基于zeb-1和zeb-2作為標(biāo)記物預(yù)警乳腺癌轉(zhuǎn)移的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于ZEB?1和ZEB?2作為標(biāo)記物預(yù)警乳腺癌轉(zhuǎn)移的方法,首先提取手術(shù)后的乳腺癌患者腫瘤組織制成石蠟標(biāo)本，對石蠟標(biāo)本進(jìn)行切片和HE染色，然后分別采用免疫組織化學(xué)法和分子雜交技術(shù)檢測腫瘤組織中ZEB?1、ZEB?2的蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)，若患者腫瘤組織中ZEB?1、ZEB?2的蛋白表達(dá)和/或mRNA表達(dá)呈陽性，則提示患者的乳腺癌腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。本發(fā)明通過將ZEB?1和ZEB?2作為標(biāo)記物，對患者乳腺癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)進(jìn)行預(yù)警，為乳腺癌的合理治療提供新依據(jù)，從而可以對乳腺癌患者進(jìn)行針對性治療，大大提高了治療效果，改善了患者的預(yù)后，進(jìn)而提高了患者的生活質(zhì)量。
【專利說明】
基于ZEB-1和ZEB-2作為標(biāo)記物預(yù)警乳腺癌轉(zhuǎn)移的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)病理學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種預(yù)警乳腺癌腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的標(biāo)記 物，具體是一種基于ZEB-1和ZEB-2作為標(biāo)記物預(yù)警乳腺癌轉(zhuǎn)移的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤細(xì)胞、宿主細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)之間的一系列復(fù)雜、多步 驟相互作用的結(jié)果，是一個多階梯瀑布進(jìn)程。其中，尤以病灶局部基底膜完整性的破壞、細(xì) 胞外基質(zhì)降解和腫瘤細(xì)胞上皮 -間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transitions，EMT)兩 個方面是腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的重要條件。EMT在腫瘤演進(jìn)過程中發(fā)揮了重要作用，它是指上 皮細(xì)胞在特定的生理和病理情況下向間充質(zhì)細(xì)胞分化的現(xiàn)象，研究發(fā)現(xiàn)晶狀體上皮細(xì)胞在 膠原凝膠中可形成偽足，轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細(xì)胞樣形態(tài)，獲得移行能力。EMT的核心就是E-鈣粘蛋 白（E-cadherin)的缺失，導(dǎo)致上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞與細(xì)胞間的粘附作用不穩(wěn)定，以及 細(xì)胞骨架、細(xì)胞角蛋白（cytokeratin)、波形蛋白（Vimentin)的改變，并使環(huán)連蛋白從復(fù) 合體上解離，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶中的分離。通過對胚胎發(fā)育的研究證實(shí)，EMT是一 個可逆的過程，當(dāng)脫落腫瘤細(xì)胞到達(dá)異位器官后會再分化，發(fā)生間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化 (Mesenchymal-epithelial transitions，MET)，以長期存活并形成為轉(zhuǎn)移灶。