一種環(huán)境與食品中多種內(nèi)分泌干擾物的檢測(cè)分析方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種環(huán)境與食品中多種內(nèi)分泌干擾物的檢測(cè)分析方法，該檢測(cè)分析方法利用4’?碳酰氯?羅丹明作為衍生試劑，超聲輔助?原位衍生?分散液液微萃取聯(lián)合超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)的多種內(nèi)分泌干擾物進(jìn)行分析。本發(fā)明首次使用含有一個(gè)分子內(nèi)永久正電荷的4’?碳酰氯?羅丹明作為衍生試劑，測(cè)定23種內(nèi)分泌干擾物，采用串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，結(jié)合內(nèi)標(biāo)法定量，該方法環(huán)境友好、簡(jiǎn)單快速、靈敏度高、選擇性好，回收率結(jié)果良好，且有效降低了實(shí)際樣品的基質(zhì)干擾。本方法適用于多種環(huán)境和食品樣品中內(nèi)分泌干擾物的檢測(cè)分析，對(duì)于環(huán)境和食品的監(jiān)督和評(píng)價(jià)提供了一種準(zhǔn)確、可靠的技術(shù)手段。
【專利說(shuō)明】
一種環(huán)境與食品中多種內(nèi)分泌干擾物的檢測(cè)分析方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種環(huán)境與食品中多種內(nèi)分泌干擾物的 檢測(cè)分析方法，尤其是涉及一種利用4'-碳酰氯-羅丹明作為衍生試劑，超聲輔助-原位衍 生-分散液液微萃取聯(lián)合超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)的多種內(nèi)分泌干擾物分析方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 內(nèi)分泌干擾物（Endocrine disruptors chemicals，EDCs)，又稱環(huán)境雌激素，是 一類能模擬和干擾人或動(dòng)物體內(nèi)雌激素的正常合成、運(yùn)輸、結(jié)合等過(guò)程的外源性干擾物質(zhì)， 主要包括生物體內(nèi)存在的雌酮(Ε1)、17β-雌二醇(E2)、雌三醇(E3)，以及人工合成的17α-乙 炔雌二醇(ΕΕ2)、己烯雌酚(DES)、烷基酚、雙酚Α(ΒΡΑ)、對(duì)羥基苯甲酸酯類、多氯聯(lián)苯、多溴 聯(lián)苯、二惡英、鄰苯二甲酸酯等相關(guān)化合物。近年來(lái)，因其分布廣泛，能在極低的濃度產(chǎn)生內(nèi) 分泌干擾效應(yīng)，已引起人們的廣泛關(guān)注和深入研究。研究結(jié)果表明，EDCs與不孕癥，性早熟， 糖尿病，肥胖癥以及前列腺癌，乳腺癌等內(nèi)分泌失調(diào)相關(guān)疾病密切相關(guān)。
[0003] 但多種內(nèi)分泌干擾物在環(huán)境與食品中的濃度極低，通常為ng/L甚至pg/L，且受環(huán) 境復(fù)雜基質(zhì)干擾較大，因此，建立快速、高效的環(huán)境與食品前處理技術(shù)及儀器分析方法十分 必要。中國(guó)專利（CN102043028A)公開(kāi)了一種利用N，0-雙(三甲基硅基）三氟乙酰胺(BSTFA) 與吡啶作為衍生試劑，通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)雌酮和17β_雌二醇、乙烯雌酚、壬基酚、 辛基酚分析檢測(cè)方法，衍生時(shí)間長(zhǎng)，且衍生試劑易水解，靈敏度低；中國(guó)專利 (CN103185762A)利用丹酰氯衍生食品中的雌酮和17β-雌二醇、乙烯雌酚、辛基酚，但該方法 衍生反應(yīng)溫度高，時(shí)間長(zhǎng)，且試劑本身及衍生產(chǎn)物易分解。