本發(fā)明涉及三價(jià)鐵離子檢測(cè)試劑技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種三價(jià)鐵離子檢測(cè)試劑及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

fe³⁺是人體內(nèi)最重要的金屬離子之一，在多種生理和病理過(guò)程起到了重要作用，包括血紅蛋白的形成，氧氣傳輸，細(xì)胞的新陳代謝，電子傳遞，酶催化，以及dna和rna的合成。

fe³⁺缺少會(huì)影響很多酶的活動(dòng)，如細(xì)胞色素c氧化酶，血紅素酶，多核糖核苷酸和琥珀酸脫氫酶。這些酶與生物氧化、組織呼吸、神經(jīng)遞質(zhì)的分解和合成密切相關(guān)。因此，fe³⁺缺乏是患有貧血，血色沉著病，智力下降，關(guān)節(jié)炎，心力衰竭，糖尿病，老年癡呆癥，癌癥等疾病的特征。一些新發(fā)現(xiàn)表明fe³⁺甚至能影響細(xì)胞死亡的過(guò)程，細(xì)胞凋亡的機(jī)制，科學(xué)家稱之為“鐵死亡”。因此，檢測(cè)活細(xì)胞和生物體中fe³⁺的濃度對(duì)于人體健康和早期疾病的診斷是至關(guān)重要的。

到目前為止，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種檢測(cè)fe³⁺手段，包括原子吸收光譜法、伏安法、比色質(zhì)譜法、電化學(xué)電感耦合等離子體質(zhì)譜法(icp-ms)和熒光光譜分析。在這些方法中，熒光測(cè)定由于其在組織和細(xì)胞水平操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、簡(jiǎn)單、高效而成為了廣受歡迎的方法。因此，fe³⁺熒光探針設(shè)計(jì)越來(lái)越受到關(guān)注。然而，現(xiàn)有技術(shù)中的探針普遍都是有毒性的，會(huì)帶來(lái)一定的危害。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種三價(jià)鐵離子檢測(cè)試劑及其制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明提供的三價(jià)鐵離子檢測(cè)試劑易被細(xì)胞吞噬且毒副作用小。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種三價(jià)鐵離子檢測(cè)試劑的制備方法，包含如下步驟:

將er(no3)3溶液、yb(no3)3溶液、tb(no3)3溶液、乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮混合，得到原料混合物；

將濃硫酸和乙醇的混合溶液加入到所述原料混合物中，得到酸性混合物；

將所述酸性混合物和堿液混合，得到堿性混合物；

對(duì)所述堿性混合物進(jìn)行熱處理，得到熱處理產(chǎn)物；

對(duì)所述熱處理產(chǎn)物進(jìn)行煅燒，得到三價(jià)鐵離子檢測(cè)試劑。

優(yōu)選的，所述er(no3)3溶液的濃度為0.01～1m；

所述yb(no3)3溶液的濃度為0.01～1m；

所述tb(no3)3溶液的濃度為0.01～1m。

優(yōu)選的，所述er(no3)3溶液、yb(no3)3溶液和tb(no3)3溶液的體積比為(0.1～0.5):(1～2):(15～20)；

所述er(no3)3溶液和乙二醇的體積比為(0.1～0.5):(15～25)；

所述乙二醇的體積和聚乙烯吡咯烷酮的質(zhì)量之比為(15～25)ml:(0.5～2)g。

優(yōu)選的，所述濃硫酸和乙醇的體積比為(0.35～0.45):(1～5)；

所述er(no3)3溶液和乙醇的體積比為(0.1～0.5):(1～5)。

優(yōu)選的，所述堿液的濃度為30～50mg/ml。

優(yōu)選的，所述er(no3)3溶液和堿液的體積比為(0.1～0.5):(1～5)。

優(yōu)選的，所述熱處理的溫度為180～220℃；

所述熱處理的時(shí)間為15～20h。

優(yōu)選的，所述煅燒的溫度為850～950℃；

所述煅燒的時(shí)間為1～5h。

本發(fā)明還提供了一種上述技術(shù)方案任意一項(xiàng)所述的制備方法得到的三價(jià)鐵離子檢測(cè)試劑，包含tb2o2so4、er和yb，所述tb2o2so4、er和yb的質(zhì)量比為(88～95):(1～2):(5～10)。

