一種心腦血管疾病特異性檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種心腦血管疾病特異性檢測(cè)試劑盒，所述的試劑盒中的適配子能夠高效的特異性的結(jié)合ApoBl00。該適體的獲得是應(yīng)用新的組合化學(xué)技術(shù)SELEX，以ApoBl00為靶目標(biāo)，從隨機(jī)文庫(kù)中篩選出了能與ApoBl00特異性結(jié)合的適配子。通過適配子特異性的結(jié)合ApoBl00，從而定量血清中ApoBl00的含量，從而能夠快速高效的初步篩選心腦血管疾病。該試劑盒制備簡(jiǎn)單，成本低廉，適宜于大面積的推廣使用，具有極高的應(yīng)用前景。
【專利說明】
一種心腦血管疾病特異性檢測(cè)試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種心腦血管疾病特異性檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]心腦血管疾病是一種嚴(yán)重威脅人類，特別是50歲以上中老年人健康的常見病，全 世界每年死于心腦血管疾病的人數(shù)高達(dá)1500萬(wàn)人，居各種死因首位。心腦血管疾病具有"發(fā) 病率高、致殘率高、死亡率高、復(fù)發(fā)率高，并發(fā)癥多" 8卩"四高一多"的特點(diǎn)，目前，我國(guó)心腦血 管疾病患者已經(jīng)超過2.7億人!每年死于心腦血管疾病近300萬(wàn)人，占我國(guó)每年總死亡病因 的51 %。而幸存下來(lái)的患者75%不同程度喪失勞動(dòng)能力，心腦血管疾病已成為人類死亡的 重要?dú)⑹郑?br>[0003]載脂蛋白B(Apolipoprotein Β,Αρο B)是血楽脂蛋白中蛋白質(zhì)的一種，根據(jù)氨基 酸組成和分布分為Β 100、Β 48、Β 74、Β 26和Β 50五種亞型。載脂蛋白Β100(Αρο Β100)是低 密度脂蛋白（Low density lipoprotein, LDL)、中密度脂蛋白（Intermediated densitylipoprotein，IDL)和極低密度脂蛋白（Very low density lipoprotein,VLDL)顆 粒上主要的載脂蛋白，由肝臟合成，含有4563個(gè)氨基酸殘基，分子量約為510KDa。
[0004] ΑροΒ作為動(dòng)脈硬化、冠心病等的危險(xiǎn)因子，其與動(dòng)脈粥樣硬化型心血管疾病之間 有著密切關(guān)系，其功能之一是攜帶膽固醇，因此ΑροΒ在血液中的含量可作為膽固醇等脂類 的指標(biāo)?；加屑毙孕募」Ｋ?、心腦疾病患者、動(dòng)脈硬化癥、高脂血癥、糖尿病、慢性腎功能不 全等疾病ΑροΒ含量出現(xiàn)增高。
[0005] Apo Biqq與載脂蛋白Al(Apolipoprotein Α1)的比值(Αρο Β/Α1)在臨床上是心腦 血管疾病檢測(cè)的重要指標(biāo)，與心肌梗塞、缺血性中風(fēng)有緊密的聯(lián)系，是微蛋白尿、糖尿病和 新陳代謝綜合癥的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因子。所以Αρο Β.水平的檢測(cè)對(duì)疾病的早期預(yù)測(cè)有一定的意 義。
[0006] 目前在臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)Αρο Β100的方法主要是放射免疫分析(RIA)、免疫比濁法 和酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)，其中RIA必須用放射性元素標(biāo)記，檢測(cè)設(shè)備復(fù)雜昂貴，其放射 性元素的半衰期短，不能長(zhǎng)期保存，檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定，同時(shí)存在放射性污染也給實(shí)驗(yàn)操作人 員帶來(lái)了傷害;酶免疫分析法靈敏度低，影響因素較多，易造成假陰性和假陽(yáng)性。