因此，開(kāi)發(fā)一種衍生反應(yīng)條件溫 和、快速、靈敏度高、多種成分同時(shí)檢測(cè)的分析方法，對(duì)于環(huán)境和食品中內(nèi)分泌干擾物檢測(cè) 分析具有十分重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，首次使用了4'-碳酰氯-羅丹明作為 衍生試劑對(duì)內(nèi)分泌干擾物進(jìn)行原位衍生，通過(guò)內(nèi)標(biāo)法定量，建立一種簡(jiǎn)單、快速、高靈敏、多 成分同時(shí)檢測(cè)的超聲輔助-原位衍生-分散液液微萃取聯(lián)合超高效液相色譜三重四極桿質(zhì) 譜檢測(cè)的分析方法。利用溴苯作萃取劑，替代了傳統(tǒng)的毒性強(qiáng)的氯代溶劑，具有環(huán)境友好的 優(yōu)點(diǎn)。
[0005] 本發(fā)明為了實(shí)現(xiàn)上述目的所采用的技術(shù)方案為： 本發(fā)明提供了一種環(huán)境與食品中多種內(nèi)分泌干擾物的檢測(cè)分析方法，所述的內(nèi)分泌干 擾物通過(guò)與衍生劑4'-碳酰氯-羅丹明進(jìn)行超聲輔助-原位衍生-分散液液微萃取，得到的衍 生化產(chǎn)物經(jīng)濾膜過(guò)濾后利用超高效液相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行分析檢測(cè)。
[0006] 上述檢測(cè)分析方法具體通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)的： a.超聲輔助-原位衍生-分散液液微萃取過(guò)程:取10-100 UL標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液或待測(cè)樣 品，加入30 yL內(nèi)標(biāo)物溶液、800-1000 yL pH 8.0-11.5的NaHC03-Na2C03緩沖溶液，加入離 心管中，最后注入60-200 uL萃取劑和200-300 uL 4'-碳酰氯-羅丹明-分散劑溶液，搖勻后 密封，在溫度10-60 °C水浴中超聲波振蕩反應(yīng)1-5分鐘；離心分離，所得沉積相取出后用乙 腈定容到200 uL，得衍生化產(chǎn)物溶液； 所述內(nèi)標(biāo)物溶液是由10 μL濃度為lX10_5mol/L雌酚酮-2,4，16，16-(14、10仙濃度為1 父10-5!11〇1/1雙酚厶-(116和10汕濃度為1\10-5111〇1/1甲基-4-羥基苯甲酸酯-2,3,5,6-(14組 成； 所述的萃取劑為1-溴-3-甲基丁烷，溴環(huán)己烷，溴苯和1-溴丁烷； 所述的分散劑為丙酮，乙腈，甲醇或乙醇； b.將步驟a中的衍生化產(chǎn)物溶液經(jīng)濾膜過(guò)濾后利用超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜系 統(tǒng)進(jìn)行定性定量分析檢測(cè)。
[0007] 進(jìn)一步的，所述待測(cè)樣品中的內(nèi)分泌干擾物包括雌酮、17β-雌二醇、雌三醇、17α-乙炔雌二醇、己烯雌酚、壬基酚、辛基酚、雙酚Α、2,2-二(4-羥基苯基)丁烷、4,4'_亞乙基雙 苯酚、4,4二羥基二苯基甲烷、4,4_二羥基二苯砜、六氟雙酸A、4,4'-(l-苯乙基）雙酚、4-溴 雙酚Α、及對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、對(duì)羥基苯甲酸異丙 酯、對(duì)羥基苯甲酸丁酯、對(duì)羥基苯甲酸異丁基酯、對(duì)羥基苯甲酸芐酯、三氯生。
[0008] 進(jìn)一步的，步驟a中所述的萃取劑最優(yōu)化的為溴苯;所述分散劑最優(yōu)化的為乙腈。
[0009] 進(jìn)一步的，步驟a所述的4'-碳酰氯-羅丹明-分散劑溶液的摩爾濃度為IX 10-2 mol/L〇
[0010] 本發(fā)明所使用的衍生試劑4'-碳酰氯-羅丹明采用以下方法制備而成：將0.922 g 4'_羧基-羅丹明加入30 mL氯化亞砜，滴入0.1 mL N，N-二甲基甲酰胺，磁力攪拌，升溫至50 ~80°C，反應(yīng)5~6 h，減壓蒸除氯化亞砜，冷卻至室溫，得紫色固體，用乙醚重結(jié)晶，得紫色 針狀晶體即為4'-碳酰氯-羅丹明。