本發(fā)明還提供了一種上述技術(shù)方案所述三價(jià)鐵離子檢測(cè)試劑在以非治療目的檢測(cè)活細(xì)胞或生物體中fe³⁺濃度中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種三價(jià)鐵離子檢測(cè)試劑及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明將er(no3)3溶液、yb(no3)3溶液、tb(no3)3溶液、乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮混合，得到原料混合物；將濃硫酸和乙醇的混合溶液加入到所述原料混合物中，得到酸性混合物；將所述酸性混合物和堿液混合，得到堿性混合物；對(duì)所述堿性混合物進(jìn)行熱處理，得到熱處理產(chǎn)物；對(duì)所述熱處理產(chǎn)物進(jìn)行煅燒，得到三價(jià)鐵離子檢測(cè)試劑。本發(fā)明提供的三價(jià)鐵離子檢測(cè)試劑結(jié)晶度高，物相穩(wěn)定，為球形納米顆粒，平均粒徑為418nm，分布均勻且形貌規(guī)整。fe³⁺對(duì)tb2o2so4:er,yb有著較大的熒光猝滅，可達(dá)到74.23％，表明得到的tb2o2so4:er,yb能夠用于fe³⁺檢測(cè)。另外，所述tb2o2so4:er,yb具有較好的生物相容性，易被細(xì)胞吞噬且毒副作用小。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1中tb2o2so4:er,yb的xrd譜圖；

圖2為實(shí)施例1中tb2o2so4:er,yb的掃描電子顯微鏡照片；

圖3為實(shí)施例1中tb2o2so4:er,yb的發(fā)射和激發(fā)譜圖；

圖4為實(shí)施例1中tb2o2so4:er,yb的熒光強(qiáng)度變化圖；

圖5為實(shí)施例1中tb2o2so4:er,yb水分散液濃度和熒光顏色的變化圖；

圖6為實(shí)施例4中b2o2so4:er,yb與hela細(xì)胞共同培養(yǎng)后的細(xì)胞相對(duì)增殖率；

圖7為實(shí)施例4中b2o2so4:er,yb的細(xì)胞吞噬切片照片；

圖8為實(shí)施例4中b2o2so4:er,yb對(duì)細(xì)胞內(nèi)fe³⁺檢測(cè)。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了一種三價(jià)鐵離子檢測(cè)試劑的制備方法，包含如下步驟:

將er(no3)3溶液、yb(no3)3溶液、tb(no3)3溶液、乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮混合，得到原料混合物；

將濃硫酸和乙醇的混合溶液加入到所述原料混合物中，得到酸性混合物；

將所述酸性混合物和堿液混合，得到堿性混合物；

對(duì)所述堿性混合物進(jìn)行熱處理，得到熱處理產(chǎn)物；

對(duì)所述熱處理產(chǎn)物進(jìn)行煅燒，得到三價(jià)鐵離子檢測(cè)試劑。

本發(fā)明將er(no3)3溶液、yb(no3)3溶液、tb(no3)3溶液、乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮(pvp)混合，得到原料混合物。在本發(fā)明中，所述er(no3)3溶液優(yōu)選為er(no3)3水溶液，所述er(no3)3溶液的濃度優(yōu)選為0.01～1m，更優(yōu)選為0.02～0.08m，最優(yōu)選為0.04～0.06m。

在本發(fā)明中，所述yb(no3)3溶液優(yōu)選為yb(no3)3水溶液，所述yb(no3)3溶液的濃度優(yōu)選為0.01～1m，更優(yōu)選為0.02～0.08m，最優(yōu)選為0.04～0.06m。

在本發(fā)明中，所述tb(no3)3溶液優(yōu)選為tb(no3)3水溶液，所述tb(no3)3溶液的濃度優(yōu)選為0.01～1m，更優(yōu)選為0.02～0.08m，最優(yōu)選為0.04～0.06m。

