一種lc-ms/ms測(cè)定果汁、飲料中萘酚黃s和羅丹明b的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種LC?MS/MS測(cè)定果汁、飲料中萘酚黃S和羅丹明B的方法。本發(fā)明首先超聲除去CO2、水浴加熱提取、離心、上清液調(diào)酸后，然后利用自組裝的固相萃取凈化小柱(陽(yáng)離子交換填料+陰離子交換填料)對(duì)樣品提取液進(jìn)行凈化處理，可在有效除去干擾物的同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)萘酚黃S和羅丹明B的凈化、富集，并采用LC?MS/MS定量測(cè)定。該方法操作簡(jiǎn)單，凈化效果好，靈敏度高，重現(xiàn)性好，符合食品添加劑分析標(biāo)準(zhǔn)，具有一定的新穎性和適用性。
【專利說(shuō)明】
一種LC-MS/MS測(cè)定果汁、飲料中萘酚黃S和羅丹明B的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種果汁、飲料中人工合成著色劑的測(cè)定方法，具體涉及一種果汁、飲 料中萘酚黃S和羅丹明B的固相萃取/LC-MS/MS方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 人工合成著色劑是通過(guò)化學(xué)合成的方法生產(chǎn)的有機(jī)色素，主要以苯、甲苯、萘等芳 烴類(lèi)化工產(chǎn)品為原料，經(jīng)過(guò)磺化、鹵化、偶氮化等一系列有機(jī)反應(yīng)化合而成。其成本低廉、色 澤鮮艷、著色力強(qiáng)、性能穩(wěn)定，在食品生產(chǎn)加工行業(yè)中被廣泛應(yīng)用。但人工合成著色劑大多 為偶氮類(lèi)化合物，過(guò)量食用可對(duì)人體有致畸致癌作用。近年來(lái)，為了加強(qiáng)對(duì)食用合成著色劑 的管理，許多國(guó)家對(duì)食用合成色素的理化性質(zhì)及安全性做了深入細(xì)致的研究，明確限定了 食用合成色素的使用品種、使用范圍及使用量。美國(guó)、歐盟、日韓嚴(yán)禁在加工食品中使用萘 酚黃S和羅丹明B(玫瑰紅B)，我國(guó)GB 2760-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》 批準(zhǔn)使用的著色劑亦不包含萘酚黃S和羅丹明B。
[0003] 萘酚黃S，別名：色酚黃S。英文名稱:Naphthol Yellow S，CAS:846-70-8。它主要用 于生物染色，精液染色。羅丹明B(Rhodamine B)又稱玫瑰紅B，或堿性玫瑰精，俗稱花粉紅， 是一種具有鮮桃紅色的人工合成的染料。羅丹明B在溶液中有強(qiáng)烈的熒光，用作實(shí)驗(yàn)室中細(xì) 胞熒光染色劑、有色玻璃、特色煙花爆竹等行業(yè)。由于萘酚黃S和羅丹明B價(jià)格低廉，可能存 在不法商人違規(guī)添加入食品中的問(wèn)題。為了保障消費(fèi)者的利益，需要對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。
[0004] 目前，國(guó)內(nèi)外用于萘酚黃S和羅丹明B的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法和液相色 譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。N.Yoshioka等報(bào)道了一種測(cè)定飲料和糖果中萘酚黃S等40種人工合成著色 劑的HPLC方法（N.Yoshioka，K. Ichihashi .High-performance liquid chromatography analysis of ten dyes for control of safety of commercial articles[J].Talanta, 2008,74:1408-1413."）。楊建龍等用LC-MS/MS同時(shí)測(cè)定朱砂中摻假染料猩紅808和玫瑰紅 B，它是針對(duì)礦物基質(zhì)的，前處理凈化方法在該文獻(xiàn)中未有報(bào)道（"楊建龍，譚紋.LC-MS/MS同 時(shí)測(cè)定朱砂中摻假染料猩紅808和玫瑰紅B的含量[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2015,8(32): 979-983."）。液相色譜法是食品中人工合成著色劑檢測(cè)應(yīng)用最廣泛的方法，但是缺乏配套 的確證技術(shù)，無(wú)法滿足復(fù)雜的食品基質(zhì)中目標(biāo)物的定性確證要求。已報(bào)道的檢測(cè)食品中合 成著色劑的LC-MS/MS方法，只涉及部分著色劑且無(wú)普適的前處理凈化手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種果汁、飲料中萘酚黃S和羅丹明 B的LC-MS/MS定量測(cè)定方法。該方法對(duì)樣品的前處理、SPE柱凈化、LC-MS/MS定量檢測(cè)果汁、 飲料中萘酚黃S和羅丹明B的方法進(jìn)行了研究，結(jié)果表明該方法靈敏度高，重現(xiàn)性好，操作簡(jiǎn) 單，可廣泛應(yīng)用于果汁、飲料中萘酚黃S和羅丹明B的檢測(cè)。
