一種基于原位衍生測(cè)定多種神經(jīng)遞質(zhì)的檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種基于原位衍生測(cè)定多種神經(jīng)遞質(zhì)的檢測(cè)方法。該檢測(cè)方法首次以4’?碳酰氯?羅丹明為衍生試劑，使用超聲輔助?原位衍生?分散液液微萃取技術(shù)對(duì)氨基酸類(lèi)和單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)進(jìn)行衍生化，并利用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式的超高效液相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行定性定量檢測(cè)。采用三種內(nèi)標(biāo)物（異丙腎上腺素，5?羥吲哚?2?羧酸，正亮氨酸）用于三類(lèi)化學(xué)結(jié)構(gòu)的神經(jīng)遞質(zhì)線(xiàn)性方程建立。通過(guò)內(nèi)標(biāo)法定量，準(zhǔn)確測(cè)定神經(jīng)遞質(zhì)的存在。本發(fā)明具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、選擇性好，且回收率結(jié)果良好等優(yōu)勢(shì)，能快速、準(zhǔn)確測(cè)定神經(jīng)遞質(zhì)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種基于原位衍生測(cè)定多種神經(jīng)遞質(zhì)的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于原位衍生測(cè)定多種神經(jīng)遞質(zhì)的 檢測(cè)方法，尤其是涉及一種利用4'-碳酰氯-羅丹明作為衍生試劑，超聲輔助-原位衍生-分 散液液微萃取聯(lián)合超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜同時(shí)檢測(cè)多種神經(jīng)遞質(zhì)的分析方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 神經(jīng)遞質(zhì)(neurotransmitter)在突觸傳遞中是擔(dān)當(dāng)"信使"的特定化學(xué)物質(zhì)。神經(jīng) 遞質(zhì)分子極性強(qiáng)、缺乏能夠靈敏檢測(cè)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，并且在腦微透析液中和尿液中的含量低、 基質(zhì)干擾嚴(yán)重。采用傳統(tǒng)的紫外-可見(jiàn)光譜法、色譜法及質(zhì)譜法檢測(cè)的靈敏度都很低，難以 準(zhǔn)確定量。化學(xué)衍生手段是提高色譜-質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度的一個(gè)很好的解決辦法。衍生化技術(shù) 能夠有效的提高檢測(cè)靈敏度，現(xiàn)有技術(shù)中，對(duì)于神經(jīng)遞質(zhì)的檢測(cè)分析多采用鄰苯二甲醛 (0ΡΑ)或者苯甲酰氯為衍生試劑，但鄰苯二甲醛衍生物不穩(wěn)定、重復(fù)性較差、衍生過(guò)程時(shí)間 長(zhǎng)等缺點(diǎn)，一定程度上限制了它的廣泛使用；苯甲酰氯易水解，且對(duì)皮膚、眼睛和呼吸道具 有刺激作用;且采用鄰苯二甲醛(0ΡΑ)或者苯甲酰氯進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，無(wú)法同時(shí)檢測(cè)出氨基酸類(lèi) 和單胺類(lèi)的神經(jīng)遞質(zhì)，耗時(shí)長(zhǎng)，步驟繁瑣。因此，開(kāi)發(fā)一種衍生反應(yīng)條件溫和、簡(jiǎn)單、高效、靈 敏度高且能多成分同時(shí)檢測(cè)的分析方法成為了亟待解決的問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，靈敏度低，基質(zhì)干擾嚴(yán)重，不能同時(shí)測(cè)定多種成 分，污染嚴(yán)重等問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種基于原位衍生測(cè)定多種神經(jīng)遞質(zhì)的分析方法，本發(fā) 明利用超聲輔助-原位衍生-分散液液微萃取的樣品前處理技術(shù)，聯(lián)合超高效液相色譜三重 四極桿質(zhì)譜分離檢測(cè)系統(tǒng)，能夠同時(shí)測(cè)定待測(cè)樣品中多種氨基酸類(lèi)和單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)，大 大提高了質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度、選擇性和準(zhǔn)確度，且得到了良好回收率。