在本發(fā)明中，所述er(no3)3溶液、yb(no3)3溶液和tb(no3)3溶液的體積比優(yōu)選為(0.1～0.5):(1～2):(15～20)，更優(yōu)選為(0.2～0.4):(1.2～1.8):(16～19)，最優(yōu)選為0.3:1.5:18.2；所述er(no3)3溶液和乙二醇的體積比優(yōu)選為(0.1～0.5):(15～25)，更優(yōu)選為(0.2～0.4):(18～23)，最優(yōu)選為0.3:20；所述乙二醇的體積和聚乙烯吡咯烷酮的質(zhì)量之比優(yōu)選為(15～25)ml:(0.5～2)g，更優(yōu)選為(18～23)ml:(0.8～1.5)g，最優(yōu)選為20ml:1g。

本發(fā)明對(duì)所述er(no3)3、yb(no3)3、tb(no3)3、乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮的來(lái)源沒(méi)有任何的特殊要求，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的市售的上述具體物質(zhì)即可。

本發(fā)明對(duì)所述述er(no3)3溶液、yb(no3)3溶液、tb(no3)3溶液、乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮(pvp)的混合順序沒(méi)有特殊要求，可以按照任意的順序進(jìn)行混合，將各原料混合均勻即可。在本發(fā)明中，所述er(no3)3溶液、yb(no3)3溶液、tb(no3)3溶液、乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮(pvp)的混合優(yōu)選在磁力攪拌條件下進(jìn)行；所述磁力攪拌的速率優(yōu)選為600～800轉(zhuǎn)/分鐘，更優(yōu)選為650～750轉(zhuǎn)/分鐘，最優(yōu)選為700轉(zhuǎn)/分鐘；所述磁力攪拌的時(shí)間優(yōu)選為5～15min，更優(yōu)選為8～13min，最優(yōu)選為10min。

得到原料混合物后，本發(fā)明將濃硫酸和乙醇的混合溶液加入到所述原料混合物中，得到酸性混合物。在本發(fā)明中，所述濃硫酸的質(zhì)量濃度優(yōu)選為95～98％，更優(yōu)選為96～97％。在本發(fā)明中，所述濃硫酸和乙醇的體積比優(yōu)選為(0.35～0.45):(1～5)，更優(yōu)選為(0.380～0.430):(2～4)，最優(yōu)選為0.400:3；所述er(no3)3溶液和乙醇的體積比優(yōu)選為(0.1～0.5):(1～5)，更優(yōu)選為(0.2～0.4):(2～4)，最優(yōu)選為0.3:3。

本發(fā)明優(yōu)選以滴加的形式將所述濃硫酸和乙醇的混合溶液加入到所述原料混合物中，以便分散均勻和防止爆聚。在本發(fā)明中，所述滴加的速率優(yōu)選為1～3滴/秒，更優(yōu)選為2滴/秒。

得到酸性混合物后，本發(fā)明將所述酸性混合物和堿液混合，得到堿性混合物。在本發(fā)明中，所述堿液優(yōu)選為氫氧化鈉水溶液；所述堿液的濃度優(yōu)選為30～50mg/ml，更優(yōu)選為35～45mg/ml，最優(yōu)選為40mg/ml。

在本發(fā)明中，所述er(no3)3溶液和堿液的體積比優(yōu)選為(0.1～0.5):(1～5)，更優(yōu)選為(0.2～0.4):(2～4)，最優(yōu)選為0.3:3。本發(fā)明對(duì)所述酸性混合物和堿液的混合方式和混合順序沒(méi)有任何的特殊要求，優(yōu)選將堿液滴加至酸性混合物中，以便分散均勻和防止爆聚。在本發(fā)明中，所述滴加的速率優(yōu)選為1～3滴/秒，更優(yōu)選為2滴/秒。

在本發(fā)明中，所述濃硫酸和乙醇的混合溶液和堿液的加入時(shí)間間隔優(yōu)選為5～10min，更優(yōu)選為6～9min，最優(yōu)選為7～8min。