ZEB-1 (zinc-finger E-box-binding homeobox-1)和ZEB_2(zinc-finger E-box-binding homeobox-2) 都是鋅指結(jié)構(gòu)蛋白，廣泛的存在于各種生物體內(nèi)，是一類核轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)控下游靶基因 的轉(zhuǎn)錄，ZEB-1和ZEB-2均可通過與E-鈣粘蛋白上保守的E2-boxes結(jié)合使其轉(zhuǎn)錄下調(diào)，從而 導(dǎo)致HMT。
[0003] 目前，對于乳腺癌手術(shù)后患者進(jìn)行治療(放療或藥物治療）的原則主要根據(jù)手術(shù)切 除腫瘤組織的病理學(xué)檢查（如淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況、雌孕激素表達(dá)狀況、臨床分期等)和患者自 身身體狀況等做出。在術(shù)后治療過程中，由于缺乏預(yù)測、預(yù)警和早期發(fā)現(xiàn)體內(nèi)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)灶 的生物學(xué)標(biāo)志物，喪失了針對性治療的最佳良機(jī)。一旦等到臨床上發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶或復(fù)發(fā)灶(如 乳腺癌骨轉(zhuǎn)移、腦轉(zhuǎn)移等），患者已經(jīng)達(dá)到癌癥晚期，治療效果和機(jī)體耐受治療的能力已經(jīng) 大打折扣，同時也大大增加了患者的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
[0004] 現(xiàn)有的標(biāo)記物如CA15.3，CA27.29和CEA等由于敏感性和特異性不高，尚未在臨床 診療中應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種基于ZEB-1和ZEB-2作為標(biāo)記物預(yù)警乳腺癌轉(zhuǎn)移的方 法，為提示乳腺癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)提供生物學(xué)標(biāo)記物，從而為乳腺癌的合理治療提供新依據(jù)。
[0006] 本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0007] 基于ZEB-1和ZEB-2作為標(biāo)記物預(yù)警乳腺癌轉(zhuǎn)移的方法，該方法將ZEB-1和ZEB-2作 為標(biāo)記物，對乳腺癌轉(zhuǎn)移進(jìn)行監(jiān)測和預(yù)警；
[0008]該方法包括如下步驟：
[0009] A.提取手術(shù)后的乳腺癌患者腫瘤組織制成石蠟標(biāo)本；
[0010] B.對石蠟標(biāo)本進(jìn)行4WI1厚連續(xù)切片，對切片采用HE染色；
[0011 ] C.采用免疫組織化學(xué)法檢測腫瘤組織中ZEB-1、ZEB-2的蛋白表達(dá)；
[0012] D ?采用原位分子雜交技術(shù)檢測腫瘤組織中ZEB-1和ZEB-2的mRNA表達(dá)；
[0013] E.分別觀察經(jīng)過免疫組織化學(xué)法檢測和原位分子雜交技術(shù)檢測的患者腫瘤組織 切片，兩種方法檢測的ZEB-UZEB-2指標(biāo)均以腫瘤組織細(xì)胞核和/或細(xì)胞漿呈黃色或棕黃色 記為陽性表達(dá)，若患者腫瘤組織中ZEB-1、ZEB-2的蛋白表達(dá)和/或mRNA表達(dá)呈陽性，則提示 患者的乳腺癌腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。