[0004] 本發(fā)明為了實(shí)現(xiàn)上述目的所采用的技術(shù)方案為： 本發(fā)明提供了一種基于原位衍生測(cè)定多種神經(jīng)遞質(zhì)的檢測(cè)方法，其特征在于:所述的 神經(jīng)遞質(zhì)與衍生試劑4'_碳酰氯-羅丹明發(fā)生超聲輔助-原位衍生反應(yīng)，經(jīng)超聲輔助-分散液 液微萃取富集純化，得到的衍生化產(chǎn)物經(jīng)濾膜過(guò)濾后利用超高效液相色譜三重四極桿串聯(lián) 質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行分析檢測(cè)。
[0005] 上述檢測(cè)方法具體包括以下步驟： a.超聲輔助-原位衍生-分散液液微萃取:取20-50 uL神經(jīng)遞質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液或待 測(cè)樣品，30 yL內(nèi)標(biāo)物溶液、800-1500 yL pH 8.0-10.0的NaHC03-Na2C03緩沖溶液，加入離 心管中，注入80-200 uL萃取劑和200-300 uL 4'-碳酰氯-羅丹明分散劑溶液，混合均勻后 放入超聲波振蕩器中進(jìn)行超聲輔助-原位衍生-分散液液微萃取，反應(yīng)結(jié)束后高速離心，吸 取下層有機(jī)相并用乙腈定容到200 uL，得氨基酸類(lèi)和單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)衍生化產(chǎn)物溶液； 所述內(nèi)標(biāo)物溶液是由10 μL濃度為lXl(T5m〇l/L異丙腎上腺素的乙腈溶液，10 度 為1 X 1(T5 mol/L 5-羥吲哚-2-羧酸的乙腈溶液和10汕濃度為1 X 1(T5 mol/L正亮氨酸的乙 腈溶液組成； 所述的萃取劑為1-溴-3-甲基丁烷，溴代環(huán)己烷，1-溴代辛烷，溴苯； 所述的分散劑為丙酮，乙腈，甲醇或乙醇； b.將上述氨基酸類(lèi)和單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)衍生化產(chǎn)物溶液經(jīng)濾膜過(guò)濾后，利用超高效液 相色譜三重四極桿質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行定性定量分析檢測(cè)。
[0006] 進(jìn)一步的，步驟a中所述的萃取劑最優(yōu)化的為溴苯;所述分散劑最優(yōu)化的為乙腈。
[0007] 進(jìn)一步的，步驟a中所述的4'-碳酰氯-羅丹明-分散劑溶液的摩爾濃度為IX 10-2 mol/L〇
[0008] 本發(fā)明所使用的衍生化試劑4'-碳酰氯-羅丹明采用以下方法制備而成：將0.922 g 4'-羧基-羅丹明加入30 mL氯化亞砜，滴入0.1 mL N，N-二甲基甲酰胺，磁力攪拌，升溫至 50~80°C，反應(yīng)5~6 h，減壓蒸除氯化亞砜，冷卻至室溫，得紫色固體，用乙醚重結(jié)晶，得紫 色針狀晶體即為4'-碳酰氯-羅丹明。
[0009] 進(jìn)一步的，所述步驟a中所述超聲輔助-原位衍生-分散液液微萃取為在溫度20-50 °C，超聲頻率為40 KHz條件下反應(yīng)1 -5 min。
[0010] 進(jìn)一步的，所述神經(jīng)遞質(zhì)包括氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)和單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)；所述氨基酸 類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)包括谷氨酸，γ -氨基丁酸，門(mén)冬氨酸，色氨酸，甘氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸;所述 單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)包括:左旋多巴，多巴胺，去甲腎上腺素，腎上腺素，3-甲氧酪胺，去甲變腎 上腺素，變腎上腺素，高原兒茶酸，3，4-二羥基扁桃酸，DL-3，4-二羥基苯基二醇，高香草酸， 香草扁桃酸，3-甲氧基-4-羥基苯乙二醇，羥色胺酸，5-羥色胺，5-羥吲哚乙酸，犬尿素，3-羥 基犬尿氨酸，3-羥基鄰氨基苯甲酸，犬尿酸。
[0011] 本發(fā)明所使用的超高效液相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)中色譜分離使用安捷 倫SB C18色譜柱：2.1 mm X 50 mm，1.8 μπι，進(jìn)樣體積為2 yL，柱溫30 °C，采用梯度洗脫 法。
[0012] 上述的梯度洗脫法，流速為0.2 mL/min，流動(dòng)相A為5%乙腈水溶液含有0.1%甲酸， 流動(dòng)相B為乙腈含有0.1%甲酸;色譜分離梯度條件為0 min流動(dòng)相組成為95%A+5%B，3 min時(shí) 85%A+15%B，5 min時(shí)65%A+35%B，12 min時(shí)5%A+95%B，16 min時(shí)5%A+95%B或0 min流動(dòng)相組成 為95%A+5%B，2 min時(shí)88%A+12%B，6 min時(shí)60%A+40%B，10 min時(shí)5%A+95%B，12 min時(shí)5%A+95% B;質(zhì)譜的條件為:干燥氣溫度300 °C，流速10 L/min，噴霧器氣壓40 psi，鞘氣溫度280 °C， 流速11 L/min，毛細(xì)管電壓3.5 kV。
