一種利拉魯肽中游離棕櫚酸的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及藥物合成技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種利拉魯膚中游離棟桐酸的檢測方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 利拉魯膚，是一種長效治療2型糖尿病的膜高血糖素樣膚1 (GLP-I)類似物。GLP-I 是人體內(nèi)存在的一種生理性多膚，它能夠根據(jù)體內(nèi)葡萄糖水平的高低，按需促進(jìn)膜島P細(xì) 胞分泌膜島素，抑制膜島素括抗激素膜高血糖素的分泌，從而發(fā)揮降糖作用。然而，人體 產(chǎn)生的GLP-I很不穩(wěn)定，很快就會被體內(nèi)的二膚基膚酶IV值PP-IV)降解，因此若使用天然 GLP-I降低血糖，需持續(xù)靜脈輸注或持續(xù)皮下注射。
[0003] 利拉魯膚是一種GLP-I類似物，與人GLP-I具有97 %的序列同源性，人GLP-I可 W結(jié)合并激活GLP-I受體。GLP-I受體為天然GLP-I的祀點，GLP-I是一種內(nèi)源性腸促膜島 素激素，能夠促進(jìn)膜腺P細(xì)胞葡萄糖濃度依賴性地分泌膜島素。與天然GLP-I不同的是， 利拉魯膚在人體中的藥代動力學(xué)和藥效動力學(xué)特點均適合每天一次的給藥方案。皮下注射 給藥后，其作用時間延長的機理包括了使吸收減慢的自聯(lián)作用，與白蛋白的結(jié)合W及對二 膚基膚酶IV值PP-IV)和中性內(nèi)膚酶（肥巧具有更高的酶穩(wěn)定性，從而具有較長的血漿半衰 期。利拉魯膚的活性由其與GLP-I受體間特定的相互作用介導(dǎo)，導(dǎo)致環(huán)憐酸腺巧（CAM巧的 增加。利拉魯膚能夠W葡萄糖濃度依賴的模式刺激膜島素的分泌，同時W葡萄糖濃度依賴 的模式降低過高的膜高糖素的分泌。因此，當(dāng)血糖升高時，膜島素分泌受到刺激，同時膜高 糖素分泌受到抑制。
[0004] 化學(xué)合成的利拉魯膚為31膚，分子式為Ci72H265N43〇51，分子量為3751. 2。外觀為白 色至類白色粉末或疏松塊狀物，有引濕性，幾乎不溶于水，溶于0.1mol/L氨氧化鋼溶液，其 結(jié)構(gòu)式如附圖1所示。
[0005] 利拉魯膚結(jié)構(gòu)中的棟桐酸側(cè)鏈，是在合成工藝的下游被酷化上去的，其對于利拉 魯膚的物理化學(xué)性質(zhì)具有重要的影響。同時，其對治療2型糖尿病的長效特性也有重要的 影響。因此，對利拉魯膚中游離棟桐酸進(jìn)行質(zhì)量控制非常重要。由于棟桐酸在紫外光下沒 有明顯的吸收，所W選擇一種適當(dāng)?shù)臋z測器在利拉魯膚的生產(chǎn)中就具有非常重要的現(xiàn)實意 義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述缺陷，提供了一種利拉魯膚中游離棟桐酸的檢 測方法，該方法在對利拉魯膚中的游離脂肪酸進(jìn)行高效液相色譜分析過程中，采用電噴霧 檢測器進(jìn)行檢測。
[0007] 在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，高效液相色譜采用如下的色譜條件：色譜柱為C18 柱（100mm*4. 6mm，3um)，流動相為含有40~60m mol/L甲酸溶液的乙臘和甲醇的混合溶液， 乙臘和甲醇的體積比為65:35~85:15;流速為0.5~1.〇1111/111111;柱溫為25~35°(：;進(jìn)樣 量為IOul ;洗脫方式為等梯度洗脫。
[0008] 在本發(fā)明更加優(yōu)選的實施方案中，高效液相色譜采用如下的色譜條件：色譜柱為 YMC-Triart C18柱（100mm*4. 6mm，3um)，流動相為含有50mmol/L甲酸溶液的乙臘和甲醇 的混合溶液，乙臘和甲醇的體積比為80 :20 ;流速為0. 75ml/min ;柱溫為30°C ;進(jìn)樣量為 IOul ;洗脫方式為等梯度洗脫。