本發(fā)明選擇先加入濃硫酸和乙醇的混合溶液后再加入堿液，能夠避免先加入堿液時(shí)提前發(fā)生酸堿中和反應(yīng)，生成副產(chǎn)物。

得到堿性混合物后，本發(fā)明對(duì)所述堿性混合物進(jìn)行熱處理，得到熱處理產(chǎn)物。在本發(fā)明中，所述熱處理的溫度優(yōu)選為180～220℃，更優(yōu)選為190～210℃，最優(yōu)選為200℃；所述熱處理的時(shí)間優(yōu)選為15～20h，更優(yōu)選為16～19h，最優(yōu)選為17～18h。在本發(fā)明中，所述熱處理優(yōu)選在高溫高壓反應(yīng)釜中進(jìn)行。在本發(fā)明所述熱處理過(guò)程中，分散的溶劑離子在反應(yīng)釜的高溫高壓的環(huán)境下發(fā)生酸堿中和反應(yīng)，生成常溫難以形成的硫酸鹽。本發(fā)明對(duì)所述高溫高壓反應(yīng)釜中的壓力沒(méi)有特殊要求，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所常用的壓力即可。

本發(fā)明優(yōu)選對(duì)所述熱處理得到的產(chǎn)物進(jìn)行固液分離和洗滌。在本發(fā)明中，所述固液分離優(yōu)選為離心處理；本發(fā)明對(duì)所述離心處理的具體工藝條件沒(méi)有任何的特殊要求，能夠?qū)崿F(xiàn)固液分離的目的即可。在本發(fā)明中，所述洗滌優(yōu)選順次包含水洗和乙醇洗。本發(fā)明優(yōu)選將所述洗滌得到的產(chǎn)物在乙醇中進(jìn)行干燥，以避免結(jié)塊。在本發(fā)明中，所述干燥的溫度優(yōu)選為55～65℃，更優(yōu)選為58～63℃，最優(yōu)選為60℃。

得到熱處理產(chǎn)物后，本發(fā)明對(duì)所述熱處理產(chǎn)物進(jìn)行煅燒，得到三價(jià)鐵離子檢測(cè)試劑。在本發(fā)明中，所述煅燒優(yōu)選在馬弗爐中進(jìn)行；所述煅燒的溫度優(yōu)選為850～950℃，更優(yōu)選為880～930℃，最優(yōu)選為900℃；所述煅燒的時(shí)間優(yōu)選為1～5h，更優(yōu)選為2～4h，最優(yōu)選為3h。

本發(fā)明還提供了一種上述技術(shù)方案任意一項(xiàng)所述的制備方法得到的三價(jià)鐵離子檢測(cè)試劑，包含tb2o2so4、er和yb，所述tb2o2so4、er和yb的質(zhì)量比為(88～95):(1～2):(5～10)。在本發(fā)明中，所述tb2o2so4、er和yb的質(zhì)量比為(88～95):(1～2):(5～10)，優(yōu)選為91:1.5:7.5。在本發(fā)明所述三價(jià)鐵離子檢測(cè)試劑中，tb2o2so4為基體材料，er和yb為摻雜元素。

本發(fā)明還提供了一種上述技術(shù)方案所述三價(jià)鐵離子檢測(cè)試劑在以非治療目的檢測(cè)活細(xì)胞或生物體中fe³⁺濃度中的應(yīng)用。

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的三價(jià)鐵離子檢測(cè)試劑及其制備方法和應(yīng)用進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明，但是不能把它們理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。

實(shí)施例1

量取0.3ml0.02m的er(no3)3溶液、1.5ml0.02m的yb(no3)3溶液和18.2ml0.02m的tb(no3)3溶液置于燒杯中，同時(shí)在燒杯中加入20ml的eg(乙二醇)和1.0g的pvp(聚乙烯吡咯烷酮)，以800轉(zhuǎn)/分鐘的速度磁力攪拌10min；

將400μl質(zhì)量濃度為98％的濃硫酸溶解在2ml乙醇中逐滴加入溶液，隨后將80mg的氫氧化鈉溶解于2ml去離子水中逐滴加入溶液，繼續(xù)以800轉(zhuǎn)/分鐘的速度磁力攪拌30min；

