一種用于指導(dǎo)腫瘤靶向藥用藥的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及多重免疫檢測領(lǐng)域，具體地說是一種用于指導(dǎo)腫瘤靶向藥用藥的試劑 盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 在過去的20年，靶向藥逐漸成為腫瘤治療中的支柱。體外與動(dòng)物體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)顯示， 這些針對(duì)靶點(diǎn)的靶向藥可以引起細(xì)胞的凋亡，并通過補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（complement-mediated cytotoxicity ，CMC) 以及抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)殺死革El細(xì)胞。與傳統(tǒng)化療藥物相比，革El向藥可以高選擇性殺 傷腫瘤細(xì)胞而減少對(duì)正常組織的損傷，具有低毒、高效的特點(diǎn)，并且可能從根本上抑制或消 滅腫瘤細(xì)胞。
[0003] -般而言，一個(gè)腫瘤細(xì)胞表面通常有多個(gè)可用的靶點(diǎn)，針對(duì)不同的靶點(diǎn)也會(huì)有不 同的靶向藥。以乳腺癌為例，目前已有的靶向藥所利用的靶點(diǎn)就有HER2、EGFR、mT0R等。比如 用于治療乳腺癌的曲妥珠單抗(Trastuzumab)藥物，就是針對(duì)祀點(diǎn)HER2的革E1向藥。目前已有 多種靶向藥被FDA批準(zhǔn)用于臨床治療。
[0004] 然而，由于不同患者間的腫瘤細(xì)胞存在個(gè)體差異，腫瘤細(xì)胞的靶點(diǎn)蛋白的表達(dá)也 存在差異性，這使得同一種靶向藥對(duì)于不同的患者而言治療效果存在較大差異。因此，篩選 出合適的用藥靶點(diǎn)，對(duì)于靶向藥用藥具有重要的指導(dǎo)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的主要目的是針對(duì)上述【背景技術(shù)】存在的不足提供一種用于指導(dǎo)腫瘤靶向 藥用藥的試劑盒，該試劑盒通過對(duì)腫瘤細(xì)胞表明靶點(diǎn)抗原表達(dá)量的檢測，篩選出合適的用 藥靶點(diǎn)，對(duì)腫瘤靶向藥提供用藥指導(dǎo)。
[0006] 本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種用于指導(dǎo)腫瘤靶向藥用藥的試劑盒，其 特征在于:它包括：
[0007] 所述腫瘤靶向藥作用靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的抗體與寡核苷酸偶聯(lián)得到的抗體-寡核苷酸探 針；
[0008] 用于將抗體-寡核苷酸探針進(jìn)行PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增引物及緩沖液；
[0009] 還包括熒光探針。
[0010]進(jìn)一步的，所述抗體-寡核苷酸探針包括寡核苷酸探針部分和抗體部分;所述寡核 苷酸探針部分是將寡核苷酸的5 '端進(jìn)行醛基修飾后得到的，所述抗體部分是將抗體進(jìn)行肼 基修飾后得到的；所述寡核苷酸探針部分和所述抗體部分經(jīng)過偶聯(lián)得到所述抗體-寡核苷 酸探針。
[0011]更進(jìn)一步的，所述寡核苷酸探針部分是將5 '端帶有氨基修飾的寡核苷酸，用摩爾 當(dāng)量為5-20倍的SFB進(jìn)行醛基修飾后得到的;所述抗體部分是將抗體用摩爾當(dāng)量為10-50倍 的SANH進(jìn)行肼基修飾后得到的。
[0012] 其中，上述的SFB是指4-甲酰苯甲酸N-琥珀酰亞胺酯；上述的SANH是指4-(N-馬來 酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯。
[0013] 所述抗體-寡核苷酸探針是將摩爾比為（7-10):1的寡核苷酸探針部分和抗體部 分，在室溫條件下反應(yīng)4-24小時(shí)后得到的。
[0014]優(yōu)選的，所述寡核苷酸的長度為16-22nt，5'端為6-14nt長度的引物識(shí)別序列，3' 端用延伸引物進(jìn)行延伸擴(kuò)展。
[0015]進(jìn)一步的，所述延伸引物的長度為50-80nt，它的3'端末端與寡核苷酸的3'端互補(bǔ) 配對(duì)，5'端可以形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，且中間序列與熒光探針的序列互補(bǔ)。延伸引物的序列優(yōu)選為 SEQ ID N0:14所示。
[0016]優(yōu)選的，所述寡核苷酸的序列為SEQ ID NO: 1-13中所示的任一個(gè)。
[0017]所述擴(kuò)增引物中包括一對(duì)用于將抗體-寡核苷酸探針進(jìn)行PCR擴(kuò)增的正向、反向引 物，所述正向引物的5 '端與寡核苷酸互補(bǔ)。
[0018] 優(yōu)選的，所述靶點(diǎn)包括HER2、EGFR、VEGFR-2、BRAF、PD-1 /PD-L1中的一種或多種。
[0019]更優(yōu)選的，所述腫瘤靶向藥為單克隆抗體藥和/或小分子抑制劑。
[0020]發(fā)明原理
[0021]目前已有多種針對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向藥被Π )Α批準(zhǔn)用于臨床治療，包括但不限于如 表1所示。
[0022]表1部分腫瘤靶向藥及其靶點(diǎn) I" λλοο?