[0007] SELEX技術(shù)是20世紀(jì)90年代初發(fā)展起來(lái)的一種新的組合化學(xué)技術(shù)。利用該技術(shù)可 以從隨機(jī)單鏈寡核苷酸庫(kù)中篩選到特異性與靶物質(zhì)高度親和的核酸適配體。其基本思路是 體外化學(xué)合成一個(gè)單鏈寡核苷酸庫(kù)，與靶物質(zhì)混合，形成靶物質(zhì)-核酸復(fù)合物，洗脫未結(jié)合 的核酸，分離與靶物質(zhì)結(jié)合的核酸分子，并以此核酸分子為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再進(jìn)入下輪 的篩選。通過重復(fù)的篩選與擴(kuò)增，一些與靶物質(zhì)不結(jié)合或與靶物質(zhì)有低親和力、中親和力的 核酸分子被洗去，而與革G物質(zhì)有強(qiáng)未和力的核酸分子從非常大的隨機(jī)庫(kù)中分尚出來(lái)，且純 度隨SELEX過程的進(jìn)行而增高，最后占據(jù)庫(kù)的大多數(shù)（>90%左右）。自Tuerk和Ellington等 首先運(yùn)用此技術(shù)篩選到特異性吸附噬菌體T4DNA聚合酶和有機(jī)染料分子的特異核酸適配體 后，經(jīng)過十幾年的發(fā)展，SELEX技術(shù)已經(jīng)成為一種重要的研宄手段和工具。因此，采用selex 技術(shù)，篩選特定的結(jié)合Apo B100的適配體具有較為重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案通過以下步驟實(shí)現(xiàn)：
[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種Apo B100的核酸適配體序列。
[00?0]本發(fā)明中，所述的Apo B100的核酸適配體(序列1-21)能夠特異結(jié)合Apo B100。
[0011] 本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供所述核酸適配體序列的用途。本發(fā)明中根據(jù)對(duì)該序 列應(yīng)用，可進(jìn)一步用于制備特異性結(jié)合Apo B100的試劑盒。
[0012] 從體外合成的隨機(jī)寡聚DNA文庫(kù)，（5 '-TTGGACATGAACCAACGTTA-N35-CGACCATGACAACGGCTGAA-3 '），其中N35為35個(gè)隨機(jī)寡核苷酸;從中篩選出與APO B100特異結(jié) 合的核酸適配體；將篩選出的序列用引物P 1 : TTGGACATGAACCAACGTTA ;引物P2 : TTCAGCCGTTGTCATGGTCG，進(jìn)行擴(kuò)增并進(jìn)行TA克隆入pMD19-T載體(購(gòu)自上海博光生物公司）， 轉(zhuǎn)化DH5a細(xì)菌(購(gòu)自北京天根生物公司）；挑去白色菌落進(jìn)行PCR確定陽(yáng)性克隆后，抽提質(zhì)粒 并測(cè)序反應(yīng)，上測(cè)序儀測(cè)序。
[0013] 本發(fā)明采用核酸適配體的體外篩選（SELEX)技術(shù)，以APO B100為正篩靶標(biāo)篩選與 APO B100特異結(jié)合的核酸適配體，制得具有特異結(jié)合APO B100的序列，本發(fā)明中命名為適 配體APO B100-1~21。序列如下：
[0014] ApoB100-l：
[0015] TTGGACATGAACCAACGTTAACTACTTACTAACCCCCTCTTAAATTTATCACACTCGACCATGACAACG GCTGAA
[0016] ApoB100-2：
[0017] TTGGACATGAACCAACGTTAAAAAACCCAACACCTCCTCTCCCTCCTAAATACAACGACCATGACAACG GCTGAA
[0018] ApoB100-3：
[0019] TTGGACATGAACCAACGTTATCTTACATAAATAACAAATCCTCCCACACACCCACCGACCATGACAACG GCTGAA
[0020] ApoB100-4：
[0021] TTGGACATGAACCAACGTTACTACTACCCTCTCCTTTACTCCTCATAAATCCAATCGACCATGACAACG GCTGAA
[0022] ApoB100-5：
[0023] TTGGACATGAACCAACGTTATCCCTACTCAATTAATACTAATACCATAATACTTCCGACCATGACAACG GCTGAA