[0013 ]本發(fā)明流動(dòng)相中各分?jǐn)?shù)均指體積分?jǐn)?shù)。
[0014]本發(fā)明所述的神經(jīng)遞質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液為將神經(jīng)遞質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品加入體積分?jǐn)?shù)為50% 的乙腈/水配制，得到濃度為5.0 X 1(T5 mol I/1的神經(jīng)遞質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液。本發(fā)明所使用的 三種內(nèi)標(biāo)物用于三類(lèi)化學(xué)結(jié)構(gòu)的神經(jīng)遞質(zhì)的線(xiàn)性方程建立:異丙腎上腺素（IP)，5-羥吲哚-2_羧酸(5-HICA)，正亮氨酸(NIe)。
[0015]本發(fā)明首次使用4'-碳酰氯-羅丹明對(duì)多種神經(jīng)遞質(zhì)分子的活性基團(tuán)進(jìn)行衍生化， 建立的超聲輔助-原位衍生-分散液液微萃取技術(shù)簡(jiǎn)單、快速、高效。由于4 碳酰氯-羅丹明 試劑結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)穩(wěn)定的分子內(nèi)永久正電荷，利用原位衍生聯(lián)合超高效液相色譜三重四 極桿質(zhì)譜法，能夠帶來(lái)顯著的質(zhì)譜增敏檢測(cè)效果。另外，本發(fā)明克服了常規(guī)方法的等問(wèn)題， 大大提高了質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度、選擇性和準(zhǔn)確度，且得到了良好回收率結(jié)果。本發(fā)明對(duì)腦微透 析液和尿液中的氨基酸類(lèi)和單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的同時(shí)檢測(cè)提供了一種高效、可靠的技術(shù)手 段。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是如何快速、準(zhǔn)確且高靈敏地同時(shí)檢測(cè)氨基酸類(lèi)和單胺類(lèi) 神經(jīng)遞質(zhì)。
[0016] 本發(fā)明中首次使用含有一個(gè)分子內(nèi)永久正電荷的衍生化試劑4'-碳酰氯-羅丹明 來(lái)衍生神經(jīng)遞質(zhì)。因此，神經(jīng)遞質(zhì)通過(guò)衍生化反應(yīng)得到的衍生物進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，衍生產(chǎn)物母離 子能夠產(chǎn)生特異性的含有羅丹明結(jié)構(gòu)的報(bào)告離子，帶來(lái)顯著的質(zhì)譜增敏檢測(cè)效果。通過(guò)內(nèi) 標(biāo)法定量，帶來(lái)了該檢測(cè)方法良好的靈敏度、選擇性和準(zhǔn)確度，和良好的回收率結(jié)果;本發(fā) 明通過(guò)將傳統(tǒng)的、毒性的氯代萃取溶劑更換為溴代溶劑，解決了環(huán)境不友好的問(wèn)題。氨基酸 類(lèi)和單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)所含有的活性氨基或酚羥基，能夠和衍生試劑4碳酰氯-羅丹明迅速 反應(yīng)。以高原兒茶酸(D0PAC)為例，4'-碳酰氯-羅丹明為衍生試劑的衍生化反應(yīng)示意圖如下 所示：
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及有益效果： 1.本發(fā)明首次使用4'-碳酰氯-羅丹明作為衍生化試劑對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)進(jìn)行原位衍生，衍 生化反應(yīng)條件溫和、快速，衍生產(chǎn)物穩(wěn)定，衍生化技術(shù)顯著提高了分析物的色譜分離度和檢 測(cè)靈敏度。
[0017] 2.本發(fā)明所提供的超聲輔助-原位衍生-分散液液微萃取前處理技術(shù)，聯(lián)合超高 效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)手段，采用內(nèi)標(biāo)法定量，實(shí)現(xiàn)了多種神經(jīng)遞質(zhì)的簡(jiǎn)單、快 速、準(zhǔn)確、高靈敏的同時(shí)測(cè)定且環(huán)境友好。
[0018] 3.本發(fā)明的檢測(cè)分析方法成功應(yīng)用于大鼠腦微透析液或尿液中多種神經(jīng)遞質(zhì)的 檢測(cè)，方法適用性良好。
【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1為實(shí)施例1中針對(duì)帕金森病和阿爾茨海默癥的神經(jīng)遞質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品分析方法質(zhì)譜 檢測(cè)分離圖。
[0020] 圖2為實(shí)施例1中高原兒茶酸(D0PAC)衍生物質(zhì)譜裂解機(jī)理示意圖。