[0006] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為:一種LC-MS/MS測(cè)定果汁、飲料中萘酚黃S和羅丹明B 的方法，其特征在于，它包括以下步驟：
[0007] (1)制備:含二氧化碳的樣品需超聲除去二氧化碳，含果肉的樣品需搖勻，密封標(biāo) 識(shí)，待用；
[0008] (2)提?。?br>[0009] 含果肉樣品：取步驟（1)樣品，置于離心管中，加入超純水，于50-70Γ水浴超聲提 取10_30min，于離心機(jī)中4000r/min離心5_15min，移取上清液用梓檬酸水溶液調(diào)試pH值至 3-6,得待凈化溶液；
[0010] 不含果肉樣品：取步驟（1)樣品，加入超純水，用檸檬酸水溶液調(diào)試pH值至3-6,得 待凈化溶液；
[0011] (3)凈化：
[0012] a、固相萃取小柱的組裝：取40_60μπι陽(yáng)離子交換填料和40_60μπι陰離子交換填料， 填充于底端為聚乙烯篩板的聚丙烯小柱內(nèi)，填料上端再以聚乙烯篩板固定；
[0013] b、柱活化:將上述固相萃取小柱依次用pH值6-7的水、甲醇活化；
[0014] c、加樣淋洗:轉(zhuǎn)移上述待凈化液至固相萃取小柱，依次用pH值3-6的水、甲醇淋洗 SPE 柱；
[0015] d、洗脫：低真空吹干SPE柱，用氨化甲醇洗脫待分析成分并接收，收集液于50°C氮 氣吹干，加水溶解，渦流混合后過(guò)0.22μπι濾膜，供LC-MS/MS分析。
[0016] (4)檢測(cè):步驟(3)得到的測(cè)樣品用液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)定。
[0017] 優(yōu)選的，具體包括以下步驟：
[0018] (1)制備:含二氧化碳的樣品，取樣品于燒杯中超聲除去二氧化碳;含果肉的樣品， 取樣品搖勻，密封標(biāo)識(shí)，待用；
[0019] ⑵提?。?br>[0020] 含果肉樣品：取步驟（1)樣品10g，置于50mL離心管中，加入25mL超純水，于50-70°C 水浴超聲提取10-30min，于離心機(jī)中4000r/min離心5-15min，移取上清液用梓檬酸水溶液 調(diào)試pH值至3-6，得待凈化溶液；
[0021] 不含果肉樣品：取步驟（1)樣品10g，于25mL容量瓶中，加入10mL超純水，用檸檬酸 水溶液調(diào)試pH值至3-6，然后超純水定容，得待凈化溶液；
[0022] ⑶凈化：
[0023] a、固相萃取小柱的組裝：分別稱取40-80mg 40-60μπι陽(yáng)離子交換填料和40-80mg 40-60μπι陰離子交換填料，填充于底端為聚乙烯篩板的聚丙烯小柱內(nèi)，填料上端再以聚乙烯 篩板固定；
[0024]所述的陽(yáng)離子交換填料為選自苯磺酸鍵合聚苯乙烯二乙烯苯共聚物(PCX)、苯磺 酸鍵合硅膠(SCX)、丙磺酸鍵合硅膠(PRS)中的至少一種;優(yōu)選PCX填料；
[0025]所述的陰離子交換填料為選自丙基乙二胺(PSA)、聚酰胺(PA)、多胺化聚苯乙烯二 乙烯苯共聚物(PWAX)填料中的至少一種;優(yōu)選PWAX填料；
[0026]所述的陽(yáng)離子交換填料和陰離子交換填料的比例為重量比1:0.5~1:2,優(yōu)選1:1; [0027] 進(jìn)一步優(yōu)選，采用60mgPCX+60mgPWAX/6mL自行填制凈化萃取柱對(duì)樣品進(jìn)行凈化處 理；
[0028] b、柱活化:將上述固相萃取小柱依次用4-8mL pH值6-7的水、4-8mL甲醇活化；
[0029] c、加樣淋洗:轉(zhuǎn)移上述待凈化液8-15mL至固相萃取小柱，依次用4-8mL pH值3-6的 水、4-8mL甲醇淋洗SPE柱；
[0030] d、洗脫:低真空吹干SPE柱，用4-8mL 3%-6%的氨化甲醇(優(yōu)選5%氨化甲醇)洗脫 待分析成分并接收，收集液于50 °C氮?dú)獯蹈桑盟ㄈ葜?. OmL，渦流混合后過(guò)0.22μπι濾膜， 供LC-MS/MS分析；