[0024] ApoB100-6：
[0025] TTGGACATGAACCAACGTTATTCTTCCAACCTTACCTTCCAAACATCCCCCTATACGACCATGACAACG GCTGAA
[0026] ApoB100-7：
[0027] TTGGACATGAACCAACGTTAACACTAAACATCTTACACTCTCTTTTAACCTCATCCGACCATGACAACG GCTGAA
[0028] ApoB100-8：
[0029] TTGGACATGAACCAACGTTATACCTCTTAAACAATCCTATATACTACCTCTACAACGACCATGACAACG GCTGAA
[0030] ApoB100-9：
[0031] TTGGACATGAACCAACGTTATACTAATACATTTTACTCCAATATTCATAATACCACGACCATGACAACG GCTGAA
[0032] ApoB100-10：
[0033] TTGGACATGAACCAACGTTATAAAATATTTCAATCTCTCTCTATATCATTCCTCCCGACCATGACAACG GCTGAA
[0034] ApoB100-ll：
[0035] TTGGACATGAACCAACGTTATTTATTACCCTTCAATCACAACACCATTATACTATCGACCATGACAACG GCTGAA
[0036] ApoB100-12：
[0037] TTGGACATGAACCAACGTTAATCTTTCCCAACCTCAATTCCATCCATTCTTAATCCGACCATGACAACG GCTGAA
[0038] ApoB100-13：
[0039] TTGGACATGAACCAACGTTAATCACTACCATTAACTCTAACACTTTCCCCCCCTCCGACCATGACAACG GCTGAA
[0040] ApoB100-14：
[0041] TTGGACATGAACCAACGTTAATACTTTAATTTAACTCCACTACTCACTCAATCTTCGACCATGACAACG GCTGAA
[0042] ApoB100-15：
[0043] TTGGACATGAACCAACGTTATCCCCCCTCCACACCTCTCCCCTTACATTTTATCCCGACCATGACAACG GCTGAA
[0044] ApoB100-16：
[0045] TTGGACATGAACCAACGTTAAATCTCATACCATTATCAATCCCATACCATCCATACGACCATGACAACG GCTGAA
[0046] ApoB100-17：
[0047] TTGGACATGAACCAACGTTACTTATCCCAATTTTCTCTTCAACATAAACAATCATCGACCATGACAACG GCTGAA
[0048] ApoB100-18：
[0049] TTGGACATGAACCAACGTTATTCTATTATATCCACTAATCAAACCCATAAACTATCGACCATGACAACG GCTGAA
[0050] ApoB100-19：
[0051] TTGGACATGAACCAACGTTATCTTCTATCATTTAACCTTTCCTCCCAACACACCACGACCATGACAACG GCTGAA
[0052] ApoB100-20：
[0053] TTGGACATGAACCAACGTTATCATCTACTCTTCTCTCCAACTTCTACATAAAAACCGACCATGACAACG GCTGAA
[0054] ApoB100-21：
[0055] TTGGACATGAACCAACGTTAAATTCACCTAAACTTTCTTCCTCCATACCTATACCCGACCATGACAACG GCTGAA
[0056] 本發(fā)明的適配子可以用于構(gòu)建試劑盒，該試劑盒可以用于特異性的分離和定量檢 測(cè)APO B100,具有分離效果快，效率高，節(jié)省時(shí)間，節(jié)約成本的功效。具有極強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值。 [0057]本發(fā)明的有益效果：（1)獲得了一種能夠特異高效結(jié)合APO B100的適配子。該適配 子可以大量人工制備，方法簡(jiǎn)單，成本低廉。（2)以核酸適配子為基礎(chǔ)可以制備成為特異性 檢測(cè)APO B100的試劑盒。