[0011]進(jìn)一步的，步驟a中，所述超聲波頻率為40 KHz。
[0012]本發(fā)明所使用的超高效液相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)中色譜分離使用安捷 倫SB C18色譜柱:2.1 mm X 50 mm，1.8 μπι，進(jìn)樣體積為2 yL，柱溫30°C，采用梯度洗脫法。 [0013] 上述的梯度洗脫法，時(shí)間為20 min，流速為0.2 mL/min，流動(dòng)相A為5%乙腈水溶液 含有0.1%甲酸，流動(dòng)相B為乙腈含有0.1%甲酸，0 min流動(dòng)相組成為80%A+20%B，5 min時(shí)65%A +35%B，10 min時(shí)15%A+85%B，15 min時(shí)5%A+95%B，20 min時(shí)0%A+100%B。
[0014] 進(jìn)一步的，所述的超高效液相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行分析檢測(cè)時(shí)的質(zhì) 譜的條件為:干燥氣溫度300°C，流速10 L/min，噴霧器氣壓40 psi，鞘氣溫度280°C，流速11 L/min，毛細(xì)管電壓3.5 kV。
[0015] 本發(fā)明流動(dòng)相中各分?jǐn)?shù)均指體積分?jǐn)?shù)。
[0016] 所述的目標(biāo)分析物結(jié)構(gòu)式如下所示：
本發(fā)明首次使用含有一個(gè)分子內(nèi)永久正電荷的4'-碳酰氯-羅丹明衍生化試劑，因此， 內(nèi)分泌干擾物通過(guò)衍生化反應(yīng)得到的衍生物進(jìn)行檢測(cè)時(shí)能夠特異性的產(chǎn)生含有羅丹明結(jié) 構(gòu)的子離子，帶來(lái)顯著的質(zhì)譜增敏檢測(cè)效果。以特征離子對(duì)及保留時(shí)間進(jìn)行定性和定量，結(jié) 合內(nèi)標(biāo)法，帶來(lái)了該檢測(cè)方法極好的靈敏度、選擇性和準(zhǔn)確度，并且大大降低了基質(zhì)效應(yīng)。 23種內(nèi)分泌干擾物和3種內(nèi)標(biāo)物中都含有酚羥基，能夠與衍生化試劑4'-碳酰氯-羅丹明迅 速皮應(yīng)，以雌酮為例，4 碳酰氳-眾丹明作為衍?；噭┑难芘；?yīng)忖趕如下所示：
本發(fā)明采用超聲輔助-原位衍生-分散液液微萃取技術(shù)提取富集生活廢水、河流沉積 物、魚(yú)肉等實(shí)際樣品中的內(nèi)分泌干擾物，具有簡(jiǎn)單、快速、高效、綠色等優(yōu)點(diǎn)。原位衍生化聯(lián) 合超聲輔助-分散液液微萃取是一種良好的富集痕量組分、降低基質(zhì)干擾、提高方法靈敏度 的前處理技術(shù)，聯(lián)合超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)多種內(nèi)分泌干擾物，具有顯著優(yōu) 勢(shì)。
[0017] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及有益效果： 1.本發(fā)明首次使用環(huán)境友好的4'-碳酰氯-羅丹明為衍生化試劑，衍生化反應(yīng)條件溫 和，反應(yīng)速度快，衍生產(chǎn)物穩(wěn)定，顯著提高了分析物的色譜分離度和檢測(cè)靈敏度。
[0018] 2.本發(fā)明所提供的超聲輔助-原位衍生-分散液液微萃取的前處理技術(shù)，聯(lián)合超 高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)手段，具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、高靈敏、環(huán)境友好的優(yōu)點(diǎn)。