[0031] (4)檢測(cè):步驟(3)得到的測(cè)樣品用液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)定。
[0032] 優(yōu)選的，所述步驟(4)中液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜的儀器參數(shù)條件如下：
[0033]液相色譜條件為： {?；|!ι |]； Thermo Syncronis C18 ill, i-i'H i：> 3.0μητ, 150mm><2. i mm 流動(dòng)相 甲醇(A), 5 mm〇r乙酸銨水溶液(B) 流速 0.25 mL/mia 進(jìn)樣量 5μΙ_. 柱溫 30 C
[0034] 梯度洗脫程序時(shí)間(min) A(%) B(%) 0.00 5 95 5.00 9S 5 9.00 95 5 9.10 5 95 15.00 .5 95
[0035] 質(zhì)譜條件為： 離子源 電噴霧離子源 掃描方式 ES〗源正負(fù)離子分段掃描模式 監(jiān)測(cè)方式 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)
[0036] 電噴霧電壓(IS) 4500 V 離子源溫度(TEM) 500 r 載7〔流速 15 L/min 霧化器壓力 45 psi
[0037] 選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)母離子、子離子和碰撞能量為：
[0038] 名稱 保留時(shí)間(min) 母離子 子離子 去蔟電壓DP(v)碰撞能CE〇) 萘酚黃 S 7.77 335.0 180.0*,232.0 -95 -45, -39 J'； i'J! B 11.6.6 443.! 399.1'355.0 100 58, 80
[0039]本發(fā)明的有益效果：
[0040]本發(fā)明對(duì)果汁、飲料中萘酚黃S和羅丹明B的含量檢測(cè)進(jìn)行了研究，樣品經(jīng)超純水 水浴超聲提取后，用自組裝固相萃取小柱凈化，采用LC-MS/MS定量測(cè)定。該方法可實(shí)現(xiàn)性質(zhì) 不同的人工合成著色劑一次過(guò)柱萃取凈化、一次色譜過(guò)程定量分析，操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、 重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確率較高?？蓮V泛應(yīng)用于復(fù)雜果汁、飲料基質(zhì)中萘酚黃S和羅丹明B的準(zhǔn)確定量 分析，操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、重現(xiàn)性好。
[0041]本發(fā)明利用自組裝的固相萃取凈化小柱對(duì)樣品提取液進(jìn)行凈化處理，且采用陰離 子填料和陽(yáng)離子填料按一定比例混裝的方式制成固相萃取小柱，可在有效除去干擾物的同 時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)不同性質(zhì)人工合成著色劑的凈化、富集，方法靈敏度、準(zhǔn)確度和精確度均符合食品 添加劑分析標(biāo)準(zhǔn)，具有一定的新穎性和適用性。同時(shí)上述方式，相比采用兩根不同的固相萃 取柱分開(kāi)萃取的方式，節(jié)省了時(shí)間和成本。且本發(fā)明自組裝小柱，可以根據(jù)樣品中色素含量 適當(dāng)調(diào)整填料的粒徑和用量，方便適用。本發(fā)明首次使用PWAX柱進(jìn)行固相萃取，它的吸附容 量大，萃取效果好。
[0042]本發(fā)明的方法中，萘酚黃S和羅丹明B同時(shí)進(jìn)行提取、凈化等前處理(本發(fā)明的萘酚 黃S和羅丹明B為非同系物，由于不同物質(zhì)的性質(zhì)不同，在提取的過(guò)程中，很難把所有目標(biāo)物 都提取完全，但是，本發(fā)明的方法，同時(shí)提取、凈化，并且萘酚黃S和羅丹明B提取比較完全， 實(shí)施例中的回收率就可以說(shuō)明這點(diǎn)），并且一次上機(jī)檢測(cè)，節(jié)約時(shí)間和成本。
【附圖說(shuō)明】
[0043] 圖1為甲醇+5mmol乙酸銨水溶液萘酚黃S和羅丹明B的MRM色譜圖；
[0044] 圖2萘酚黃S和羅丹明B特征離子對(duì)色譜圖；
[0045] 圖3果蔬汁樣品中萘酚黃S和羅丹明B的MRM色譜圖；
[0046] 圖4果蔬汁加標(biāo)樣品中萘酚黃S和羅丹明B的MRM色譜圖；
[0047] 圖5是實(shí)施例1的分析色譜圖（果蔬汁）；