[0021] 圖3為實(shí)施例2中帕金森病大鼠腦微透析液中神經(jīng)遞質(zhì)的質(zhì)譜檢測(cè)分離圖。
[0022] 圖4為實(shí)施例4中針對(duì)抑郁癥的神經(jīng)遞質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品分析方法質(zhì)譜檢測(cè)分離圖。
[0023] 圖5為實(shí)施例5中抑郁癥大鼠腦微透析液中神經(jīng)遞質(zhì)的質(zhì)譜檢測(cè)分離圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的闡述，下述說(shuō)明僅為了解釋本發(fā)明，并不 對(duì)其內(nèi)容進(jìn)行限定。
[0025]本發(fā)明中衍生化萃取物經(jīng)0.45 μπι濾膜過(guò)濾后利用超高效液相色譜三重四極桿串 聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行分析檢測(cè)。
[0026]本發(fā)明所使用的衍生化試劑4'-碳酰氯-羅丹明合成方法如下:將0.922 g 4'-羧 基-羅丹明（2 mmol，合成方法參考
【申請(qǐng)人】發(fā)表的論文Journal of Chromatography A, 2016, 1437: 49-57. ),30.0 mL氯化亞砜加入100 mL單口燒瓶中，滴入0.1 mL Ν,Ν-二甲基 甲酰胺，磁力攪拌，升溫至50~80°C，反應(yīng)5~6 h，減壓蒸除氯化亞砜，冷卻至室溫，得紫色 固體。用乙醚重結(jié)晶，得到0.42 g紫色針狀晶體即為4'-碳酰氯-羅丹明，收率45.5%。
[0027] 實(shí)施例1 針對(duì)帕金森病和阿爾茨海默癥大鼠腦微透析液中神經(jīng)遞質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品分析方法： 神經(jīng)遞質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品（19種，購(gòu)自Sigma試劑公司）用乙腈/水配制，得到濃度為5.0 X 10_5 mol Γ1的神經(jīng)遞質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取50 nL神經(jīng)遞質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液置于1.5 mL的離心管中，向所 述的標(biāo)準(zhǔn)品溶液中加入30 yL內(nèi)標(biāo)物溶液（內(nèi)標(biāo)物溶液由10 yL濃度為1ΧΠΓ5 mol/L異丙腎 上腺素的乙腈溶液，10 UL濃度為lXl(T5m〇l/L 5-羥吲哚-2-羧酸的乙腈溶液和10 uL濃度 為1父10-5!11〇1/1正亮氨酸的乙腈溶液組成）、加入800 111^!19.5的他!^03-恥20)3緩沖溶 液，隨后立即加入80 uL溴苯和200 uL摩爾濃度為0.01 mol/L的4'-碳酰氯-羅丹明-乙腈溶 液，漩渦混勻器震蕩5 s使溶液混合均勻，將該混合液放入超聲波振蕩器中進(jìn)行超聲輔助-原位衍生-分散液液微萃取，1 min(25 °C，40 KHz)后取出，高速離心（10000 rpm，2 min)， 有機(jī)相沉積在離心管底部，用微量注射器吸取沉積相轉(zhuǎn)移至另一小瓶中，用乙腈定容至200 HL。衍生化產(chǎn)物溶液經(jīng)濾膜過(guò)濾后取2 yL進(jìn)行超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜法檢測(cè)分 析； 檢測(cè)分析:流動(dòng)相六為5%乙腈水溶液含有0.1%甲酸，流動(dòng)相B為乙腈含有0.1%甲酸;色譜 分離梯度條件為〇 min流動(dòng)相組成為95%A+5%B，3 min時(shí)85%A+15%B，5 min時(shí)65%A+35%B，12 min時(shí)5%A+95%B，16 min時(shí)5%A+95%B;質(zhì)譜條件為：干燥氣溫度300 °C，流速10 L/min，噴霧 器氣壓40 psi，鞘氣溫度280 °C，流速11 L/min，毛細(xì)管電壓3.5 kV; 圖1為針對(duì)帕金森病和阿爾茨海默癥的神經(jīng)遞質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品分析方法質(zhì)譜檢測(cè)分離圖，分 析物之間分離度良好。質(zhì)譜分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，分析物多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)下產(chǎn)生相同的 主要子離子m/z 398.1和m/z 443.1，m/z 398.1用作定量子離子，m/z 443.1用作定性子離 子。以高原兒茶酸（D0PAC)衍生物為例，圖2為高原兒茶酸（D0PAC)衍生物質(zhì)譜裂解機(jī)理 示意圖，母離子為[M]+ m/z為1018.49能夠產(chǎn)生兩個(gè)特異性子離子m/z 398.1和m/z 443.1。對(duì)MRM模式的參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，分析物的定量離子對(duì)、定性離子對(duì)、最優(yōu)化碎裂電壓 (V)和電離能(eV)以及分析方法的相關(guān)系數(shù)、檢出限見(jiàn)表1。