[0019] 3.本發(fā)明的檢測(cè)分析方法成功應(yīng)用于可能含有內(nèi)分泌干擾物的生活廢水、河流 沉積物、魚(yú)肉等多種實(shí)際樣品，分析方法適用性好。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1為實(shí)施例1中23種內(nèi)分泌干擾物和3種內(nèi)標(biāo)物衍生物的質(zhì)譜檢測(cè)分離圖。
[0021] 圖2為實(shí)施例1中雌酮衍生物質(zhì)譜裂解機(jī)理示意圖。
[0022] 圖3為實(shí)施例2廢水中內(nèi)分泌干擾物和內(nèi)標(biāo)物的衍生物質(zhì)譜檢測(cè)分離圖譜。
[0023]
【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的闡述，下述說(shuō)明僅為了解釋本發(fā)明，并不 對(duì)其內(nèi)容進(jìn)行限定。
[0025]本發(fā)明中衍生化萃取物經(jīng)0.45 μπι濾膜過(guò)濾后利用超高效液相色譜三重四極桿串 聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行分析檢測(cè)。
[0026]本發(fā)明所使用的衍生化試劑4'-碳酰氯-羅丹明合成方法如下:將0.922 g 4'-羧 基-羅丹明（2 mmol，合成方法參考
【申請(qǐng)人】發(fā)表的論文Journal of Chromatography A, 2016, 1437: 49-57. ),30.0 mL氯化亞砜加入100 mL單口燒瓶中，滴入0.1 mL Ν,Ν-二甲基 甲酰胺，磁力攪拌，升溫至50~80°C，反應(yīng)5~6 h，減壓蒸除氯化亞砜，冷卻至室溫，得紫色 固體。用乙醚重結(jié)晶，得到0.42 g紫色針狀晶體即為4'-碳酰氯-羅丹明，收率45.5%。
[0027] 實(shí)施例1 23種內(nèi)分泌干擾物和3種內(nèi)標(biāo)物的色譜分離和質(zhì)譜定性定量分析： 23種內(nèi)分泌干擾物和3種內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)品（購(gòu)自Sigma和Aladdin試劑公司）用乙腈配制 得到濃度為1.0 X ΠΓ5 mol/L的內(nèi)分泌干擾物標(biāo)準(zhǔn)品溶液，從每個(gè)單標(biāo)儲(chǔ)備液中各取0.2 mL定容至10 mL得到內(nèi)分泌干擾物的混標(biāo)儲(chǔ)備液。4'-碳酰氯-羅丹明溶于乙腈得到1.0 X 1(T2 mol/L衍生試劑乙腈溶液;取70 uL標(biāo)準(zhǔn)品溶液置于1.5 mL的離心管中，加入30 uL內(nèi)標(biāo) 物溶液（內(nèi)標(biāo)物溶液為10 μL濃度為1X10_5 mol/L雌酚酮-2,4，16，16-(14、10燦濃度為1\ 10-5111〇1/1雙酚八-(1 16、10汕濃度為1\10-5111〇1/1甲基-4-羥基苯甲酸酯-2,3,5,6-(14)，加 入1000 1^似!10)3-似20)3(?!19.5)緩沖溶液，隨后立即加入90 1^溴苯(作為萃取劑，當(dāng)該 處萃取劑改用1-溴-3-甲基丁烷，溴環(huán)己烷或1-溴丁烷時(shí)，分析物萃取效率處于溴苯做萃取 劑時(shí)的40-92%之間）和200 uL摩爾濃度為IX 1(T2 mol/L 4'-碳酰氯-羅丹明-乙腈溶液（乙 腈作為分散劑，當(dāng)該處分散劑改用丙酮，甲醇或乙醇時(shí)，分析物萃取效率處于乙腈做分散劑 時(shí)的45-89%之間），漩渦混勻器震蕩5 s使溶液混合均勻。在25 °C超聲振蕩1 min后，高速離 心2 min，轉(zhuǎn)速12000 r/min。有機(jī)相沉積在離心管底部，用微量注射器吸取沉積相轉(zhuǎn)移至另 一小瓶中，用乙腈定容至200 yL。衍生化產(chǎn)物溶液經(jīng)有機(jī)系濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣2 yL，進(jìn)行 UHPLC-MS/MS(MRM)分析檢測(cè)，所述的梯度洗脫法，時(shí)間為20 min，流速為0.2 mL/min，流動(dòng) 相A為5%乙腈水溶液含有0.1%甲酸，流動(dòng)相B為乙腈含有0.1%甲酸，0 min流動(dòng)相組成為80%A +20%B，5 min時(shí)65%A+35%B，10 min時(shí)15%A+85%B，15 min時(shí)5%A+95%B，20 min時(shí)0%A+100%B; 質(zhì)譜的條件為:干燥氣溫度300°C，流速10 L/min，噴霧器氣壓40 psi，鞘氣溫度280°C，流速 11 L/min，毛細(xì)管電壓3.5 kV。