[0048] 圖6是實(shí)施例2的分析色譜圖（碳酸飲料）。
【具體實(shí)施方式】
[0049] 為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的 內(nèi)容不僅僅局限于下面的實(shí)施例，實(shí)施例不應(yīng)視作對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。
[0050] 1儀器與試劑
[0051 ] 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀：Aglientl200高效液相色譜儀，API4000質(zhì)譜儀（美國(guó)AB SCIEX) ;MS3渦流混勻器（IKA公司）；恒溫超聲水?。↖KA公司）；高速冷凍離心機(jī)（日本日立公 司）；感量為〇· lmg的分析天平(瑞士梅特勒公司）;Milli-Q純水器(美國(guó)Millipore公司）;N-EVAP24氮吹儀(美國(guó)）；量程為10-100yL、100-1000yL移液槍(Eppendof公司）。
[0052] 喹啉黃S、羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)品（自制）；甲醇：色譜純(Merk公司）；乙腈:色譜純(Merk公 司）；甲酸:色譜純(Merk公司）；乙酸銨:分析純;檸檬酸:分析純;氨水:分析純;無(wú)水乙醇:分 析純；PWAX填料:Agela Technologies公司；PCX填料:Agela Technologies公司；SCX填料： Agela Technologies公司；PRS填料:Agela Technologies公司；NH2氨丙基鍵合硅膠填料： Agela Technologies公司；C18SPE萃取柱:Agela Technologies公司；陽(yáng)離子交換（PCX)SPE 萃取柱:Agela Technologies公司；聚酰胺(PA)SPE萃取柱:Agela Technologies公司。 [0053] 2標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
[0054] 分別稱取萘酚黃S、羅丹明B著色劑標(biāo)準(zhǔn)品lOO.Omg，用水溶解，并定容于lOOmL棕色 容量瓶中，即得l〇〇〇mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。棕色瓶?jī)?chǔ)存于-18°C備用。
[0055] 取空白樣品按上述提取和凈化方法進(jìn)行處理，得到空白基質(zhì)提取凈化液。用該基 質(zhì)溶液稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備制成系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，進(jìn)行LC-MS/MS分析。以標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為 橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制相關(guān)線性方程。
[0056] 3樣品提取與凈化
[0057] 3.1制備:含二氧化碳的樣品，取500mL樣品于燒杯中超聲除去二氧化碳;含果肉的 樣品，取500mL搖勻，密封標(biāo)識(shí)，待用；
[0058] 3.2提?。?br>[0059] 含果肉樣品：取步驟（1)樣品10g，置于50mL離心管中，加入25mL超純水，于50-70°C 水浴超聲提取10-30min，于離心機(jī)中4000r/min離心5-15min，移取上清液用梓檬酸水溶液 調(diào)試pH值至3-6，得待凈化溶液；
[0060] 不含果肉樣品：取步驟（1)樣品10g，于25mL容量瓶中，加入10mL超純水，用檸檬酸 水溶液調(diào)試pH值至3-6，然后超純水定容，得待凈化溶液；
[0061] 3.3凈化：
[0062] 3.3.1固相萃取小柱的組裝：分別稱取40-80mg 40-60μπι陽(yáng)離子交換填料和40- 80mg 40-60μπι陰離子交換填料，填充于底端為聚乙烯篩板的聚丙烯小柱內(nèi)，填料上端再以 聚乙烯篩板固定；
[0063]所述的陽(yáng)離子交換填料為選自苯磺酸鍵合聚苯乙烯二乙烯苯共聚物(PCX)、苯磺 酸鍵合硅膠(SCX)、丙磺酸鍵合硅膠(PRS)中的至少一種，所述的陰離子交換填料為選自丙 基乙二胺(PSA)、聚酰胺(PA)、多胺化聚苯乙烯二乙烯苯共聚物(PWAX)填料中的至少一種； [0064]所述的陽(yáng)離子交換填料和陰離子交換填料的比例為重量比1:0.5~1:2。