[0009] 在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，電噴霧檢測器的載氣為氮氣，壓力為35psi，范圍為 IOOpAo
[0010] 在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，利拉魯膚溶液經(jīng)0. 2 ym的濾膜過濾。
[0011] 由本發(fā)明的描述可知，與現(xiàn)有的檢測方法相比，本發(fā)明在對利拉魯膚中的游離脂 肪酸進(jìn)行高效液相色譜分析過程中，采用電噴霧檢測器進(jìn)行檢測，具有專屬性好（檢測無 干擾）、靈敏度高（檢測限為2. 05ng)、穩(wěn)定性高（精密度高）、方法可靠（回收率大于90 % ) 等優(yōu)點，非常適合于對利拉魯膚中游離棟桐酸的準(zhǔn)確測量。
【附圖說明】
[0012] 圖1 :利拉魯膚的結(jié)構(gòu)式示意圖。 陽01引圖2 :空白溶液的色譜圖。
[0014] 圖3對照品溶液（系統(tǒng)適用性溶液）的色譜圖。
[0015] 圖4 :供試品溶液的色譜圖。
[0016] 圖5 :供試品加標(biāo)溶液的色譜圖。
[0017] 圖6 :定量限溶液的色譜圖。 陽01引圖7 :檢測限溶液的色譜圖。
[0019] 圖8 :棟桐酸在3. 07~25. 60ug/ml的濃度范圍內(nèi)峰面積與濃度的線性關(guān)系圖。
[0020] 圖9 :供試品加標(biāo)50%水平溶液的色譜圖。
[0021] 圖10 :供試品加標(biāo)100%水平溶液的色譜圖。
[0022] 圖11 :供試品加標(biāo)150%水平溶液的色譜圖。
【具體實施方式】
[0023] 下面通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，旨在用于說明本發(fā)明而非限定本 發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可W對本發(fā) 明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，運些改進(jìn)和修飾也同樣落入本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0024] 實施例1 :本發(fā)明的實驗儀器與色譜條件 陽0巧]1、實驗儀器
[0026] (1)叫tiMate 3000高效液相色譜儀燈hermo);
[0027] (2) Corona叫付〇 RS電噴霧檢測器燈hermo)。
[0028] 2、色譜條件
[0029] (1)色譜柱 JMC-Triad C18 柱（100mm*4. 6mm，3um);
[0030] 似流動相：乙臘：甲醇（體積比為80:20)含有50m mol/L的甲酸溶液；
[0031] (3)流速：0. 75ml/min ; 陽的2] (4)柱溫：30°C ; 陽03；3] 妨進(jìn)樣量：IOul ;
[0034] (6)檢測器：電噴霧檢測器（CAD);載氣：氮氣；壓力：35psi ;范圍：100pA ;
[0035] (7)洗脫方式：等梯度洗脫。
[0036] 3、實驗試劑
[0037] (1)乙臘出PLC 級，Merck 公司；
[0038] 似甲醇出PLC級，Merck公司；
[0039] (3)甲酸：LCMS 級，Anaqua 公司； W40] (4)棟桐酸：RS級，Sigma公司；
[OOW 妨利拉魯膚：本公司自制。
[0042] 實施例2 :系統(tǒng)適用性實驗 陽0創(chuàng)一、實驗步驟 W44] 1、溶液配制 W45] (1)對照儲備液的配制
[0046] 取棟桐酸約25mg，精密稱定，置于250ml容量瓶中，加乙臘溶解并定容，搖勻即得。
[0047] 似對照品溶液的配制 W48] 精密量取棟桐酸對照儲備液5. Oml，置于50ml容量瓶中，加乙臘稀釋并定容，搖勻 即得。 W例 做空白溶液
