎn)(Holton，1947)。腥黑穗病曾在甘肅省平均發(fā)病率達28%?38% (甘國福等，1995)。因此，只有對小麥光腥黑粉病進行早期預(yù)警，才能最大限度地減少該病帶來的經(jīng)濟損失。
[0003]目前，采用對于疑似被小麥光腥黑粉菌侵染小麥的掃描電鏡觀察是普遍的方法，例如馬青等人發(fā)表的《小麥光腥黑穗菌萌發(fā)的超微結(jié)構(gòu)研究》1999西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報中記載的方法及觀察到的圖片，不能一目了然地看到菌絲，由于沒有經(jīng)過染色，小麥光腥黑粉菌的菌絲和小麥組織沒有很明顯的分別特征，無法判斷研究過程中，接種的小麥光腥黑粉菌是否成功接種。如果能給準(zhǔn)確判斷并獲得成功接種的種子，將其用于下一步研究最好，能給提高下一步研究的效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]根據(jù)上述領(lǐng)域的不足和需求，本發(fā)明提供一種小麥光腥黑粉菌的顯微鏡檢測方法，高效簡單，染色效果好，使菌絲和植物材料在顯微鏡下對比度強，可清晰地觀察到植物材料中菌絲侵染的程度。
[0005]本發(fā)明要求保護的技術(shù)方案如下:
[0006]小麥光腥黑粉菌的激光共聚焦顯微鏡檢方法，其特征在于，包括如下步驟:
[0007](I)樣品染色:將待測樣品用染色液I染色10-30分鐘，然后用10yg/mL WGA-AF 488染色10-30分鐘，最后用pH 7.4的10 X PBS沖洗3-5次；
[0008]所染色液I 為 5yg/mL Propidiumidodide與 0.02 %Tween 20 以體積比 1:1混合而成；
[0009](2)鏡檢:將染色后的樣品置于激光共聚焦顯微鏡下觀察，采用的參數(shù)如下:
[0010]Propidiumidodide激發(fā)綠光波長為56Inm，發(fā)射光波長為590?640nm;WGA-AF 488激發(fā)藍(lán)光波長為488nm，發(fā)射光波長為500?520nm，
[0011]如果顯微鏡下出現(xiàn)綠色的菌絲，說明待測樣品含有小麥光腥黑粉菌。
[0012]所述待測樣品為取自小麥成熟期根部、莖桿部或葉片部的組織。
[0013]所述待測樣品染色之前采用乙醇固定。
[0014]實驗結(jié)果表明，采用本發(fā)明方法觀察小麥光腥黑粉菌侵染的植物組織，具有染色清晰、對比度強的優(yōu)點，能夠清楚地判斷小麥光腥黑粉菌的侵染程度。
[0015]本發(fā)明的方法簡單高效，易于操作。在研究小麥與寄生致病菌互作的過程中，能夠簡明地獲知小麥光腥黑粉菌是否成功接種。從而準(zhǔn)確判斷并獲得用于下一步研究的種苗，能夠提高研究工作的效率。
【附圖說明】
[0016]圖1.采用本發(fā)明方法觀察小麥光腥黑粉菌侵染的小麥相關(guān)組織，
[0017]其中，A，B，C(Merge)，D(明場)顯示的是小麥成熟期根部被TFL菌絲侵染；E，F(xiàn)，G(Merge)，H(明場)顯示的是小麥成熟期莖桿部被TFL菌絲侵染;I，J，K(Merge)，L(明場)顯示的是小麥成熟期葉片部被TFL菌絲侵染。
【具體實施方式】
[0018]下面通過具體實施例作進一步的詳細(xì)說明，需要理解的是，以下實施例僅作為解釋和說明，而不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0019]小麥光腥黑粉菌:采集自河南田間
[0020]小麥:冬選3號中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所
[0021]下述實施例中未特別說明的生物化學(xué)試劑均為本領(lǐng)域常規(guī)試劑，可以通過商購獲得或采用本領(lǐng)域常規(guī)方法配制而得，規(guī)格為實驗室純級即可。
[0022]實施例1.采用本發(fā)明方法觀察小麥光腥黑粉菌侵染的小麥組織