[0065] 3.3.2柱活化:將上述固相萃取小柱依次用4-8mL pH值6-7的水、4-8mL甲醇活化；
[0066] 3.3.3加樣淋洗:轉(zhuǎn)移上述待凈化液8-15mL至固相萃取小柱，依次用4-8mL pH值3- 6的水、4-8mL甲醇淋洗SPE柱；
[0067] 3.3.4洗脫:低真空吹干SPE柱，用4-8mL 3%-6%的氨化甲醇洗脫待分析成分并接 收，收集液于50°C氮?dú)獯蹈桑盟ㄈ葜?. OmL，渦流混合后過(guò)0.22μπι濾膜，供LC-MS/MS分 析。
[0068] 4 檢測(cè)
[0069] 待測(cè)樣品用液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)定，儀器參數(shù)條件見(jiàn)下表1，選擇反 應(yīng)監(jiān)測(cè)母離子、子離子和碰撞能量見(jiàn)表2。
[0070]表1液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜的儀器參數(shù)條件
[0071]
[0073] 表2萘酚黃S和羅丹明B的LC-MS/MS分析參數(shù)
[0074]
[0075] 5.結(jié)果與討論
[0076] 5.1色譜質(zhì)譜條件的優(yōu)化
[0077] 5.1.1流動(dòng)相的選擇
[0078] 比較了乙腈+0.1 %甲酸水溶液，甲醇+5mmol/L乙酸銨水溶液，甲醇+0.1 %甲酸水 溶液不同流動(dòng)相對(duì)色譜圖的影響。研究發(fā)現(xiàn)以乙腈+0.1%甲酸水、甲醇+0.1%甲酸水為流 動(dòng)相，目標(biāo)物峰形差，離子化響應(yīng)值低。甲醇+5mmol/L乙酸銨水溶液為流動(dòng)相，目標(biāo)化合物 色譜峰對(duì)稱尖銳，與樣品中基質(zhì)分離效果較好，MRM色譜圖如附圖1所示。
[0079] 5.1.2質(zhì)譜測(cè)定條件的優(yōu)化
[0080] 首先采用濃度為500yg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液以蠕動(dòng)栗連續(xù)進(jìn)樣的方式進(jìn)行母離子全掃 描，確定萘酚黃S和羅丹明B的母離子質(zhì)量數(shù)，然后再以母離子進(jìn)行2級(jí)碰撞掃描，選擇兩個(gè) 豐度比較高的子離子作為定性和定量離子。同時(shí)優(yōu)化質(zhì)譜條件，確定質(zhì)譜最佳條件，建立多 離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式。圖2的下圖為正離子模式下羅丹明B的特征離子色譜；圖2的上圖為負(fù)離 子模式下萘酚黃S的特征離子色譜。
[0081] 5.2樣品基質(zhì)效應(yīng)的消除
[0082]電噴霧離子源(ESI)易受樣品基質(zhì)的影響。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)樣品基質(zhì)對(duì)離子化有抑制 作用，不同樣品基質(zhì)對(duì)萘酚黃S和羅丹明B離子化抑制程度存在差異。為消除樣品基質(zhì)效應(yīng)， 應(yīng)以空白樣品提取液作為標(biāo)注溶液的稀釋液來(lái)消除樣品基質(zhì)效應(yīng)。
[0083] 5.3凈化SPE柱的選擇
[0084]常用來(lái)做色素的SPE凈化萃取柱有陽(yáng)離子交換（如PCX)SPE柱、陰離子交換柱（如 PWAX、PA)SPE柱及C18粉制成的SPE柱等，C18粉具有疏水作用對(duì)非極性的組分有吸附作用， 常用來(lái)去除雜質(zhì)，對(duì)水溶性的著色劑幾乎沒(méi)有吸附能力。根據(jù)著色劑酸堿性的不同，填料有 選擇性的吸附目標(biāo)物，如PCX粉對(duì)目標(biāo)物羅丹明B有很好的吸附，但對(duì)其他酸性著色劑吸附 差;PA粉、PWAX粉對(duì)酸性著色劑有很好的選擇性吸附性。由于2種著色劑中既有酸性也有堿 性化合物，本課題主要研究采用一次過(guò)柱解決凈化問(wèn)題。優(yōu)選地，采用PCX粉:PWAX為填料時(shí) 吸附兩種性質(zhì)的化合物能力最佳，60mgPCX: 60mgPWAX/6mL自行填制凈化萃取柱對(duì)樣品進(jìn)行 凈化處理。
[0085] 5.4洗脫液的選擇
[0086] 本研究測(cè)試了純甲醇洗脫上樣后的SPE柱，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)化合物幾乎洗脫不下來(lái)。比較 1%、2%、4%、5%、6%、10%氨化甲醇作為洗脫液的洗脫效果。發(fā)現(xiàn)同樣取6!1^洗脫液時(shí)， 5 %氨化甲醇能洗脫完全，因此采用5 %氨化甲醇作為洗脫液。