[0050] 采用乙臘作為空白溶液。
[0051] (4)系統(tǒng)適用性溶液
[0052] 采用對照品溶液作為系統(tǒng)適用性溶液。
[0053] 2、上機測定
[0054] 分別精密量取空白溶液、系統(tǒng)適用性溶液W及系統(tǒng)復(fù)核溶液（即系統(tǒng)適用性溶 液，是指在完成系統(tǒng)適用性試驗之后，再進(jìn)行一針系統(tǒng)適用性溶液作為系統(tǒng)復(fù)核溶液，W進(jìn) 行系統(tǒng)復(fù)核）各lOul，按如下方式進(jìn)樣測試： 陽化5] 空白溶液------------------------------------------------1針（色譜圖參 見附圖2)
[0056] 系統(tǒng)適用性溶液---------------------------------------6針（色譜圖參見 附圖3)
[0057] 系統(tǒng)復(fù)核溶液-------------------------------------------1針 陽05引二、檢測結(jié)果
[0059] 具體檢測結(jié)果如表1所示。
[0060] 表1系統(tǒng)適用性實驗結(jié)果
[0061]
[0062]
[0063] 由W上檢測結(jié)果可W看出，理論塔板數(shù)按棟桐酸計為17078(不低于10000);拖尾 因子為1. 23(不大于1. 5);主峰連續(xù)6針的面積的RSD為1. 75% (不大于2. 0% )，7針的 面積（加上用于系統(tǒng)復(fù)核的一針對照品1的面積）的RSD為1. 84% (不大于2. 0% ) ;6針 各離子的保留時間的RSD為0. 14% (不大于0. 5% )，7針的保留時間（加上用于系統(tǒng)復(fù)核 的一針對照品1的保留時間）的RSD為0. 01% (不大于0. 5% )。說明本發(fā)明檢測方法的 系統(tǒng)適用性良好，方法穩(wěn)定性好。 W64] 實施例3 :專屬性實驗 W65] -、實驗步驟
[0066] 1、溶液配制
[0067] (1)對照儲備液的配制
[0068] 取棟桐酸約25mg，精密稱定，置于250ml容量瓶中，加乙臘溶解并定容，搖勻即得。 W例 似對照品溶液的配制 陽070] 精密量取棟桐酸對照儲備液5. Oml，置于50ml容量瓶中，加乙臘稀釋并定容，搖勻 即得。
[0071] (3)供試品溶液的配制 陽07引取利拉魯膚適量約20mg，精密稱定，置于IOml容量瓶中，加乙臘溶解并定容，用 〇.2ym濾膜過濾即得。
[0073] (4)供試品加標(biāo)溶液
[0074] 取利拉魯膚適量約20mg，精密稱定，置于IOml容量瓶中，加入對照品溶液溶解并 定容，用0. 2 Ji m濾膜過濾即得。 陽0巧]巧）空白溶'液
[0076] 采用乙臘作為空白溶液。
[0077] 2、上機測定
[0078] 分別精密量取空白溶液、對照品溶液、供試品溶液W及供試品加標(biāo)溶液各lOul，按 如下方式進(jìn)樣測試： 陽0巧]空白溶液-----------------------------------------------1針（色譜圖參 見附圖2)
[0080] 對照品溶液--------------------------------------------1針（色譜圖參見 附圖3)
[0081] 供試品溶液--------------------------------------------1針（色譜圖參見 附圖4)
[0082] 供試品加標(biāo)溶液--------------------------------------1針（色譜圖參見附 圖5) 陽〇8引二、檢測結(jié)果
[0084] 具體檢測結(jié)果如表2所示。 陽0化]表2專屬性實驗結(jié)果 [0086]
[0087] 口 丄T化巧川巧術(shù)叫但口，工口伯 A義1工1巧賊口口伯 A義/THWJ批口口伯 A義下