【具體實(shí)施方式】
[0058] 實(shí)施例1:核酸適配體篩選
[0059] 從體外合成的隨機(jī)寡聚DNA文庫(kù)，5 ' -TTGGACATGAACCAACGTTA-NSS-CGACCATGACAACGGCTGAA』 ， 。
[0060] 所用引物：
[0061 ] F:5，-TTGGACATGAACCAACGTTA-3
[0062] R:5，-TTCAGCCGTTGTCATGGTCG-3
[0063] (1)AP0 B100蛋白溶于200μ1 PBS后加入96孔ELISA板中，4°C過夜。
[0064] (2)蛋白包被孔用PBS洗滌6次后，加入200μ1 3%BSA(購(gòu)自上海生工），孵育2小時(shí)。 同時(shí)，空白96孔ELISA板中加入200μ1 3%BSA 37°C孵育2小時(shí)。
[0065] (3)將隨機(jī) ssDNA 文庫(kù)（首輪用量為 800pmol)溶于 200μ1 1*SHCMK，95°C 變性 5min。 立即置于冰上lOmin，使其迅速降至室溫，避免ssDNA復(fù)性成雙鏈。
[0066] (4)將ssDNA加入PBS洗滌6次的空白ELISA孔中，37°C孵育2小時(shí)。
[0067] (5)上清轉(zhuǎn)入PBS洗滌6次的蛋白包被孔中，37 °C孵育2小時(shí)后PBS洗滌6次。
[0068] (6)結(jié)合了 ssDNA的酶標(biāo)孔用200i 11洗脫緩沖液重懸，95 °C加熱5min，取上清，經(jīng)過 乙醇沉淀DNA，溶于Mi 11 ipore水中，作為下一輪篩選的模板。
[0069] (8)取5μ1 PCR產(chǎn)物上樣于5wt%瓊脂糖(購(gòu)自上海生工），觀察條帶位置是否正確。 從首輪之后，投入的ssDNA次級(jí)庫(kù)的量逐漸減少，如此反復(fù)進(jìn)行14個(gè)循環(huán)。
[0070] 第14輪篩選產(chǎn)物的擴(kuò)增和純化:將第14輪篩選得到的ssDNA序列，用引物P1，引物 P2進(jìn)行擴(kuò)增。100μΙ PCR擴(kuò)增后體系加入500pl結(jié)合液BB(20mmol/L Hepes(pH7.35)， 120mmol/LNaCl，5mmol/LKCl，lmmol/LCaC12，lmmol/LMgC12，1 %BSA)，充分混勻。將上一步 所得溶液加入吸附柱EC中（吸附柱放入收集管中），室溫放置lmin，12000rpm離心30~60s， 倒掉收集管中的廢液。加入700pmol漂洗WB(結(jié)合液88+0.05%了《661120)，12000印111離心308， 棄掉廢液。加入500pmol漂洗液WB，12000rpm離心30s，棄掉廢液。將吸附柱EC放回空收集管 中，12000rpm離心2min。取出吸附柱EC，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加 20pmol 65°C水浴預(yù)熱的洗脫緩沖液EB，室溫放置2min，12，OOOrpm離心lmin。將得到的溶液 重新加入吸附柱中，再次離心lmin。
[0071] PCR純化產(chǎn)物的克隆:取ΙμL擴(kuò)增產(chǎn)物，與載體PGM-T在T4DNA連接酶的作用下連接， 再將其轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞，取適當(dāng)體積均勻涂布于含有IPTG、x-gal、抗生素(Amp)(它們分 別購(gòu)自于上海生工）的LA平板，倒置培養(yǎng)皿，于37°C培養(yǎng)12-16小時(shí)進(jìn)行〃藍(lán)-白斑篩選〃。測(cè) 序：用接種環(huán)挑取篩選平板上的單個(gè)白色菌落于含Amp的LB液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)過夜。取 菌液lml于離心管中，封膜后送上海生工測(cè)序。
[0072]測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中有21個(gè)核酸適配體序列與APO B100具有非常強(qiáng)的親和性，該21 個(gè)序列分別是:SEQ ID NO :1-21所示。