[0014]進(jìn)一步地，所述的免疫組織化學(xué)法包括以下步驟：
[0015] a.將石蠟切片放入60 °C恒溫烤箱，烘烤時間為2小時以上；
[0016] b.將切片脫蠟與水化:將切片置于二甲苯中浸泡10分鐘，更換二甲苯后再浸泡10 分鐘;置于無水乙醇中浸泡5分鐘;置入95 %乙醇中浸泡5分鐘;置入70 %乙醇中浸泡5分鐘； 置入蒸餾水中浸泡5分鐘；
[0017] c.采用檸檬酸鹽緩沖液高壓抗原修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù):將脫蠟水化的組織切片置 于耐高溫切片架上，同時將PH 6.0的檸檬酸鹽緩沖液在高壓鍋中加熱至沸騰，再將切片架 放入已沸騰的緩沖液中，關(guān)閉高壓鍋直至開始噴氣時，蓋上壓力閥，2分鐘后，將高壓鍋置入 涼水中冷卻直至室溫，將切片取出；
[0018] d.用PBS緩沖液沖洗3次，每次沖洗5分鐘；
[0019] e.切片分別滴加50ul ZEB-1和ZEB-2的一抗試劑，置于4°C環(huán)境下過夜；
[0020] f.次日復(fù)溫30分鐘后，用PBS緩沖液沖洗3次，每次沖洗5分鐘，然后甩去roS緩沖 液；
[0021] g.滴加二抗試劑，二抗試劑采用快捷型酶標(biāo)羊抗和鼠IgG聚合物，在37°C環(huán)境下孵 育20分鐘；
[0022] h.用PBS緩沖液沖洗3次，每次沖洗5分鐘，然后甩去PBS緩沖液；
[0023] i.每張切片滴加50ul DAB溶液，避光顯色3-10分鐘，在顯微鏡下控制顯色；
[0024] j .置于水下充分沖洗，采用蘇木精復(fù)染，用自來水沖洗返藍(lán)；
[0025] k.將切片經(jīng)梯度酒精干燥，用二甲苯透明，最后用中性樹膠封片。
[0026] 進(jìn)一步地，所述的原位分子雜交技術(shù)包括以下步驟：
[0027] a.將石蠟切片放入60 °C恒溫烤箱過夜；
[0028] b.將切片脫蠟與水化:將切片置于二甲苯中浸泡10分鐘，更換二甲苯后再浸泡10 分鐘;置于無水乙醇中浸泡5分鐘;置入95 %乙醇中浸泡5分鐘;置入70 %乙醇中浸泡5分鐘； 置入DEPC水中浸泡5分鐘；
[0029] c.用0.5M PBS緩沖液沖洗3次，每次沖洗5分鐘；
[0030] d.用3%雙氧水室溫作用10分鐘，用DEPC水沖洗3次，每次沖洗5分鐘；
[0031] e.用3%檸檬酸稀釋的胃蛋白酶在37°C環(huán)境下消化20分鐘；
[0032] f.用0.5M PBS緩沖液沖洗3次，每次沖洗5分鐘，用DEPC水沖洗1次；
[0033] g.滴加預(yù)雜交液50ul/片，置入40°C_42°C恒溫箱4小時，然后甩去多余液體；
[0034] h.再次滴加雜交液50ul/片，置入40°C-42°C恒溫箱16-20小時；
[0035] i .用37°C預(yù)溫的2 X SSC緩沖液沖洗2次，每次沖洗5分鐘，再用37°C預(yù)溫的0.5 X SSC緩沖液沖洗3次，每次沖洗5分鐘，再用37 °C預(yù)溫的0.2 X SSC緩沖液沖洗3次，每次沖洗5 分鐘；
[0036] j .滴加封閉液，在37 °C環(huán)境下放置30分鐘，然后甩去多余液體；
[0037] k.滴加生物素化鼠抗地高辛，在37°C環(huán)境下放置60分鐘，然后用0.5M PBS緩沖液 沖洗3次，每次沖洗5分鐘；
[0038] 1.滴加SABC，在37 °C環(huán)境下放置20分鐘，然后用0.5M PBS緩沖液沖洗3次，每次沖 洗5分鐘；
[0039] m.滴加生物素化過氧化物酶，在37°C環(huán)境下放置20分鐘，然后用0.5M PBS緩沖液 沖洗3次，每次沖洗5分鐘，然后甩去PBS緩沖液；
[0040] n.每張切片滴加100ul DAB溶液，避光顯色3-10分鐘，在顯微鏡下控制顯色；
[0041 ] 〇.置于水下充分沖洗，采用蘇木精復(fù)染，用自來水沖洗返藍(lán)；
[0042] p.將切片經(jīng)梯度酒精干燥，用二甲苯透明，最后用中性樹膠封片。