[0028] 按照上述梯度洗脫程序能得到較好的分離度，圖1為23種內(nèi)分泌干擾物和3種內(nèi)標(biāo) 物衍生物的質(zhì)譜檢測(cè)分離圖，26種分析物之間分離度良好。質(zhì)譜分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，23種內(nèi) 分泌干擾物和3種內(nèi)標(biāo)物多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)下產(chǎn)生相同的主要子離子《/z 443.10和《/z 398.10398.10用作定量子離子，ffi/z 443.10用作定性子離子。以雌酮衍生物為例，圖2 為雌酮衍生物質(zhì)譜裂解機(jī)理示意圖，母離子為[M]+聲么695.38能夠產(chǎn)生兩個(gè)特異性子離 子ffi/z 443.10和ffi/z 398.10。對(duì)11?1模式的參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，23種內(nèi)分泌干擾物和3種內(nèi) 標(biāo)物衍生物的定量離子對(duì)、定性離子對(duì)、最優(yōu)化碎裂電壓(V)和電離能(V)，以及分析方法的 線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限見(jiàn)表1。
[0029] 表 1
實(shí)施例2 生活廢水中內(nèi)分泌干擾物的檢測(cè)分析，包括以下操作步驟： 取1000 UL生活廢水用0.45 μπι水系濾膜過(guò)濾，加HC1調(diào)節(jié)pH至6.0,然后取100 uL水樣 置于1.5 mL離心管中，加入30 uL內(nèi)標(biāo)物溶液（10 uL濃度為lXl(T5m〇l/L雌酚酮_2,4，16， 16-(14、10口1濃度為1\10- 5111〇1/1雙酸厶-(116、10仙濃度為1\10-5111〇1/1甲基-4-羥基苯甲 酸酯-2,3,5,6-(14)，加入800仙恥!10)3-恥20)3(?!111.5)緩沖溶液，并快速注入含200燦 溴苯及300 uL摩爾濃度為1 X l(r2m〇l/L的4'-碳酰氯-羅丹明-乙腈溶液，漩渦混勻器震蕩5 s使溶液混合均勾。在25 °C超聲振蕩1 min后，高速離心2 min，轉(zhuǎn)速12000 r/min。有機(jī)相沉 積在離心管底部，用微量注射器吸取沉積相轉(zhuǎn)移至另一小瓶中，用乙腈定容至200 uL，按照 上述液相、質(zhì)譜條件進(jìn)行UHPLC-MS/MS(MRM)分析。檢測(cè)到某生活廢水中內(nèi)分泌干擾物含量 (n=3)分別為：E1 7.6 ng/L、E2 5.5 ng/L、0P 4.0 ng/L、NP 5.8 ng/L、BPA 21 ng/L、 BPF1.15 ng/L、BPS 0.51 ng/L、BPAF 23.2 ng/L、MeP 1.1 ng/L、iPrP 3.4 ng/L、BuP 62.5 ng/L、iBuP 50.2 ng/L、TCS 72 ng/L，該樣品質(zhì)譜檢測(cè)圖見(jiàn)圖3。