將上述溶液轉(zhuǎn)移至50ml高溫高壓反應(yīng)釜，200℃條件下反應(yīng)18小時(shí)；

反應(yīng)結(jié)束后取出溶液，在8000r/min條件下離心，用去離子水和乙醇各洗滌2次，將產(chǎn)物分散在少量的乙醇中60℃條件下烘干干燥；

干燥后的產(chǎn)物在馬弗爐中900℃條件下煅燒2h得到最終tb2o2so4:er,yb納米粒子。

本發(fā)明對(duì)本實(shí)施例得到的tb2o2so4:er,yb納米粒子進(jìn)行了xrd衍射分析和掃描電鏡分析，結(jié)果分別如圖1和圖2所示。其中，圖1為實(shí)施例1中tb2o2so4:er,yb的xrd譜圖；圖2為實(shí)施例1中tb2o2so4:er,yb的掃描電子顯微鏡照片。

由圖1的xrd譜圖可知，該譜圖與標(biāo)準(zhǔn)的pdf卡片(其卡片號(hào)為jcpdsno.41-0684)基本吻合，證明產(chǎn)物確實(shí)為tb2o2so4:er,yb，衍射峰主峰清晰尖銳，強(qiáng)度高，表明tb2o2so4:er,yb樣品的結(jié)晶度高，物相穩(wěn)定。

由圖2的掃描照片可知，所制備的tb2o2so4:er,yb是球形納米顆粒，平均粒徑為418nm，分布均勻且形貌規(guī)整。

本發(fā)明還對(duì)本實(shí)施例得到的tb2o2so4:er,yb納米粒子進(jìn)行了熒光檢測(cè)和離子檢測(cè)，結(jié)果分別如圖3和圖4所示。其中，圖3為實(shí)施例1中tb2o2so4:er,yb的發(fā)射和激發(fā)譜圖；圖4為實(shí)施例1中tb2o2so4:er,yb的熒光強(qiáng)度變化圖。

tb2o2so4:er,yb納米顆粒對(duì)不同離子的檢測(cè)

(1)按照計(jì)算取適量tb2o2so4:er,yb納米顆粒固體粉末分散在去離子水中，配置成10^-3m濃度的分散液；

(2)取上述溶液1.5ml置于熒光儀中，記錄溶液在369nm激發(fā)波長(zhǎng)下對(duì)應(yīng)的發(fā)射波長(zhǎng)和強(qiáng)度；

(3)向溶液中加入0.5ml的10^-3m的fe³⁺(氯離子為相應(yīng)的陰離子)溶液，再次測(cè)量記錄混合溶液在369nm激發(fā)波長(zhǎng)下對(duì)應(yīng)的發(fā)射波長(zhǎng)和強(qiáng)度，并與原溶液的數(shù)據(jù)相互對(duì)比；

(4)采用同樣的方法以此記錄材料分散液與0.5ml的10^-3m的fe²⁺、mg²⁺、ca²⁺、co²⁺、cu²⁺、na⁺、cd²⁺等溶液混合后熒光的變化情況，匯總分析。

由圖3譜圖可知，在369nm波長(zhǎng)激發(fā)下，樣品的發(fā)射峰為490nm、545nm和620nm等；在545nm發(fā)射波長(zhǎng)下，樣品的主要激發(fā)峰為369nm、379nm等。這些激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)主要與tb的能級(jí)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。

由圖4結(jié)果可知當(dāng)tb2o2so4:er,yb的水分散液與不同的離子溶液混合后其545nm處熒光強(qiáng)度的變化情況。具體的，fe³⁺使材料的熒光衰減最多，其強(qiáng)度僅為原來(lái)的25.77％，而加入其他離子后，熒光強(qiáng)度剩余41.62～94.82％不等?？梢?jiàn)，fe³⁺對(duì)tb2o2so4:er,yb有著較大的熒光猝滅，這為tb2o2so4:er,yb后續(xù)對(duì)fe³⁺的檢測(cè)提供基礎(chǔ)。

另外，tb2o2so4:er,yb的水分散液在不同的濃度下其顏色也有所變化。如圖5所示，當(dāng)材料的濃度從10^-2m降至10^-3m時(shí)，宏觀的顏色由紅色變?yōu)樗{(lán)色，插圖顯示的是具體變化前后顏色的數(shù)碼照片。而當(dāng)加入一定量的的fe³⁺溶液后，熒光衰減，不再顯現(xiàn)任何顏色。