[0043]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明通過將ZEB-1和ZEB-2作為標(biāo)記物，對乳腺癌是否轉(zhuǎn)移 進(jìn)行監(jiān)測和預(yù)警，通過采用免疫組織化學(xué)法和原位分子雜交技術(shù)檢測ZEB-1和ZEB-2在腫瘤 組織中的表達(dá)，監(jiān)測和預(yù)警乳腺癌是否轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，為乳腺癌的合理治療提供新依據(jù)，從而 可以對乳腺癌患者進(jìn)行針對性治療，大大提高了治療效果，改善了患者的預(yù)后，進(jìn)而提高了 患者的生活質(zhì)量。
【附圖說明】
[0044]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0045]圖1是本發(fā)明實(shí)施方法流程簡圖。
【具體實(shí)施方式】
[0046]本發(fā)明提供了一種基于ZEB-1和ZEB-2作為標(biāo)記物預(yù)警乳腺癌轉(zhuǎn)移的方法，本方法 將ZEB-1和ZEB-2作為標(biāo)記物，對乳腺癌是否轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)進(jìn)行監(jiān)測和預(yù)警。對此，做了如下的 研究和實(shí)驗(yàn)：
[0047] 1、首先收集某醫(yī)院病理科近年來臨床與病理資料齊全的女性乳腺癌石蠟標(biāo)本228 例，乳腺良性病變標(biāo)本80例；分析整理出乳腺癌患者的中位年齡，并按WHO (2012年）乳腺腫 瘤中的標(biāo)準(zhǔn)對乳腺癌進(jìn)行分級、分期;并對所有乳腺癌患者進(jìn)行術(shù)后隨訪，整理出復(fù)發(fā)、存 活與死亡人數(shù)。
[0048] 2、對所有石蠟標(biāo)本進(jìn)行4mi厚連續(xù)切片，對切片采用HE染色。
[0049] 3、采用免疫組織化學(xué)法檢測乳腺癌及乳腺良性病變組織中ZEB-1和ZEB-2的蛋白 表達(dá)，其具體步驟如下：
[0050] a.將石蠟切片放入60 °C恒溫烤箱，烘烤時間為2小時以上。
[0051] b.將切片脫蠟與水化:將切片置于二甲苯中浸泡10分鐘，更換二甲苯后再浸泡10 分鐘;置于無水乙醇中浸泡5分鐘;置入95 %乙醇中浸泡5分鐘;置入70 %乙醇中浸泡5分鐘； 置入蒸餾水中浸泡5分鐘。
[0052] c.采用檸檬酸鹽緩沖液高壓抗原修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù):將脫蠟水化的組織切片置 于耐高溫切片架上，同時將PH 6.0的檸檬酸鹽緩沖液在高壓鍋中加熱至沸騰，再將切片架 放入已沸騰的緩沖液中，關(guān)閉高壓鍋直至開始噴氣時，蓋上壓力閥，2分鐘后，將高壓鍋置入 涼水中冷卻直至室溫，將切片取出。
[0053] d.用PBS緩沖液(PH 7.2-7.4)沖洗3次，每次沖洗5分鐘。
[0054] e.切片分別滴加50ul ZEB-1和ZEB-2的一抗試劑，置于4°C環(huán)境下過夜。
[0055] f.次日復(fù)溫30分鐘后，用PBS緩沖液沖洗3次，每次沖洗5分鐘，然后甩去roS緩沖 液。
[0056] g.滴加二抗試劑，二抗試劑采用快捷型酶標(biāo)羊抗和鼠IgG聚合物，在37 °C環(huán)境下孵 育20分鐘。
[0057] h.用PBS緩沖液沖洗3次，每次沖洗5分鐘，然后甩去PBS緩沖液。
[0058] i.每張切片滴加50ul DAB溶液，避光顯色3-10分鐘，在顯微鏡下控制顯色。
[0059] j .置于水下充分沖洗，采用蘇木精復(fù)染，用自來水沖洗返藍(lán)。
[0060] k.將切片經(jīng)梯度酒精干燥，用二甲苯透明，最后用中性樹膠封片。
[0061 ] 4、采用分子原位雜交技術(shù)檢測乳腺癌及乳腺良性病變組織中ZEB-1和ZEB-2的 mRNA表達(dá)，其具體步驟如下：
[0062] a ?將石蠟切片放入60 °C恒溫烤箱過夜。