[0030] 實(shí)施例3 河流沉積物中內(nèi)分泌干擾物的檢測(cè)，包括以下操作步驟： 參考文獻(xiàn)(Jot/r/jai 〇/ CAroffiaiograjPAj 兒2013，1305: 17-26)，取河流沉積物樣品 0.8 g置于20 mL離心管中，加入3 mL甲醇，進(jìn)行30 min超聲波提取，離心10 min，過(guò)濾，并轉(zhuǎn) 移上清液到小瓶中，如上所述，殘留物再次萃取;上清液合并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至1 mL左右，用超純 水定容至10 mL，取90 yL置于1.5 mL離心管中，加入30 yL內(nèi)標(biāo)物溶液（10 yL濃度為1X10 -5πιο1/??·_-2,4，16，16-(?4、10μυ^?5*1Χ10- 5πιο1/Ι4Χ·Α-(116、10μυ^?5*1Χ10-5 mol/L甲基-4 -羥基苯甲酸酯-2,3,5,6-d4)，加入900 yL pH 8.0的NaHC03-Na2⑶3緩沖溶 液，并快速注入含120 yLl-溴-3-甲基丁烷及200 uL摩爾濃度為lXl(T2m〇l/L的4'-碳酰 氯-羅丹明-乙腈溶液，漩渦混勻器震蕩5 s使溶液混合均勻；在60 °C超聲振蕩1 min后，高 速離心2 min，轉(zhuǎn)速12000 r/min。有機(jī)相沉積在離心管底部，用微量注射器吸取沉積相轉(zhuǎn)移 至另一小瓶中，用乙腈定容至200 uL，按照上述液相、質(zhì)譜條件進(jìn)行UHPLC-MS/MS(MRM)分 析。檢測(cè)到某河底污泥中11種內(nèi)分泌干擾物含量(n=3)分別為：EE2 0.08 ng/g、0P 1.0 ng/g、NP 2.7 ng/g、BPA 17.6 ng/g、BPF 5.84 ng/g、BPS 2.1 ng/g、BPAF 74.7 ng/g、 TBBPA 1.2 ng/g、MeP 0.19 ng/g、PrP 0.47 ng/g、TCS 2.93 ng/g。
[0031] 實(shí)施例4 魚(yú)肉中內(nèi)分泌干擾物的檢測(cè)，包括以下操作步驟： 參考文獻(xiàn)兒2013，1305: 17-26)，0.8 g魚(yú)肉樣品放入 一個(gè)5 mL離心管中，加入1 mL超純水混合，放在在微波爐30 s，之后加入3 mL甲醇，將混合 物超聲萃取30 min。然后在4C高速冷凍離心10 min，在冰箱4C放置1 h后將上清液通過(guò)0.45 μπι有機(jī)系濾膜過(guò)濾去除懸浮脂質(zhì)。提取物旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，并用超純水稀釋到40 mL。然后 取10 UL倒入1.5 mL離心管中，加入30 yL內(nèi)標(biāo)物溶液（10 yL濃度為lX10_5mol/L雌酚酮-2,4，16，16-d4、10 yL濃度為 1X10-5mol/L雙酚A-di6、10 yL濃度為 1X10-5mol/L甲基-4 -羥基苯甲酸酯-2,3,5,6-d4)，加入1000 yL pH 9.5的NaHC03-Na2C03緩沖溶液，并快速注入 含60 uL溴苯及200 uL摩爾濃度為1ΧΠΓ2 mol/L的4'-碳酰氯-羅丹明-乙腈溶液，漩渦混勻 器震蕩5 s使溶液混合均勻。在室溫10 °C下超聲輔助反應(yīng)5 min后，形成均勻的乳濁液體 系，高速離心2 min，轉(zhuǎn)速12000 r/min。有機(jī)相沉積在離心管底部，用微量注射器吸取沉積 相轉(zhuǎn)移至另一小瓶中，用乙腈定容至200 nL，按照上述液相、質(zhì)譜條件進(jìn)行UHPLC-MS/MS (MRM)分析檢測(cè)，未檢測(cè)到某魚(yú)肉中含有內(nèi)分泌干擾物。
[0032] 對(duì)比例1 該對(duì)比例過(guò)程與實(shí)施例2相同，不同在于衍生化反應(yīng)過(guò)程中，衍生化試劑與衍生條件采 用中國(guó)專利(CN103185762A)公開(kāi)的丹酰氯作為衍生試劑。 對(duì)比例2 該對(duì)比例過(guò)程與實(shí)施例2相同，不同在于衍生化反應(yīng)過(guò)程中，衍生化試劑與衍生條件采 用中國(guó)專利（CN102043028A)公開(kāi)的N，0-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺作為衍生化試 劑。