[0087] 5.5方法驗(yàn)證
[0088] 5.5.1方法的線性和檢出限
[0089] 將空白樣品按上述提取和凈化過(guò)程進(jìn)行處理，得到空白基質(zhì)提取凈化液。用該基 質(zhì)溶液將萘酚黃S標(biāo)準(zhǔn)液稀釋成100yg/L，200yg/L，400yg/L，800yg/L，1000yg/L的系列標(biāo)準(zhǔn) 工作液，羅丹明B 標(biāo)準(zhǔn)系列：20yg/L，40yg/L，80yg/L，160yg/L，200yg/L; LC/MS/MS 進(jìn)行分析 后，計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)，見(jiàn)表3。由此可見(jiàn)萘酚黃S和羅丹明B在線性范圍內(nèi)具有 良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為〇. 9981和0.9962。
[0090]方法的檢出限(L0D)以空白樣品基質(zhì)稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度出峰時(shí)，取信噪 比S/N = 3和樣品處理過(guò)程的稀釋倍數(shù)計(jì)算得出。定量限（L0Q)以空白樣品基質(zhì)稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲 線上的最低濃度出峰時(shí)，取信噪比S/N=10和樣品處理過(guò)程的稀釋倍數(shù)計(jì)算得出。具體數(shù)據(jù) 見(jiàn)表3。
[0091]表3萘酚黃S和羅丹明B的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和方法檢出限
[0092]
[0093] 5.5.2回收率和精密度
[0094] 對(duì)果蔬汁和碳酸飲料中進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，由于羅丹明B響應(yīng)值高，添加濃度為5、 10、50yg/kg;萘酚黃S添加濃度分別為50、100、200yg/kg。稱樣后加入標(biāo)準(zhǔn)溶液，渦旋混勻放 置〇.5h后按上文進(jìn)行樣品處理。每個(gè)水平重復(fù)6次，測(cè)精密度。結(jié)果見(jiàn)表4。可見(jiàn)，萘酚黃S和 羅丹明B在果蔬汁和碳酸飲料中添加平均回收率在85.2 % -98.6 %之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)均小于7.0%。
[0095] 表4萘酚黃S和羅丹明B的回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果 「00961
[0098] 5.6方法的應(yīng)用
[0099] 果蔬汁樣品，及加入標(biāo)準(zhǔn)溶液的樣品，按"3樣品提取與凈化"的實(shí)驗(yàn)步驟操作完畢 后上機(jī)，測(cè)得色譜圖如圖3和圖4所示：
[0100]從色譜圖中可以看出，果蔬汁樣品基質(zhì)不干擾萘酚黃S和羅丹明B的測(cè)定，加標(biāo)樣 品回收較好。但羅丹明B在空白中有本底，需要扣空白。
[0101] 實(shí)驗(yàn)表明，采用本法可利用自組裝的固相萃取凈化小柱對(duì)樣品提取液進(jìn)行凈化處 理，可在有效除去干擾物的同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)萘酚黃S和羅丹明B的凈化、富集，并采用LC-MS/MS同 步定量測(cè)定，方法靈敏度、準(zhǔn)確度和精確度均符合食品添加劑分析標(biāo)準(zhǔn)，完全滿足進(jìn)出口食 品的產(chǎn)品質(zhì)量控制要求。
[0102] 實(shí)施例1:
[0103] 果蔬汁樣品中萘酚黃S和羅丹明B的測(cè)定。
[0104] 3樣品提取與凈化
[0105] 3.1提取
[0106] 取搖勻樣品10g，置于50mL離心管中，加入25mL超純水，于60°C水浴超聲提取 15min，于離心機(jī)中4000r/min離心10min，移取上清液用梓檬酸水溶液調(diào)試pH值至3-6,得待 凈化溶液；
[0107] 3.2凈化
[0108] 3.2.1固相萃取小柱的組裝:分別稱取6〇11^4〇-6(^111?0乂陽(yáng)離子交換填料和6〇11^ 40-60μπι PWAX混合型弱陰離子交換填料，填充于底端為聚乙烯篩板的聚丙烯小柱內(nèi)，填料 上端再以聚乙烯篩板固定；