[0063] b.將切片脫蠟與水化:將切片置于二甲苯中浸泡10分鐘，更換二甲苯后再浸泡10 分鐘;置于無水乙醇中浸泡5分鐘;置入95 %乙醇中浸泡5分鐘;置入70 %乙醇中浸泡5分鐘； 置入DEPC水中浸泡5分鐘。
[0064] c.用0.5M PBS緩沖液沖洗3次，每次沖洗5分鐘。
[0065] d.用3%雙氧水室溫作用10分鐘，用DEPC水沖洗3次，每次沖洗5分鐘。
[0066] e.用3%檸檬酸稀釋的胃蛋白酶(lml 3%檸檬酸滴加2滴濃縮型胃蛋白酶)在37°C 環(huán)境下消化20分鐘。
[0067] f.用0.5M PBS緩沖液沖洗3次，每次沖洗5分鐘，用DEPC水沖洗1次。
[0068] g.滴加預(yù)雜交液50ul/片，置入40 °C-42 °C恒溫箱4小時，然后甩去多余液體。
[0069] h.再次滴加雜交液50ul/片，置入40°C-42°C恒溫箱16-20小時。
[0070] i .用37°C預(yù)溫的2 X SSC緩沖液沖洗2次，每次沖洗5分鐘，再用37°C預(yù)溫的0.5 X SSC緩沖液沖洗3次，每次沖洗5分鐘，再用37 °C預(yù)溫的0.2 X SSC緩沖液沖洗3次，每次沖洗5 分鐘。
[0071 ] j .滴加封閉液，在37 °C環(huán)境下放置30分鐘，然后甩去多余液體。
[0072] k.滴加生物素化鼠抗地高辛，在37°C環(huán)境下放置60分鐘，然后用0.5M PBS緩沖液 沖洗3次，每次沖洗5分鐘。
[0073] 1.滴加SABC，在37 °C環(huán)境下放置20分鐘，然后用0.5M PBS緩沖液沖洗3次，每次沖 洗5分鐘。
[0074] m.滴加生物素化過氧化物酶，在37 °C環(huán)境下放置20分鐘，然后用0.5M PBS緩沖液 沖洗3次，每次沖洗5分鐘，然后甩去PBS緩沖液。
[0075] n.每張切片滴加100ul DAB溶液，避光顯色3-10分鐘，在顯微鏡下控制顯色。
[0076] 〇.置于水下充分沖洗，采用蘇木精復(fù)染，用自來水沖洗返藍(lán)。
[0077] p.將切片經(jīng)梯度酒精干燥，用二甲苯透明，最后用中性樹膠封片。
[0078] 5、觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用spssl3.0統(tǒng)計實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
[0079] 具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如下：
[0080] 表1 :ZEB-l、ZEB-2在乳腺癌組織和良性病變組織中的蛋白表達(dá)及差異
[0082] 表2:ZEB-l、ZEB-2在乳腺癌組織和良性病變組織中的mRNA表達(dá)及差異
[0084]表3:ZEB-l、ZEB-2的蛋白表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理各種參數(shù)之間的關(guān)系

[0087] 表4:ZEB-1、ZEB-2的mRNA表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理各種參數(shù)之間的關(guān)系

[0090] 上述統(tǒng)計數(shù)據(jù)表中采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0091] 6、檢測ZEB-l、ZEB-2的蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)在乳腺良性病變與乳腺癌中存在的差 異，分析兩個指標(biāo)與乳腺癌分期、預(yù)后的關(guān)系。
[0092]通過對乳腺癌和乳腺良性病變臨床樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果表明乳腺癌組ZEB-1和 ZEB-2的蛋白表達(dá)率和mRNA表達(dá)率均顯著高于乳腺良性病變組，通過分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，可以看 出ZEB-1和ZEB-2在乳腺癌組織中的表達(dá)與乳腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率及TM1分期呈正相關(guān)， 因此ZEB-1和ZEB-2可成為有效的腫瘤標(biāo)志物，提示乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。