[0073]實(shí)施例2特異性高親和力的APO B100結(jié)合適配子的性能測(cè)定 [0074] 將RNA適配子分別取1.5yg，用牛小腸堿性磷酸酶(CIP) 37 °C消化lh，純化回收去磷 酸化的RNA;通過T4多核苷酸激酶標(biāo)記[γ -32P]ATP于去磷酸化的RNA分子末端。lOnmol放射 性標(biāo)記的RNA適配子分別與不同濃度（1-200ηΜ)的APO B100蛋白37°C孵育30min，各組反應(yīng) 液經(jīng)硝酸纖維素膜濾過，洗滌濾膜，干燥濾膜，液閃計(jì)數(shù)儀測(cè)定濾膜上殘留的放射量，同一 樣品平行做兩次測(cè)定。計(jì)算各個(gè)適配子與APO B100蛋白的解離常數(shù)。結(jié)果如下：
[0075]
[0076]
[0077] 實(shí)施例3所述適配子特異性分析以及穩(wěn)定性分析
[0078] 從以上結(jié)果可以看出，本發(fā)明的21個(gè)適配子具有非常強(qiáng)的結(jié)合特性，現(xiàn)有技術(shù)中 也沒有所述結(jié)合特性的適配子能夠結(jié)合APO B100蛋白。
[0079]實(shí)施例4降解活性分析
[0080] 分別采用人血白蛋白，APO B48、AP0 B74、AP0 B26和APO B50與21條適配子進(jìn)行特 異性檢測(cè)，經(jīng)過結(jié)合試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這些適配子都不與這些蛋白相結(jié)合，而只與APO B100蛋白結(jié) 合保持較高的特異性。
[0081] 將所述的適配子，取〇.2ug，分別置于常溫的血清、水溶液中，放置二周。通過RT-PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)二周的放置其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，沒有被降解。
[0082]實(shí)施例5臨床試驗(yàn)分析
[0083]取105組臨床血清樣本，患有心腦疾病的患者100例作為實(shí)驗(yàn)樣本，5例為正常人。 [0084] 將21個(gè)適配子分別與標(biāo)準(zhǔn)品APO B100蛋白通過免疫磁珠分離的方式構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品 檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后將105組臨床血清樣本分別去10μ1加入到無(wú)菌離心管中，加入PBS溶 液震蕩溶解。分別將偶聯(lián)有磁珠的21組適配子與105組的血清溶液混合孵育20分鐘(一種適 配子對(duì)應(yīng)檢測(cè)5組血清樣本），而后磁分離，即可獲得相應(yīng)的分離的APO Β100蛋白，通過標(biāo)準(zhǔn) 曲線濃度檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其檢測(cè)的濃度與實(shí)際相符，比采用"雙抗夾心法"檢測(cè)試劑盒檢測(cè)的濃 度還要精確，由此可見，可以實(shí)現(xiàn)100%的定量檢測(cè)效果。具有極高的準(zhǔn)確性。其中，100組心 腦疾病患者的APO Β100蛋白濃度明顯高于對(duì)照的5組50%-200%，具有極大的差異顯著性， 說明可以用于檢測(cè)分析。
[0085]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種心腦血管疾病特異性檢測(cè)試劑盒，其特征:其包含核酸適體。2. 如權(quán)利要求1所示的試劑盒，其特征在于:所述核酸適體序列如SEQ ID NO: 1-21任一 項(xiàng)所示。3. -種檢測(cè)心腦血管疾病的方法，其特征在于：使用權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所示的試劑 盒。
【文檔編號(hào)】C12N15/115GK105974125SQ201610340463
【公開日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年5月22日
【發(fā)明人】杜護(hù)俠
【申請(qǐng)人】杜護(hù)俠