[0024] 本發(fā)明具有如下有益效果：
[0025] 1.本發(fā)明所述的試劑盒通過將腫瘤細(xì)胞表面靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的抗體與寡核苷酸偶聯(lián)后 作為探針，可以通過PCR檢測出該靶點(diǎn)抗原的表達(dá)量，從而篩選出更合適的靶點(diǎn)，指導(dǎo)靶向 抗體藥的用藥。
[0026] 2.本發(fā)明通過偶聯(lián)醛基和肼基得到抗體-寡核苷酸的方式，可以制備得到多于一 種抗體分別各自與寡核苷酸偶聯(lián)的多種探針，每種抗體-寡核苷酸探針的寡核苷酸都不相 同。從而可以通過寡核苷酸的PCR擴(kuò)增，來實(shí)現(xiàn)多重檢測，平行檢測各抗體分別對(duì)應(yīng)的抗原 含量。適用于對(duì)同一腫瘤細(xì)胞上多個(gè)靶點(diǎn)一次性篩選，效率更高。
[0027] 3.本發(fā)明先將不同的寡核苷酸與不同的抗體各自獨(dú)立的進(jìn)行定向修飾得到寡核 苷酸探針部分和抗體部分，從而可以避免抗體內(nèi)部發(fā)生交聯(lián)，使寡核苷酸探針部分和抗體 部分的偶聯(lián)具有高度特異性，得到的腙鍵偶聯(lián)物穩(wěn)定性好。而且定向修飾及偶聯(lián)的反應(yīng)條 件溫和，不需另外使用還原劑，抗體不易變性和失活。
[0028] 4.用延伸引物對(duì)寡核苷酸的3 '端擴(kuò)增，可以保證寡核苷酸鏈過短時(shí)的PCR擴(kuò)增要 求，并且延伸引物5'端的發(fā)卡結(jié)構(gòu)可以增加堿基的堆砌力，從而增強(qiáng)探針敏感性，使通用型 抗體-寡核苷酸探針檢測更加靈敏。
[0029] 5.由于寡核苷酸與延伸引物是在3'端互補(bǔ)配對(duì)的，因此延伸擴(kuò)展的過程在PCR擴(kuò) 增過程中可自行反應(yīng)，延伸擴(kuò)展之后再以延伸后的抗體-寡核苷酸為模板進(jìn)行擴(kuò)增，一步反 應(yīng)即可，反應(yīng)效率高。
[0030] 6.由于采用了PCR擴(kuò)增的方式，比傳統(tǒng)ELISA方法檢測的敏感度提高了幾個(gè)數(shù)量 級(jí)，即使待檢測抗原濃度很低，也可以對(duì)微量抗原進(jìn)行檢測。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 以下通過具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明：下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn) 方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。
[0032] 本發(fā)明要得到抗體-寡核苷酸探針，其是通過先將寡核苷酸與抗體分別進(jìn)行醛基 和肼基的定向修飾得到寡核苷酸部分和抗體部分，再進(jìn)行腙鍵偶聯(lián)得到。優(yōu)選的，所述寡核 苷酸探針部分是將5'端帶有氨基修飾的寡核苷酸，用摩爾當(dāng)量為5-20倍的SFB進(jìn)行醛基修 飾后得到的，優(yōu)選摩爾當(dāng)量為10倍;所述抗體部分是將抗體用摩爾當(dāng)量為10-50倍的SANH進(jìn) 行肼基修飾后得到的，優(yōu)選摩爾當(dāng)量為25倍。其中，SFB為4-甲酰苯甲酸N-琥珀酰亞胺酯， SANH為4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯。用SFB修飾寡核苷酸的5'端 上的氨基可以得到醛基活化的寡核苷酸，用SANH修飾抗體可以得到肼基活化的抗體蛋白。 這兩個(gè)反應(yīng)為公開技術(shù)可以得到的，如中國文獻(xiàn)"基于核酸分子雜交的免疫芯片抗體固定 新方法"，《分析化學(xué)》，2013年第2期，沙莎等公開的。反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度等條件可根據(jù)文獻(xiàn) 內(nèi)容做出本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的調(diào)整。本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案為:將5'端帶有氨基修飾的 寡核苷酸用pH值為7.4的PBS緩沖液溶解，然后與摩爾當(dāng)量為寡核苷酸10倍的SFB溶液混合， 室溫反應(yīng)2.5小時(shí)，再純化得到醛基修飾的寡核苷酸探針部分。將抗體用pH值為7.4的roS緩 沖液稀釋后，與摩爾當(dāng)量為抗體25倍的SANH溶液混合，室溫反應(yīng)2.5小時(shí)，再純化得到肼基 修飾的抗體部分。最后將摩爾比為(7-10): 1的寡核苷酸探針部分和抗體部分在室溫下偶聯(lián) 反應(yīng)得到所述抗體-寡核苷酸探針。
[0033] 以下通過實(shí)施例1來進(jìn)行進(jìn)一步說明，其余未說明的具體條件及實(shí)驗(yàn)方法，按照常 規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。
[0034] 本實(shí)施例中所述的"室溫"是指常規(guī)的室內(nèi)溫度，一般為15-30 °C。
[0035] 本實(shí)施例將序列為SEQ ID ^):(1-13)的01丨8〇簡寫為01丨8〇(1-13)，01丨8〇為寡核 苷酸。
[0036]本實(shí)施例中的PBS緩沖液為磷酸緩沖液，MES緩沖液為2-(N-嗎啉代）乙磺酸緩沖 液。
[0037]本實(shí)施例中的QPCR為實(shí)時(shí)熒光定量PCR。
[0038] 本實(shí)施例中的Nanodrop為分光光度計(jì)。
[0039] 本實(shí)施例中的BCA法是指蛋白質(zhì)濃度測定的定量方法。
[0040] 本實(shí)施例所用的緩沖液為:配置不同pH值的roS緩沖液，在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】 中，具體包括pH值為6.0的PBS