[0093]根據(jù)上述研究和實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如圖1所示，本發(fā)明提供了一種基于ZEB-1和ZEB-2作為 標(biāo)記物預(yù)警乳腺癌轉(zhuǎn)移的方法，為提示乳腺癌腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)提供生物學(xué)標(biāo)記物，從而 為乳腺癌的合理治療提供新依據(jù)，可以對乳腺癌患者進(jìn)行針對性治療，提高了治療效果，改 善了患者的預(yù)后，進(jìn)而提高了患者的生活質(zhì)量。
[0094]本發(fā)明具體方法如下：
[0095] A.提取手術(shù)后的乳腺癌患者腫瘤組織制成石蠟標(biāo)本。
[0096] B.對石蠟標(biāo)本進(jìn)行4mi厚連續(xù)切片，對切片采用HE染色，便于全面觀察其組織構(gòu) 造。
[0097] C.采用免疫組織化學(xué)法檢測腫瘤組織中ZEB-1和ZEB-2的蛋白表達(dá)，具體步驟如 下：
[0098] a.將石蠟切片放入60 °C恒溫烤箱，烘烤時間為2小時以上。
[0099] b.將切片脫蠟與水化:將切片置于二甲苯中浸泡10分鐘，更換二甲苯后再浸泡10 分鐘;置于無水乙醇中浸泡5分鐘;置入95 %乙醇中浸泡5分鐘;置入70 %乙醇中浸泡5分鐘； 置入蒸餾水中浸泡5分鐘。
[0100] C.采用檸檬酸鹽緩沖液高壓抗原修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù):將脫蠟水化的組織切片置 于耐高溫切片架上，同時將PH 6.0的檸檬酸鹽緩沖液在高壓鍋中加熱至沸騰，再將切片架 放入已沸騰的緩沖液中，關(guān)閉高壓鍋直至開始噴氣時，蓋上壓力閥，2分鐘后，將高壓鍋置入 涼水中冷卻直至室溫，將切片取出。
[0101] d.用PBS緩沖液(PH 7.2-7.4)沖洗3次，每次沖洗5分鐘。
[0102] e.切片分別滴加50ul ZEB-1和ZEB-2的一抗試劑，置于4°C環(huán)境下過夜。
[0103] f.次日復(fù)溫30分鐘后，用PBS緩沖液沖洗3次，每次沖洗5分鐘，然后甩去roS緩沖 液。
[0104] g.滴加二抗試劑，二抗試劑采用快捷型酶標(biāo)羊抗和鼠IgG聚合物，在37°C環(huán)境下孵 育20分鐘。
[0105] h.用PBS緩沖液沖洗3次，每次沖洗5分鐘，然后甩去PBS緩沖液。
[0106] i.每張切片滴加50ul DAB溶液，避光顯色3-10分鐘，在顯微鏡下控制顯色。
[0107] j .置于水下充分沖洗，采用蘇木精復(fù)染，用自來水沖洗返藍(lán)。
[0108] k.將切片經(jīng)梯度酒精干燥，用二甲苯透明，最后用中性樹膠封片。
[0109] D.采用分子原位雜交技術(shù)檢測腫瘤組織中ZEB-1和ZEB-2的mRNA表達(dá)，具體步驟如 下：
[0110] a.將石蠟切片放入60°C恒溫烤箱過夜。
[0111] b.將切片脫蠟與水化:將切片置于二甲苯中浸泡10分鐘，更換二甲苯后再浸泡10 分鐘;置于無水乙醇中浸泡5分鐘;置入95 %乙醇中浸泡5分鐘;置入70 %乙醇中浸泡5分鐘； 置入DEPC水中浸泡5分鐘。
[0112] c.用0.5M PBS緩沖液沖洗3次，每次沖洗5分鐘。
[0113] d.用3%雙氧水室溫作用10分鐘，用DEPC水沖洗3次，每次沖洗5分鐘。
[0114] e.用3%檸檬酸稀釋的胃蛋白酶(lml 3%檸檬酸滴加2滴濃縮型胃蛋白酶)在37°C 環(huán)境下消化20分鐘。
[0115] f.用0.5M PBS緩沖液沖洗3次，每次沖洗5分鐘，用DEPC水沖洗1次。