[0028]表 1
實(shí)施例2 1.大鼠分組、給藥及腦微透析取樣： 將16只體重為200~250 g的雄性SD大鼠分為2組，第1組為對(duì)照組，第2組為模型組。帕 金森模型造模過(guò)程及行為學(xué)評(píng)價(jià)與文獻(xiàn)（Pharmacology Biochemistry and Behavior, 2011，98: 286-291)保持一致。上述模型組大鼠需要經(jīng)歷以下3個(gè)實(shí)驗(yàn)階段:第1個(gè)階段，為 造模成功后且能自由活動(dòng)的帕金森病模型大鼠，自由飲水、飲食，在清醒狀態(tài)下自動(dòng)收集腦 微透析液，并采用上述分析方法測(cè)定其中神經(jīng)遞質(zhì)的含量;第2階段，對(duì)第1階段的大鼠迅速 灌胃給予黃芩素(280 mg · kg^1)進(jìn)行治療，并自動(dòng)收集腦微透析液;待神經(jīng)遞質(zhì)濃度恢復(fù)到 接近第一階段時(shí)，準(zhǔn)備實(shí)施第3階段的實(shí)驗(yàn)；第3階段，上述大鼠給予傳統(tǒng)西藥美多巴（60 mg · kg，進(jìn)行治療，并自動(dòng)收集腦微透析液;超聲輔助-原位衍生-分散液液微萃取聯(lián)合超 高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜法測(cè)定腦微透析液中神經(jīng)遞質(zhì)： 上述3個(gè)不同實(shí)驗(yàn)階段的腦微透析液各取20 uL，分別加入30 uL內(nèi)標(biāo)物溶液（內(nèi)標(biāo)物溶 液由10 yL濃度為1X10-5mol/L異丙腎上腺素的乙腈溶液，10 uL濃度為1X10-5mol/L 5-羥吲哚-2-羧酸的乙腈溶液和10 nL濃度為1Χ10-5 mol/L正亮氨酸的乙腈溶液組成），加入 1000 yL pH為9的NaHC〇3-Na2C〇3緩沖溶液，分別加入100 uLl-溴-3-甲基丁烷和200 yL摩爾 濃度為IX l〇_2mol/L 4'-碳酰氯-羅丹明乙腈溶液，漩渦混勻器震蕩5 s使溶液混合均勻。 將該混合液放入超聲波振蕩器中進(jìn)行超聲輔助-原位衍生-分散液液微萃取，1 min(35 °C， 40 KHz)后取出。高速離心（10000 rpm，2 min)，有機(jī)相沉積在離心管底部，用微量注射器 吸取沉積相轉(zhuǎn)移至另一小瓶中，用乙腈定容至200 yL，經(jīng)濾膜過(guò)濾，采用同實(shí)施例1相同的 梯度洗脫及質(zhì)譜條件進(jìn)行超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜法檢測(cè)分析。圖3為帕金森病大 鼠腦微透析液神經(jīng)遞質(zhì)質(zhì)譜檢測(cè)分離圖。
[0029]正常組和帕金森病模型組大鼠（含3個(gè)實(shí)驗(yàn)階段)腦微透析液中神經(jīng)遞質(zhì)含量(n= 3)，以及正常大鼠腦微透析樣品測(cè)定回收率結(jié)果，如表2所示。
[0030]表 2
與正常組比較，#表示P < 0.05，###表示P < 0.01;與實(shí)驗(yàn)階段1比較，*表示 P < 0.05，*** 表示 P < 0.01; 實(shí)施例3 1.阿爾茨海默癥模型大鼠及尿液取樣： 8只體重為200~250 g的雄性SD大鼠，需要經(jīng)歷以下2個(gè)實(shí)驗(yàn)階段:第1個(gè)階段為正常狀 態(tài)大鼠，自由飲水、飲食，收集其尿液，用于檢測(cè)神經(jīng)遞質(zhì)濃度;第2個(gè)實(shí)驗(yàn)階段，阿爾茨海默 癥模型大鼠造模過(guò)程及行為學(xué)評(píng)價(jià)參照文獻(xiàn)進(jìn)行（Journal of Mass Spectrometry, 2015, 50: 354-363)，并與文獻(xiàn)一致，表明造模成功。自由飲水、飲食，收集其尿液。
[0031]超聲輔助-原位衍生-分散液液微萃取聯(lián)合超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜法測(cè) 定腦微透析液中神經(jīng)遞質(zhì)含量： 上述2個(gè)不同實(shí)驗(yàn)階段的尿液各取50 yL，分別加入30 yL內(nèi)標(biāo)物溶液（內(nèi)標(biāo)物溶液由10 口1^農(nóng)度為1\10-5111〇1/1異丙腎上腺素的乙腈溶液，10汕濃度為1\10- 5111〇1/15-羥吲哚-2-羧酸的乙腈溶液和10 uL濃度為1ΧΠΓ5 mol/L正亮氨酸的乙腈溶液組成），加入1500 uL ?!18的似!10)3-似20)3緩沖溶液，分別加入200汕溴代環(huán)己烷和300汕摩爾濃度為1\10一 2 m〇l/L4'_碳酰氯-羅丹明乙腈溶液，漩渦混勻器震蕩5 s使溶液混合均勻。將該混合液放入 超聲波振蕩器中進(jìn)行超聲輔助-原位衍生-分散液液微萃取，5 min( 10 °C，40 KHz)后取出。 高速離心（10000 rpm，2 min)，有機(jī)相沉積在離心管底部，用微量注射器吸取沉積相轉(zhuǎn)移 至另一小瓶中，用乙腈定容至200 yL。經(jīng)濾膜過(guò)濾，采用同實(shí)施例1相同的梯度洗脫及質(zhì)譜 條件進(jìn)行超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜法檢測(cè)分析。