實(shí)施例2

量取0.4ml0.01m的er(no3)3溶液、1ml0.025m的yb(no3)3溶液和20ml0.025m的tb(no3)3溶液置于燒杯中，同時(shí)在燒杯中加入18ml的eg(乙二醇)和1.2g的pvp(聚乙烯吡咯烷酮)，以800轉(zhuǎn)/分鐘的速度磁力攪拌10min；

將400μl質(zhì)量濃度為97％的濃硫酸溶解在3ml乙醇中逐滴加入溶液，隨后將82mg的氫氧化鈉溶解于3ml去離子水中逐滴加入溶液，繼續(xù)以800轉(zhuǎn)/分鐘的速度磁力攪拌30min；

將上述溶液轉(zhuǎn)移至50ml高溫高壓反應(yīng)釜，220℃條件下反應(yīng)18小時(shí)；

反應(yīng)結(jié)束后取出溶液，在8000r/min條件下離心，用去離子水和乙醇各洗滌2次，將產(chǎn)物分散在少量的乙醇中60℃條件下烘干干燥；

干燥后的產(chǎn)物在馬弗爐中920℃條件下煅燒2h得到最終tb2o2so4:er,yb納米粒子。

實(shí)施例3

量取0.2ml0.02m的er(no3)3溶液、2ml0.02m的yb(no3)3溶液和15ml0.02m的tb(no3)3溶液置于燒杯中，同時(shí)在燒杯中加入18ml的eg(乙二醇)和0.8g的pvp(聚乙烯吡咯烷酮)，以800轉(zhuǎn)/分鐘的速度磁力攪拌10min；

將400μl質(zhì)量濃度為96％的濃硫酸溶解在2ml乙醇中逐滴加入溶液，隨后將78mg的氫氧化鈉溶解于1.8ml去離子水中逐滴加入溶液，繼續(xù)以800轉(zhuǎn)/分鐘的速度磁力攪拌30min；

將上述溶液轉(zhuǎn)移至50ml高溫高壓反應(yīng)釜，190℃條件下反應(yīng)18小時(shí)；

反應(yīng)結(jié)束后取出溶液，在8000r/min條件下離心，用去離子水和乙醇各洗滌2次，將產(chǎn)物分散在少量的乙醇中60℃條件下烘干干燥；

干燥后的產(chǎn)物在馬弗爐中890℃條件下煅燒2h得到最終tb2o2so4:er,yb納米粒子。

實(shí)施例4

mtt法評(píng)價(jià)tb2o2so4:er,yb細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

具體步驟如下：

(1)將人宮頸癌細(xì)胞(市售)以4000～6000個(gè)/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)(5％co2，37℃)；

(2)稱取適量實(shí)施例1所制備的tb2o2so4:er,yb樣品溶于水后分散于適量細(xì)胞培養(yǎng)液中，令tb2o2so4:er,yb質(zhì)量濃度為31.25～500ug/ml(31.25ug/ml,62.5ug/ml,125ug/ml,250ug/ml,500ug/ml)；

(3)取上述不同濃度的tb2o2so4:er,yb各100ul，注入96孔培養(yǎng)板中，每個(gè)濃度6孔，與人宮頸癌細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)(5％co2，37℃)；

(4)將96孔板傾斜，用移液槍小心吸除96孔培養(yǎng)板中的tb2o2so4:er,yb，每孔各加入20ul四甲基偶氮咗鹽(mtt)，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)(5％co2，37℃)；

(5)終止培養(yǎng)，每孔各加入150ul二甲基亞砜，37℃恒溫震蕩10min，用酶標(biāo)儀測(cè)定各個(gè)孔在490nm的光密度od值；

(6)以不與tb2o2so4:er,yb共培養(yǎng)的細(xì)胞為對(duì)照組，用酶標(biāo)儀測(cè)定該組各個(gè)孔在490nm的光密度od值；

(7)細(xì)胞的相對(duì)增殖率按如下公式計(jì)算：

tb2o2so4:er,yb納米顆粒在細(xì)胞內(nèi)對(duì)三價(jià)鐵離子的檢測(cè)