[0116] g.滴加預(yù)雜交液50ul/片，置入40°C_42°C恒溫箱4小時，然后甩去多余液體。
[0117] h.再次滴加雜交液50ul/片，置入40°C_42°C恒溫箱16-20小時。
[0118] i .用37°C預(yù)溫的2 X SSC緩沖液沖洗2次，每次沖洗5分鐘，再用37°C預(yù)溫的0.5 X SSC緩沖液沖洗3次，每次沖洗5分鐘，再用37 °C預(yù)溫的0.2 X SSC緩沖液沖洗3次，每次沖洗5 分鐘。
[0119] j .滴加封閉液，在37°C環(huán)境下放置30分鐘，然后甩去多余液體。
[0120] k.滴加生物素化鼠抗地高辛，在37°C環(huán)境下放置60分鐘，然后用0.5M PBS緩沖液 沖洗3次，每次沖洗5分鐘。
[0121] 1.滴加SABC，在37 °C環(huán)境下放置20分鐘，然后用0.5M PBS緩沖液沖洗3次，每次沖 洗5分鐘。
[0122] m.滴加生物素化過氧化物酶，在37°C環(huán)境下放置20分鐘，然后用0.5M PBS緩沖液 沖洗3次，每次沖洗5分鐘，然后甩去PBS緩沖液。
[0123] n.每張切片滴加100ul DAB溶液，避光顯色3-10分鐘，在顯微鏡下控制顯色。
[0124] 〇.置于水下充分沖洗，采用蘇木精復(fù)染，用自來水沖洗返藍(lán)。
[0125] p.將切片經(jīng)梯度酒精干燥，用二甲苯透明，最后用中性樹膠封片。
[0126] E.分別觀察經(jīng)過免疫組織化學(xué)法檢測和原位分子雜交技術(shù)檢測的患者腫瘤組織 切片，兩種方法檢測的ZEB-UZEB-2指標(biāo)均以腫瘤組織細(xì)胞核和/或細(xì)胞漿呈黃色或棕黃色 記為陽性表達(dá)，若患者腫瘤組織中ZEB-1、ZEB-2的蛋白表達(dá)和/或mRNA表達(dá)呈陽性，則提示 患者的乳腺癌腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。
[0127] 以上內(nèi)容僅僅是對本發(fā)明結(jié)構(gòu)所作的舉例和說明，所屬本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對 所描述的具體實(shí)施例做各種各樣的修改或補(bǔ)充或采用類似的方式替代，只要不偏離發(fā)明的 結(jié)構(gòu)或者超越本權(quán)利要求書所定義的范圍，均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項】
1. 基于ZEB-I和ZEB-2作為標(biāo)記物預(yù)警乳腺癌轉(zhuǎn)移的方法，其特征在于:該方法將ZEB-I 和ZEB-2作為標(biāo)記物，對患者乳腺癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)進(jìn)行預(yù)警； 該方法包括如下步驟： A. 提取手術(shù)后的乳腺癌患者腫瘤組織制成石蠟標(biāo)本； B. 對石蠟標(biāo)本進(jìn)行4μπι厚連續(xù)切片，對切片采用HE染色； C. 采用免疫組織化學(xué)法檢測患者腫瘤組織中ZEB-I、ZEB-2的蛋白表達(dá)； D. 采用原位分子雜交技術(shù)檢測患者腫瘤組織中ZEB-I和ZEB-2的mRNA表達(dá)； E. 分別觀察經(jīng)過免疫組織化學(xué)法檢測和原位分子雜交技術(shù)檢測的患者腫瘤組織切片， 兩種方法檢測的ZEB-UZEB-2指標(biāo)均以腫瘤組織細(xì)胞核和/或細(xì)胞漿呈黃色或棕黃色記為 陽性表達(dá)，若患者腫瘤組織中ZEB-I、ZEB-2的蛋白表達(dá)和/或mRNA表達(dá)呈陽性，則提示患者 的乳腺癌腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于ZEB-I和ZEB-2作為標(biāo)記物預(yù)警乳腺癌轉(zhuǎn)移的方法，其特 征在于:所述的免疫組織化學(xué)法包括以下步驟： a. 