[0032] 正常組和阿爾茨海默癥模型組大鼠尿液中神經(jīng)遞質(zhì)含量(n=3)，以及正常大鼠尿 液樣品測(cè)定回收率結(jié)果，如表3所示。
[0033]表 3
與正常組比較，*表示P < 0.05，***表示P < 0.01 實(shí)施例4 針對(duì)抑郁癥大鼠腦微透析液的神經(jīng)遞質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品分析方法： 神經(jīng)遞質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品（18種，購(gòu)自Sigma試劑公司）用乙腈/水配制得到濃度為5.0 X 10-5 mol I/1的神經(jīng)遞質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液，取50 yL置于1.5 mL的離心管中，加入30 yL內(nèi)標(biāo)物溶液（內(nèi) 標(biāo)物溶液由10 μL濃度為1XUT5 mol/L異丙腎上腺素的乙腈溶液，10 uL濃度為1ΧΠΓ5 mol/L 5-羥吲哚-2-羧酸的乙腈溶液和10 度為1ΧΠΓ5 mol/L正亮氨酸的乙腈溶液組 成），加入800 yL pH 9.5的NaHC03-Na2C03緩沖溶液，隨后立即加入80 uLl-溴代辛烷和200 HL摩爾濃度為1ΧΠΓ2 m〇l/L4'_碳酰氯-羅丹明丙酮溶液，漩渦混勻器震蕩5 s使溶液混合 均勻。將該混合液放入超聲波振蕩器中進(jìn)行超聲輔助-原位衍生-分散液液微萃取，1 min (25 °C，40 KHz)后取出。高速離心（10000 rpm，2 min)，有機(jī)相沉積在離心管底部，用微量 注射器吸取沉積相轉(zhuǎn)移至另一小瓶中，用乙腈定容至200 uL。衍生化產(chǎn)物溶液經(jīng)有機(jī)濾膜 過(guò)濾后取2 uL進(jìn)行超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜法檢測(cè)分析。
[0034]檢測(cè)分析:流動(dòng)相厶為5%乙腈水溶液含有0.1%甲酸，流動(dòng)相B為乙腈含有0.1%甲酸； 色譜分離梯度條件為：〇 min流動(dòng)相組成為95%A+5%B，2 min時(shí)88%A+12%B，6 min時(shí)60%A+40% B，10 min時(shí)5%A+95%B，12 min時(shí)5%A+95%B;質(zhì)譜的條件同實(shí)施例1，圖4為針對(duì)抑郁癥大鼠腦 微透析液神經(jīng)遞質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品分析方法質(zhì)譜檢測(cè)分離圖，分析物之間分離度良好。質(zhì)譜分析實(shí) 驗(yàn)結(jié)果表明，分析物多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM)下產(chǎn)生相同的主要子離子m/z 398.1和m/z 443. l，m/z 398.1用作定量子離子，m/z 443.1用作定性子離子。對(duì)MRM模式的參數(shù)進(jìn)行了優(yōu) 化，分析物的定量離子對(duì)、定性離子對(duì)、最優(yōu)化碎裂電壓(V)和電離能（eV)以及分析方法的 相關(guān)系數(shù)、檢出限和回收率見(jiàn)表4。
[0035]表 4
實(shí)施例5 1.大鼠分組、給藥及腦微透析取樣： 將16只體重為200~250 g的雄性SD大鼠分為2組，第1組為正常對(duì)照組，第2組為抑郁癥 模型組，抑郁癥模型大鼠造模參照文獻(xiàn)（Analytical Chemistry, 2012，84: 10044-10051)進(jìn)行，造模成功，與文獻(xiàn)結(jié)果一致。抑郁癥模型組大鼠需要經(jīng)歷以下3個(gè)實(shí)驗(yàn)階段:第 1個(gè)實(shí)驗(yàn)階段為抑郁癥模型大鼠造模成功后，自由飲水、飲食，自動(dòng)收集腦微透析液;第2個(gè) 實(shí)驗(yàn)階段，對(duì)第1個(gè)實(shí)驗(yàn)階段的大鼠灌胃給予和厚樸酚(40.0 mg · kg^1)，自動(dòng)收集腦微透析 液，待和厚樸酚藥效消失，該組大鼠進(jìn)入第3個(gè)實(shí)驗(yàn)階段;第3個(gè)實(shí)驗(yàn)階段，對(duì)第2個(gè)實(shí)驗(yàn)階段 的大鼠灌胃給予傳統(tǒng)西藥"氟西汀"（l〇.〇mg · kg"1)，自動(dòng)收集腦微透析液。