[0109] 3.2.2柱活化:將上述固相萃取小柱依次用6mL pH值6-7的水、6mL甲醇活化；
[0110] 3.2.3加樣淋洗:轉(zhuǎn)移上述待凈化液10mL至固相萃取小柱，依次用6mL pH值4的水、 6mL甲醇淋洗SPE柱； 3.2.4洗脫:低真空吹干SPE柱，用6mL 5 %的氨化甲醇洗脫待分析成分并接收，收 集液于50°C氮?dú)獯蹈桑盟ㄈ葜?. OmL，渦流混合后過(guò)0.22μπι濾膜，供LC-MS/MS分析。 [0112] 4 檢測(cè)
[0113] 待測(cè)樣品用液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)定，儀器參數(shù)條件見(jiàn)表1，選擇反應(yīng) 監(jiān)測(cè)母離子、子離子和碰撞能量見(jiàn)表2;其分析色譜圖如圖5所示，該樣品回收率和精密度實(shí) 驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。
[0114] 實(shí)施例2
[0115] 碳酸飲料樣品中萘酚黃S和羅丹明Β的測(cè)定。
[0116] 3樣品提取與凈化
[0117] 3.1提取
[0118]取500mL樣品于燒杯中超聲除去二氧化碳，密封標(biāo)識(shí)，待用；
[0119] 取樣品10g，于25mL容量瓶中，加入10mL超純水，用檸檬酸水溶液調(diào)試pH值至4，超 純水定容得待凈化溶液；
[0120] 3.2 凈化
[0121] 3.2.1固相萃取小柱的組裝:分別稱取分別稱取6〇11^4〇-6(^111?0乂陽(yáng)離子交換填 料和60mg40-60ymPWAX混合型弱陰離子交換填料，填充于底端為聚乙稀篩板的聚丙稀小柱 內(nèi)，填料上端再以聚乙烯篩板固定；
[0122] 3.2.2柱活化:將上述固相萃取小柱依次用6mL pH值6-7的水、6mL甲醇活化；
[0123] 3.2.3加樣淋洗:轉(zhuǎn)移上述待凈化液10mL至固相萃取小柱，依次用6mL pH值4的水、 6mL甲醇淋洗SPE柱。
[0124] 3.2.4洗脫:低真空吹干SPE柱，用6mL 5 %的氨化甲醇洗脫待分析成分并接收，收 集液于50°C氮?dú)獯蹈桑盟ㄈ葜?. OmL，渦流混合后過(guò)0.22μπι濾膜，供LC-MS/MS分析。
[0125] 4 檢測(cè)
[0126] 待測(cè)樣品用液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)定，儀器參數(shù)條件見(jiàn)表1，選擇反應(yīng) 監(jiān)測(cè)母離子、子離子和碰撞能量見(jiàn)表2;其分析色譜圖如圖6所示，該樣品回收率和精密度實(shí) 驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種LC-MS/MS測(cè)定果汁、飲料中糞酪黃S和羅丹明B的方法，其特征是，包括w下步 驟： (1) 制備:含二氧化碳的樣品超聲除去二氧化碳;含果肉的樣品搖勻;然后密封標(biāo)識(shí)，待 用； (2) 提?。? 含果肉樣品：取步驟（1)樣品，置于離屯、管中，加入超純水，于50-70°C水浴超聲提取，離 屯、，移取上清液用巧樣酸水溶液調(diào)試pH值至3-6,得待凈化溶液； 不含果肉樣品：取步驟（1)樣品，加入超純水，用巧樣酸水溶液調(diào)試pH值至3-6,得待凈 化溶液； (3) 凈化： a、 固相萃取小柱的組裝：取40-60WI1陽(yáng)離子交換填料和40-60WI1陰離子交換填料，填充 于底端為聚乙締篩板的聚丙締小柱內(nèi)，填料上端再W聚乙締篩板固定； 所述的陽(yáng)離子交換填料和陰離子交換填料的比例為重量比1:0.5~1:2; b、 柱活化:將上述固相萃取小柱依次用pH值6-7的水、甲醇活化； C、加樣淋洗:轉(zhuǎn)移步驟(2)的待凈化溶液至固相萃取小柱，依次用pH值3-6的水、甲醇淋 洗固相萃取小柱； d、洗脫：吹干固相萃取小柱，用氨化甲醇洗脫待分析成分并接收，收集液氮?dú)獯蹈桑?水溶解，滿流混合后過(guò)0.22皿濾膜，供LC-MS/MS分析； (4) 檢測(cè):步驟(3)得到的測(cè)樣品用液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)定。2. 