[0023]取材:剪取小麥光腥黑粉菌侵染的小麥成熟期根部、莖桿部和葉片部，葉片剪段成5_左右的方塊，去掉四周邊緣使其充分浸泡在無水乙醇固定液中，子房和花藥直接充分浸泡在無水乙醇固定液中
[0024]染色:將樣品置于離心管中，加入0.5mL 5yg/mL Propidiumidodide，0.5mL
0.02%Tween 20染色20min，去掉染料，然后加入0.5mL 10yg/mL WGA-AF 488染色20min，去掉染料，用ImL pH 7.4的10 XPBS沖洗3至5次，然后用錫箔紙包裹離心管隔絕光亮后，置于4度冰箱中備用。
[0025]鏡檢:將上述染色后的樣品置于載玻片上，加蓋玻片倒置，將其置于激光共聚焦顯微鏡(SP8，LEICA，Germany)下觀察。WGA-AF 488激發(fā)藍(lán)光波長為488nm，發(fā)射光波長為500?520]1111;?1'0卩丨(1;[11111丨(10(1丨(16激發(fā)綠光波長為56111111，發(fā)射光波長為590?640111]1。
[0026]結(jié)果如圖1所示4，8，(:(1^找6)，0(明場)顯示的是被了?1^菌絲侵染的小麥成熟期根部;E，F(xiàn)，G(Merge)，H(明場)顯示的是被TFL菌絲侵染的小麥成熟期莖桿部；I，J，K(Merge)，L(明場)顯示的是被TFL菌絲侵染的小麥成熟期葉片部。
[0027]從圖中可以觀察到綠色的小麥光腥黑粉菌菌絲和紅色的小麥組織，由此表明，采用本發(fā)明方法觀察小麥光腥黑粉菌侵染的植物組織，具有染色清晰、對比度強的優(yōu)點，能夠清楚地判斷小麥光腥黑粉菌的侵染程度。
【主權(quán)項】
1.小麥光腥黑粉菌的激光共聚焦顯微鏡檢方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)樣品染色:將待測樣品用染色液I染色10-30分鐘，然后用1yg/mLWGA-AF 488染色10-30分鐘，最后用pH 7.4的10 X PBS沖洗3-5次； 所染色液I為5yg/mL Propidiumidodide與0.02%Tween 20以體積比1:1混合而成； (2)鏡檢:將染色后的樣品置于激光共聚焦顯微鏡下觀察，采用的參數(shù)如下: Propidiumidodide激發(fā)綠光波長為561nm，發(fā)射光波長為590?640nm;WGA_AF 488激發(fā)藍(lán)光波長為488nm，發(fā)射光波長為500?520nm， 如果顯微鏡下出現(xiàn)綠色的菌絲，說明待測樣品含有小麥光腥黑粉菌。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述待測樣品為取自小麥成熟期根部、莖桿部或葉片部的組織。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，樣品染色之前采用乙醇固定。
【專利摘要】本發(fā)明屬于植物病害研究技術(shù)，特別是涉及小麥光腥黑粉菌的激光共聚焦顯微鏡檢方法。小麥光腥黑粉菌的激光共聚焦顯微鏡檢方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)樣品染色：將待測樣品先后用Propidium？idodide和WGA-AF？488染色，然后用PBS沖洗；(2)鏡檢：將染色后的樣品置于激光共聚焦顯微鏡下觀察；如果顯微鏡下出現(xiàn)綠色的菌絲，說明待測樣品含有小麥光腥黑粉菌。本發(fā)明的方法能夠簡明地判斷用于研究的小麥?zhǔn)欠癯晒臃N小麥光腥黑粉菌。
【IPC分類】G01N1/30, G01N21/63
【公開號】CN105548091
【申請?zhí)枴緾N201510909600
【發(fā)明人】高利, 沈慧敏, 蔚慧欣, 李超, 陳萬權(quán), 劉太國, 劉博
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所
【公開日】2016年5月4日
【申請日】2015年12月10日