緩沖液，以及pH值為7.4的PBS緩沖液，并且配置pH值為5.0的 MES緩沖液，過濾除菌處理，4 °C存放。
[0041 ]實(shí)施例1 HER2-寡核苷酸探針 [0042] (1)寡核苷酸探針的醛基修飾
[0043] 將150腦〇1的01丨8〇1(寡核苷酸）用0.謂的？!17.4的磷酸緩沖液配置成溶液。稱取 1500nmo 1的SFB(4-甲酰苯甲酸N-琥珀酰亞胺酯），用無水DMF(N，N-二甲基甲酰胺)溶解后， 在室溫反應(yīng)2.5h，過柱純化得到01ig〇-FB(醛基修飾的寡核苷酸）。
[0044] 檢測Oligo-FB的濃度：用Nanodrop分光光度計(jì)檢測A26Q的值，計(jì)算Oligo-FB的濃度 為2 · 6nmol/iiL〇
[0045]檢測醛基修飾率：用定量的2-肼吡啶-2-鹽酸鹽溶液檢測醛基修飾率。取上述 Oligo-FB加入到2-肼吡啶-2-鹽酸鹽溶液中，振蕩混勻后于37°C反應(yīng)lh，用Nanodrop檢測 360nm處的吸光值為6 · 3，計(jì)算其修飾率，A36Q下的修飾率為0 · 99。
[0046] (2)抗體HER2的肼基修飾
[0047] 對抗體HER2進(jìn)行脫鹽純化后用Nanodrop檢測抗體蛋白濃度為4.8mg/mL。
[0048]用pH值為7.4的磷酸緩沖液稀釋抗體HER2至濃度為3mg/mL。稱取30倍量的SANH(抗 體與SANH的摩爾比為1:30)，溶解在無水DMF中，再加入到抗體中，使抗體與SANH的摩爾比為 1:30，在室溫反應(yīng)2.5h，過柱純化得到HER2-SANH(肼基修飾的HER2)。
[0049] 檢測HER2-SANH的濃度:通過BCA法計(jì)算修飾后的HER2-SANH的濃度為2.5mg/mL。 [0050]檢測肼基修飾率：用定量的2-甲酰苯磺酰鈉鹽溶液檢測肼基修飾率。取純化后的 抗體-SANH加入到的2-甲酰苯磺酰鈉鹽溶液中，渦旋混勻后于37°C反應(yīng)lh，Nanodrop檢測 348nm處的吸光值為0.26。通過348nm處的吸光值和HER2-SANH的濃度計(jì)算出HER2-SANH的肼 基修飾率為6.8。
[0051 ] (3)01ig〇-FB 與 HER2-SANH 的偶聯(lián)
[0052] 將01ig〇-FB與HER2-SANH按照摩爾比7:1混合渦旋混勻，室溫反應(yīng)4h，最后得到的 產(chǎn)物經(jīng)過過柱純化后即可得到所述通用型HER2-01 igo探針。
[0053] 取HER2-01 i go探針進(jìn)行Nanodrop檢測。在354nm下有明顯吸收峰出現(xiàn)，說明01 igo-FB與HER2-SANH的偶聯(lián)成功。
[0054] 取HER2-01igo探針進(jìn)行SDS-PAGE檢測，分析HER2與oligo偶聯(lián)程度，跟純的HER2比 較，得到多條電泳條帶，說明HER2上偶聯(lián)了不同數(shù)量的寡核苷酸。
[0055]取HER2-01igo探針進(jìn)行BCA法濃度檢測。BCA法濃度檢測計(jì)算偶聯(lián)物抗體的濃度。 用單鏈定量試劑盒定量HER2_01igo中Oligol的濃度?？梢杂?jì)算出HER2與Oligol的比例，并 可以和修飾率結(jié)果比較。說明了 HER2-01 i go分子中01 i go 1與抗體的偶聯(lián)比，結(jié)果如表2所 不。
[0056] 表2冊1?2-01丨8〇分子中01丨8〇與抗體的偶聯(lián)比 [0057]
[0058]實(shí)施例201 igo分子的QPCR擴(kuò)增特異性檢測
[0059] 將01ig〇l-13分子稀釋至濃度為25000分子數(shù)AxL、83333分子數(shù)/VL和250000分子 數(shù)AiL三個(gè)濃度。然后以01ig〇l-3為例，將01ig〇l-3在相同濃度下混合，得到混合樣品A、B、 C，如表3所示。
[0060] 表3實(shí)施例2樣品配方
[0061]
[0063]將上述樣品按照表4配置QPCR擴(kuò)增液，得到QPCR擴(kuò)增試劑盒，然后按照表5所示的 程序?qū)?1ig〇l-3進(jìn)行QPCR擴(kuò)增，以及對混合樣品A、B、C中的Oligol-3各自進(jìn)行QPCR擴(kuò)增，以 各自延伸擴(kuò)展后的01ig〇l-3為模板，擴(kuò)增結(jié)果的Ct值如表6所示。其中，延伸引物為RT-P，它 的3'端末端與寡核苷酸的3'端互補(bǔ)配對，5'端可以形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，且中間序列與MGB探針 (MGty)的序列互補(bǔ)即可，本實(shí)施例的RT-P以序列為SEQ ID勵(lì)：14所示為例。正向引物為卩卩， 反向序列為RP。FP以序列為SEQIDN0:15所示為例，RP以序列為SEQIDN0 :16所示為例， MGty以序列為SEQ ID從)：17所示為例，5'端的熒光基團(tuán)用?41標(biāo)記，3'端為10。