(1)按照計(jì)算取適量tb2o2so4:er,yb納米顆粒固體粉末高溫消毒(30℃，0.5h)后分散于dmem培養(yǎng)液(市售，www.gelifesciences.com/hyclone)中制備成200ug/ml的材料分散液；

(2)將材料分散液加入(每孔加入50ul)已經(jīng)準(zhǔn)備好的hela細(xì)胞中共同培養(yǎng)一定時(shí)間(co2培養(yǎng)箱，5％co2，37℃)；

(3)分別將材料與hela細(xì)胞共同培養(yǎng)24h、40h、48h、60h后，用pbs洗去未被細(xì)胞吞噬的多余材料，在熒光顯微鏡下，采用紫外燈光源照射，觀察細(xì)胞的熒光情況并拍照；

(4)取與材料共同培養(yǎng)40h的hela細(xì)胞，加入已經(jīng)消毒過(guò)的10^-3m的fe³⁺溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，觀察細(xì)胞熒光變化情況并拍照。

mtt法細(xì)胞毒性測(cè)定結(jié)果如圖6所示，圖6顯示的是不同濃度的tb2o2so4:er,yb納米粒子與hela細(xì)胞共同培養(yǎng)24h后的細(xì)胞相對(duì)增殖率。由圖6可知，當(dāng)tb2o2so4:er,yb的濃度在200μg/ml時(shí)，hela細(xì)胞的相對(duì)增殖率仍可以達(dá)到80％以上，表明所制備的tb2o2so4:er,yb具有較好的生物相容性，隨著材料濃度的降低其細(xì)胞增殖率逐漸增高。

tb2o2so4:er,yb的細(xì)胞吞噬切片照片如圖7所示，由圖7可知當(dāng)tb2o2so4:er,yb材料與hela細(xì)胞共同培養(yǎng)10h后，其細(xì)胞切片的透射電鏡照片顯示，材料已經(jīng)開(kāi)始被吞噬進(jìn)細(xì)胞，圖中的黑色小點(diǎn)就是被吞噬的材料，右下角更清晰的照片顯示材料被吞噬進(jìn)了細(xì)胞的溶酶體中。

圖8中a至d顯示的是tb2o2so4:er,yb材料與hela細(xì)胞共同培養(yǎng)24小時(shí)、40小時(shí)、48小時(shí)、60小時(shí)候后在紫外光照射下的熒光照片，可見(jiàn)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，被細(xì)胞吞噬的材料逐漸增多，對(duì)應(yīng)的藍(lán)色熒光逐漸明顯。而細(xì)胞中的一些紅色是由于材料富集、濃度增大而導(dǎo)致的。圖e顯示在材料和細(xì)胞培養(yǎng)40h后加入fe³⁺繼續(xù)培養(yǎng)4h的熒光照片，可見(jiàn)細(xì)胞的藍(lán)色熒光明顯衰減，說(shuō)明材料可在細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)fe³⁺，所制備的tb2o2so4:er,yb材料能作為一種新型的細(xì)胞內(nèi)fe³⁺檢測(cè)劑。

由以上實(shí)施例可知，本發(fā)明提供了一種三價(jià)鐵離子檢測(cè)試劑及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明將er(no3)3溶液、yb(no3)3溶液、tb(no3)3溶液、乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮混合，得到原料混合物；將濃硫酸和乙醇的混合溶液加入到所述原料混合物中，得到酸性混合物；將所述酸性混合物和堿液混合，得到堿性混合物；對(duì)所述堿性混合物進(jìn)行熱處理，得到熱處理產(chǎn)物；對(duì)所述熱處理產(chǎn)物進(jìn)行煅燒，得到三價(jià)鐵離子檢測(cè)試劑。本發(fā)明提供的tb2o2so4:er,yb結(jié)晶度高，物相穩(wěn)定，為球形納米顆粒，平均粒徑為418nm，分布均勻且形貌規(guī)整。fe³⁺對(duì)tb2o2so4:er,yb有著較大的熒光猝滅，可達(dá)到74.23％，表明得到的tb2o2so4:er,yb能夠用于fe³⁺檢測(cè)。另外，所述tb2o2so4:er,yb具有較好的生物相容性，易被細(xì)胞吞噬且毒副作用小。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。