[0036]超聲輔助-原位衍生-分散液液微萃取聯(lián)合超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜法測(cè) 定腦微透析液中神經(jīng)遞質(zhì)： 上述3個(gè)不同實(shí)驗(yàn)階段的腦微透析液各取20 yL，加入含內(nèi)標(biāo)物，加入800 yL pH 9.5的 NaHC03-Na2C03緩沖溶液，加入80 uL萃取劑和200 uL分散劑(含衍生試劑）的混合溶液，漩渦 混勻器震蕩5 s使溶液混合均勻。將該混合液放入超聲波振蕩器中進(jìn)行超聲輔助-原位衍 生-分散液液微萃取，1 min(25 °C，40 KHz)后取出。高速離心（10000 rpm，2 min)，有機(jī)相 沉積在離心管底部，用微量注射器吸取沉積相轉(zhuǎn)移至另一小瓶中，用乙腈定容至200 uL。衍 生化產(chǎn)物溶液經(jīng)濾膜過(guò)濾，進(jìn)行超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜法檢測(cè)分析:流動(dòng)相六為5% 乙腈水溶液含有〇. 1%甲酸，流動(dòng)相B為乙腈含有0.1%甲酸;色譜分離梯度條件為:0 min流動(dòng) 相組成為95%A+5%B，2 min時(shí)88%A+12%B，6 min時(shí)60%A+40%B，10 min時(shí)5%A+95%B，12 min時(shí) 5%A+95%B;質(zhì)譜的條件同實(shí)施例1。
[0037] 實(shí)施例5中，正常組和抑郁癥模型組大鼠（含3個(gè)實(shí)驗(yàn)階段)腦微透析液神經(jīng)遞質(zhì)含 量(n=3)如表5所示。
[0038] 表5
與正常組比較，*表示P < 0.05，***表示P < 0.01;與實(shí)驗(yàn)階段1比較，#表示 p < 〇.〇5，### 表示 P < 0.01; 對(duì)比例1 該對(duì)比例過(guò)程與實(shí)施例1相同，不同在于衍生化反應(yīng)過(guò)程中：衍生化過(guò)程采用鄰苯二甲 醛(0ΡΑ)為衍生試劑。
[0039] 對(duì)比例2 該對(duì)比例過(guò)程與實(shí)施例1相同，不同在于衍生化反應(yīng)過(guò)程中：衍生化過(guò)程采用苯甲酰氯 為衍生試劑。
[0040] 對(duì)比例3 該對(duì)比例過(guò)程與實(shí)施例1相同，不同在于未經(jīng)衍生化反應(yīng)，采用高效液相色譜-電化學(xué) 直接檢測(cè)法。
[0041 ]下表6為實(shí)施例1同對(duì)比例1、2和3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比。
[0042]表 6
由表6可知，本發(fā)明利用超聲輔助-原位衍生-分散液液微萃取技術(shù)，具有快速、簡(jiǎn)單、靈 敏等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明分析方法檢出限比對(duì)比例低5-100倍左右，具有較高的靈敏度。本發(fā)明使 用溴苯為萃取劑，代替了傳統(tǒng)的氯代試劑，降低了實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所使用的試劑的毒性，更符合 綠色化學(xué)的精神。
[0043] 本發(fā)明分析方法中神經(jīng)遞質(zhì)的線(xiàn)性范圍2.60 X 10-3-20.80 nM，檢出限分布于7.42 X 10-4-0.48 nM之間，定量限分布于2.60 X 10-3-1.67 nM之間。表1-5結(jié)果表明，所建立的分 析方法能夠很好地應(yīng)用于檢測(cè)大鼠腦微透析液和尿液中相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)的含量。
[0044]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受實(shí)施例的限 制，其它任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所做的改變、修飾、組合、替代、簡(jiǎn)化均應(yīng)為 等效替換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于原位衍生測(cè)定多種神經(jīng)遞質(zhì)的檢測(cè)方法，其特征在于:所述的神經(jīng)遞質(zhì)與 衍生試劑4'-碳酰氯-羅丹明發(fā)生超聲輔助-原位衍生反應(yīng)，經(jīng)超聲輔助-分散液液微萃取富 集純化，得到的衍生化產(chǎn)物經(jīng)濾膜過(guò)濾后利用超高效液相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn) 行分析檢測(cè)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于:具體包括以下步驟： a. 超聲輔助-原位衍生-分散液液微萃取:取20-50 uL神經(jīng)遞質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液或待 測(cè)樣品，30燦內(nèi)標(biāo)物溶液、800-1500 111^!18.0-10.0的似!1〇)3-似2〇)3緩沖溶液，加入離 心管中，注入80-200 uL萃取劑和200-300 uL 4'-碳酰氯-羅丹明分散劑溶液，混合均勻后 放入超聲波振蕩器中進(jìn)行超聲輔助-原位衍生-分散液液微萃取，反應(yīng)結(jié)束后高速離心，吸 取下層有機(jī)相并用乙腈定容到200 uL，得氨基酸類(lèi)和單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)衍生化產(chǎn)物溶液； 所述內(nèi)標(biāo)物溶液是由10 μL濃度為lXl(T5m〇l/L異丙腎上腺素的乙腈溶液，10 度 為1 X 1(T5 mol/L 5-羥吲哚-2-羧酸的乙腈溶液和10 uL濃度為1 X 1(T5 mol/L正亮氨酸的乙 腈溶液組成； 所述的萃取劑為1-溴-3-甲基丁烷，溴代環(huán)己烷，1-溴代辛烷，溴苯； 所述的分散劑為丙酮，乙腈，甲醇或乙醇； b. 