[0064] 表401 igo分子的QPCR擴(kuò)增試劑盒
[0065]
[0066] 表5QPCR擴(kuò)增程序
[0067]
[0068]
[0069] 表6擴(kuò)增結(jié)果Ct值
[0070]
[0071] 從表6可以看出，混合樣品A、B、C中的Oligol-3,在相同濃度下擴(kuò)增的Ct值與單個(gè) Oligo的擴(kuò)增Ct值相差為0.1左右。同時(shí)，根據(jù)每條Oligo的不同濃度樣品繪出回歸直線，可 以算得回歸直線方程及相關(guān)系數(shù)R2如下：
[0072 ] 01ig〇1:y = -3.3664x+40.11，R2 = 0.99937;
[0073] 01ig〇2：y = -3.384x+40.809,R2 = 0.99997；
[0074] 01ig〇3:y = -3·3824x+38·928，R2 = 0·99463。
[0075] 將每條Oligo對應(yīng)的A-C號樣品根據(jù)各個(gè)方程進(jìn)行計(jì)算，算得分子數(shù)除以對應(yīng)理論 分子數(shù)，所得檢測效率如下：
[0076]
LUU//」 兇此，干仃秤品|日Η廠増(Jt差值為? · 1ΖΞ石，粒測雙卒為98 · 5 % -110 · 5 % H日」，說_ 三條Oligo分別與其余兩條沒有非特異性擴(kuò)增，相互之間不會影響擴(kuò)增效率。其余Oligo經(jīng) 鑒定可以得到同樣結(jié)果，說明本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的多條Oligo之間無交叉影響，可以保證多重PCR 的特異性、精確性和靈敏度。其他Oligo可以得到同樣的結(jié)論，由于篇幅原因不一一詳細(xì)說 明。
[0078] 實(shí)施例3制作標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0079]以01ig〇l-13可以得到同樣的結(jié)果，為了簡化過程，以下實(shí)施例以O(shè)ligol-4為例。 [0080] 按照實(shí)施例1的步驟，用摩爾當(dāng)量為5倍的SFB對01igo2進(jìn)行修飾得到01ig〇-FB，用 摩爾當(dāng)量為10倍的SANH對EGFR進(jìn)行肼基修飾得到EGFR-SANH，將摩爾比為10:1的01ig〇-FB 與EGFR-SANH在室溫條件下反應(yīng)16小時(shí)后得到EGFR-01 igo2。
[0081 ] 按照實(shí)施例1的步驟，用摩爾當(dāng)量為20倍的SFB對01igo3進(jìn)行修飾得到01ig〇-FB， 用摩爾當(dāng)量為50倍的SANH對PD-L1進(jìn)行肼基修飾得到H)-L1-SANH，將摩爾比為8:1的Oligo-FB與H)-L1-SANH在室溫條件下反應(yīng)24小時(shí)后得到PD-Ll-01igo3。
[0082] 按照實(shí)施例1的步驟，用摩爾當(dāng)量為10倍的SFB對01igo4進(jìn)行修飾得到01ig〇-FB， 用摩爾當(dāng)量為30倍的SANH對VEGFR-2進(jìn)行肼基修飾得到VEGFR-2-SANH，將摩爾比為7 :1的 01ig〇-FB與VEGFR-2-SANH在室溫條件下反應(yīng)16小時(shí)后得到VEGFR-2-01igo4。
[0083] 將 HER2-01igol、EGFR-01igo2、PD-Ll-01igo3和VEGFR-2-01igo4按照表4的配方和 表5的程序進(jìn)行QPCR擴(kuò)增，以延伸擴(kuò)展后的Oligol-4為模板，得到的擴(kuò)增結(jié)果與Oligol-4單 獨(dú)擴(kuò)增一致，說明偶聯(lián)的抗體部分對01 igo的PCR擴(kuò)增沒有影響。
[0084] 用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液將 HER2-01igol、EGFR-01igo2、ro-Ll-01igo3和VEGFR-2-01igo4 各自稀釋成濃度為：833、2500、8333、25000、83333和250000分子數(shù)/2.5yL，共六個(gè)濃度，空 白對照組為去離子水。
[0085] 按照表4所示的配方配置QPCR擴(kuò)增試劑盒，然后按照表5所示的程序?qū)σ陨细鳚舛?的 HER2-01igol、EGFR-01igo2、PD-Ll-01igo3 和 VEGFR-2-01igo4 進(jìn)行 QPCR 擴(kuò)增，以延伸擴(kuò)展 后的Oligol-4為模板，擴(kuò)增結(jié)果如表7所示：
[0086] 表7標(biāo)準(zhǔn)曲線QPCR擴(kuò)增結(jié)果Ct值