如權(quán)利要求1所述的一種LC-MS/MSii定果汁、飲料中糞酪黃巧日羅丹明B的方法，其特 征是，所述步驟(4)中液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜的儀器參數(shù)條件如下： 液相色譜條件為： 色巧化 Thermo SyncronisC18 色的化，3.0μιη，ISOmmXllmm 流動(dòng)相 甲醇，5 mmol己酸錢(qián)水溶液 流姐 0.25 niL/min 進(jìn)樣量 5yL 柱溫 30-C 梯度洗脫程序時(shí)間腳虹)甲醇(％) 5 mm礎(chǔ)乙酸錠水溶液(％) 0.00 5 95 5.00 95 5 9.00 05 5 9.10 5 95 15.00 5 95 質(zhì)譜條件為： 爲(wèi)予瓣 電晴霧機(jī)子源 掃描方式 E巧源正負(fù)離子分段掃描模式 監(jiān)測(cè)方式 多麼應(yīng)監(jiān)測(cè) 電噴霧電壓 4500 V 離子源溫度 500 ? 載氣流速 13 L/ffiin 霧化器拒力 45psi,3. 如權(quán)利要求2所述的一種LC-MS/MSii定果汁、飲料中糞酪黃巧日羅丹明B的方法，其特 征是，糞酪黃S和羅丹明B的LC-MS/MS分析參數(shù)如下表：4. 如權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的一種LC-MS/MS測(cè)定果汁、飲料中糞酪黃S和羅丹明 B的方法，其特征是，所述的陽(yáng)離子交換填料為選自苯橫酸鍵合聚苯乙締二乙締苯共聚物 PCX、苯橫酸鍵合硅膠SCX、丙橫酸鍵合硅膠PRS中的至少一種。5. 如權(quán)利要求4所述的一種LC-MS/MSii定果汁、飲料中糞酪黃巧日羅丹明B的方法，其特 征是，所述的陽(yáng)離子交換填料為苯橫酸鍵合聚苯乙締二乙締苯共聚物PCX填料。6. 如權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的一種LC-MS/MS測(cè)定果汁、飲料中糞酪黃S和羅丹明 B的方法，其特征是，所述的陰離子交換填料為選自丙基乙二胺PSA、聚酷胺PA、多胺化聚苯 乙締二乙締苯共聚物PWAX填料中的至少一種。7. 如權(quán)利要求4所述的一種LC-MS/MSii定果汁、飲料中糞酪黃巧日羅丹明B的方法，其特 征是，所述的陰離子交換填料為多胺化聚苯乙締二乙締苯共聚物PWAX填料。8. 如權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的一種LC-MS/MS測(cè)定果汁、飲料中糞酪黃S和羅丹明 B的方法，其特征是， (1) 制備:含二氧化碳的樣品，取樣品于燒杯中超聲除去二氧化碳;含果肉的樣品，取樣 品搖勻，密封標(biāo)識(shí)，待用； (2) 提?。? 含果肉樣品：取步驟(1)樣品1 Og，置于50mL離屯、管中，加入25mL超純水，于50-70°C水浴 超聲提取10-30min，于離屯、機(jī)中4000r/min離屯、5-15min，移取上清液用巧樣酸水溶液調(diào)試 pH值至3-6，得待凈化溶液； 不含果肉樣品：取步驟（1)樣品lOg，于25mL容量瓶中，加入lOmL超純水，用巧樣酸水溶 液調(diào)試pH值至3-6，然后超純水定容，得待凈化溶液； (3) 凈化： 曰、固相萃取小柱的組裝:分別稱取40-80mg 40-60皿陽(yáng)離子交換填料和40-80mg 40-60 Ml陰離子交換填料，填充于底端為聚乙締篩板的聚丙締小柱內(nèi)，填料上端再W聚乙締篩板 固定； b、柱活化:將上述固相萃取小柱依次用4-8mL pH值6-7的水、4-8mL甲醇活化； C、加樣淋洗:轉(zhuǎn)移步驟(2)的待凈化溶液8-15mL至固相萃取小柱，依次用4-8mL抑值3- 6的水、4-8mL甲醇淋洗固相萃取小柱； d、洗脫:低真空吹干固相萃取小柱，用4-8mL 3%-6%的氨化甲醇洗脫待分析成分并接 收，收集液于50°C氮?dú)獯蹈?，用水定容?. OmL，滿流混合后過(guò)0.22皿濾膜，供LC-MS/MS分 析； (4)檢測(cè):步驟(3)得到的測(cè)樣品用液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)定。9. 如權(quán)利要求8所述的一種LC-MS/MSii定果汁、飲料中糞酪黃巧日羅丹明B的方法，其特 征是，所述洗脫步驟采用5 %氨化甲醇。10. 如權(quán)利要求8所述的一種LC-MS/MS測(cè)定果汁、飲料中糞酪黃S和羅丹明B的方法，其 特征是，分別稱取60mg 40-60皿苯橫酸鍵合聚苯乙締二乙締苯共聚物PCX填料和60mg40-60 μπι多胺化聚苯乙締二乙締苯共聚物PWAX填料。
【文檔編號(hào)】G01N30/06GK105974020SQ201610309440
【公開(kāi)日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年5月11日
【發(fā)明人】鄭新華, 王樂(lè), 何桂華, 韓煥美
【申請(qǐng)人】濟(jì)南出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心