將上述氨基酸類(lèi)和單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)衍生化產(chǎn)物溶液經(jīng)濾膜過(guò)濾后，利用超高效液 相色譜三重四極桿質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行定性定量分析檢測(cè)。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于:步驟a中所述的萃取劑為溴苯;所述分 散劑為乙腈。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于:步驟a中所述的4碳酰氯-羅丹明-分 散劑溶液的摩爾濃度為1 X ΠΓ2 mol/L。5. 根據(jù)權(quán)利要求2或4所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述4'-碳酰氯-羅丹明采用以下 方法制備而成:將0.922 g 4'-羧基-羅丹明加入30 mL氯化亞砜，滴入0.1 mL N，N-二甲基 甲酰胺，磁力攪拌，升溫至50~80°C，反應(yīng)5~6 h，減壓蒸除氯化亞砜，冷卻至室溫，得紫色 固體，用乙醚重結(jié)晶，得紫色針狀晶體即為4'-碳酰氯-羅丹明。6. 根據(jù)權(quán)利要求2任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其特征在于:所述步驟a中所述超聲輔助-原 位衍生-分散液液微萃取為在溫度20-50°C，超聲頻率為40 KHz條件下反應(yīng)1 -5 min。7. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述神經(jīng)遞質(zhì)包括氨基酸類(lèi)神經(jīng) 遞質(zhì)和單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì);所述氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)包括谷氨酸，γ -氨基丁酸，門(mén)冬氨酸，色氨 酸，甘氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸;所述單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)包括：左旋多巴，多巴胺，去甲腎上腺 素，腎上腺素，3-甲氧酪胺，去甲變腎上腺素，變腎上腺素，高原兒茶酸，3,4_二羥基扁桃酸， DL-3，4-二羥基苯基二醇，高香草酸，香草扁桃酸，3-甲氧基-4-羥基苯乙二醇，羥色胺酸，5-羥色胺，5-羥吲哚乙酸，犬尿素，3-羥基犬尿氨酸，3-羥基鄰氨基苯甲酸，犬尿酸。8. 根據(jù)權(quán)利要求2任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其特征在于:所述的超高效液相色譜三重四 極桿串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)中色譜分離使用安捷倫SB C18色譜柱:2.1 mm X 50 mm，1.8 μπι，進(jìn)樣 體積為2 yL，柱溫30 °C，米用梯度洗脫法。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測(cè)方法，其特征在于:所述的梯度洗脫法，流速為0.2 mL/ min，流動(dòng)相A為5%乙腈水溶液含有0.1%甲酸，流動(dòng)相B為乙腈含有0.1%甲酸;色譜分離梯度 條件為〇 min流動(dòng)相組成為95%A+5%B，3 min時(shí)85%A+15%B，5 min時(shí)65%A+35%B，12 min時(shí)5%A +95%B，16 min時(shí)5%A+95%B或0 min流動(dòng)相組成為95%A+5%B，2 min時(shí)88%A+12%B，6 min時(shí)60% A+40%B，10 min時(shí)5%A+95%B，12 min時(shí)5%A+95%B。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測(cè)方法，其特征在于:所述的超高效液相色譜三重四極桿 串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)質(zhì)譜的條件為:干燥氣溫度300 °C，流速10 L/min，噴霧器氣壓40 psi，鞘氣溫度280 °C，流速11 L/min，毛細(xì)管電壓3.5 kV。
【文檔編號(hào)】G01N30/06GK105866303SQ201610466429
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年6月24日
【發(fā)明人】趙先恩, 和永瑞, 魏娜, 王仁君, 顏平, 王玉花, 鄭龍芳, 朱樹(shù)蕓, 尤進(jìn)茂
【申請(qǐng)人】曲阜師范大學(xué)