將石蠟切片放入60 °C恒溫烤箱，烘烤時間為2小時以上； b. 將切片脫蠟與水化:將切片置于二甲苯中浸泡10分鐘，更換二甲苯后再浸泡10分鐘； 置于無水乙醇中浸泡5分鐘；置入95%乙醇中浸泡5分鐘；置入70%乙醇中浸泡5分鐘；置入 蒸餾水中浸泡5分鐘； c. 采用檸檬酸鹽緩沖液高壓抗原修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù):將脫蠟水化的組織切片置于耐 高溫切片架上，同時將PH 6.0的檸檬酸鹽緩沖液在高壓鍋中加熱至沸騰，再將切片架放入 已沸騰的緩沖液中，關(guān)閉高壓鍋直至開始噴氣時，蓋上壓力閥，2分鐘后，將高壓鍋置入涼水 中冷卻直至室溫，將切片取出； d. 用PBS緩沖液沖洗3次，每次沖洗5分鐘； e. 切片分別滴加50ul ZEB-I和ZEB-2的一抗試劑，置于4°C環(huán)境下過夜； f. 次日復(fù)溫30分鐘后，用PBS緩沖液沖洗3次，每次沖洗5分鐘，然后甩去PBS緩沖液； g. 滴加二抗試劑，二抗試劑采用快捷型酶標(biāo)羊抗和鼠 IgG聚合物，在37°C環(huán)境下孵育20 分鐘； h. 用PBS緩沖液沖洗3次，每次沖洗5分鐘，然后甩去PBS緩沖液； i .每張切片滴加50ul DAB溶液，避光顯色3-10分鐘，在顯微鏡下控制顯色； j .置于水下充分沖洗，采用蘇木精復(fù)染，用自來水沖洗返藍(lán)； k.將切片經(jīng)梯度酒精干燥，用二甲苯透明，最后用中性樹膠封片。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于ZEB-I和ZEB-2作為標(biāo)記物預(yù)警乳腺癌轉(zhuǎn)移的方法，其特 征在于:所述的原位分子雜交技術(shù)包括以下步驟： a. 將石蠟切片放入60°C恒溫烤箱過夜； b. 將切片脫蠟與水化:將切片置于二甲苯中浸泡10分鐘，更換二甲苯后再浸泡10分鐘； 置于無水乙醇中浸泡5分鐘；置入95%乙醇中浸泡5分鐘；置入70%乙醇中浸泡5分鐘；置入 DEPC水中浸泡5分鐘； c. 用0.5M PBS緩沖液沖洗3次，每次沖洗5分鐘； d. 用3 %雙氧水室溫作用10分鐘，用DEPC水沖洗3次，每次沖洗5分鐘； e. 用3%檸檬酸稀釋的胃蛋白酶在37°C環(huán)境下消化20分鐘； f. 用0.5M PBS緩沖液沖洗3次，每次沖洗5分鐘，用DEPC水沖洗1次； g. 滴加預(yù)雜交液50ul/片，置入40 °C_42 °C恒溫箱4小時，然后甩去多余液體； h. 再次滴加雜交液50ul/片，置入40 °C-42 °C恒溫箱16-20小時； i .用37°C預(yù)溫的2 X SSC緩沖液沖洗2次，每次沖洗5分鐘，再用37°C預(yù)溫的0.5 X SSC緩 沖液沖洗3次，每次沖洗5分鐘，再用37°C預(yù)溫的0.2 X SSC緩沖液沖洗3次，每次沖洗5分鐘； j. 滴加封閉液，在37°C環(huán)境下放置30分鐘，然后甩去多余液體； k. 滴加生物素化鼠抗地高辛，在37 °C環(huán)境下放置60分鐘，然后用0.5MPBS緩沖液沖洗3 次，每次沖洗5分鐘； l. 滴加 SABC，在37°C環(huán)境下放置20分鐘，然后用0.5M PBS緩沖液沖洗3次，每次沖洗5分 鐘； m. 滴加生物素化過氧化物酶，在37 °C環(huán)境下放置20分鐘，然后用0.5MPBS緩沖液沖洗3 次，每次沖洗5分鐘，然后甩去PBS緩沖液； η.每張切片滴加 IOOul DAB溶液，避光顯色3-10分鐘，在顯微鏡下控制顯色； 〇.置于水下充分沖洗，采用蘇木精復(fù)染，用自來水沖洗返藍(lán)； P.將切片經(jīng)梯度酒精干燥，用二甲苯透明，最后用中性樹膠封片。
【文檔編號】G01N33/574GK105911281SQ201610256334
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月21日
【發(fā)明人】趙敏, 王瑾, 黃金, 鄒強(qiáng), 昂琳, 鄭麗, 趙洋, 胡紅光, 劉明強(qiáng), 衛(wèi)宏權(quán), 蘇明琴
【申請人】合肥市第二人民醫(yī)院