[0033] 對(duì)比例3 該對(duì)比例操作步驟與實(shí)施例2相同，不同在于樣品前處理過(guò)程中，采用中國(guó)專利（CN 105334282A)公開(kāi)的未使用衍生試劑衍生和未進(jìn)行超聲輔助-分散液液微萃取。
[0034] 對(duì)比例4 該對(duì)比例過(guò)程與實(shí)施例2相同，不同在于樣品前處理過(guò)程中，采用中國(guó)專利（CN 105334282A)公開(kāi)的未使用衍生試劑衍生和未進(jìn)行超聲輔助-分散液液微萃取。
[0035]下表2為實(shí)施例2同對(duì)比例1-4的試驗(yàn)結(jié)果對(duì)比。
[0036]表2
從表2中可以看出，與相關(guān)報(bào)道相比，本發(fā)明利用4'-碳酰氯-羅丹明進(jìn)行衍生化方法， 衍生條件溫和、快速，靈敏度高，4'-碳酰氯-羅丹明衍生化方法的檢出限比對(duì)比例低10-100 倍左右。超聲輔助-原位衍生-分散液液微萃取技術(shù)的回收率結(jié)果良好，對(duì)分析方法的準(zhǔn)確 度提供了保障。
[0037]為了驗(yàn)證所建立的分析方法的適用性，對(duì)準(zhǔn)確度、精密度，以及實(shí)施例2-4三類實(shí) 際樣品中的回收率和基質(zhì)效應(yīng)都進(jìn)行了詳細(xì)考察，結(jié)果見(jiàn)表3。
[0038]表3
由表2和表3可知，對(duì)于實(shí)際樣品中23種內(nèi)分泌干擾物，其線性范圍在0.007-200 ng/L， 檢出限分布于0.002-0.015 ng/L之間，定量限分布于0.007-0.059 ng ml/1之間。結(jié)果表明， 所建立的分析方法靈敏度高，回收率好，有效降低了基質(zhì)干擾，能夠很好地應(yīng)用于檢測(cè)上述 三種實(shí)際樣品中的多種內(nèi)分泌干擾物的含量。
[0039]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受實(shí)施例的限 制，其它任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所做的改變、修飾、組合、替代、簡(jiǎn)化均應(yīng)為 等效替換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種環(huán)境與食品中多種內(nèi)分泌干擾物的檢測(cè)分析方法，其特征在于:所述的內(nèi)分泌 干擾物通過(guò)與衍生劑4'-碳酰氯-羅丹明進(jìn)行超聲輔助-原位衍生-分散液液微萃取，得到的 衍生化產(chǎn)物經(jīng)濾膜過(guò)濾后利用超高效液相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行分析檢測(cè)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)分析方法，其特征在于，具體包括以下步驟： a. 超聲輔助-原位衍生-分散液液微萃取過(guò)程:取10-100 uL標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液或待測(cè)樣 品，加入30 yL內(nèi)標(biāo)物溶液、800-1000 yL pH 8.0-11.5的NaHC03-Na2C03緩沖溶液，加入離 心管中，最后注入60-200 uL萃取劑和200-300 uL 4'-碳酰氯-羅丹明-分散劑溶液，搖勻后 密封，在溫度10-60 °C水浴中超聲波振蕩反應(yīng)1-5分鐘；離心分離，所得沉積相取出后用乙 腈定容到200 uL，得衍生化產(chǎn)物溶液； 所述內(nèi)標(biāo)物溶液是由10 μL濃度為lX10_5mol/L雌酚酮-2,4，16，16-(14、10仙濃度為1 父10-5!11〇1/1雙酚厶-(116和10汕濃度為1\10-5111〇1/1甲基-4-羥基苯甲酸酯-2,3,5,6-(14組 成； 所述的萃取劑為1-溴-3-甲基丁烷，溴環(huán)己烷，溴苯和1-溴丁烷； 所述的分散劑為丙酮，乙腈，甲醇或乙醇； b. 將步驟a中的衍生化產(chǎn)物溶液經(jīng)濾膜過(guò)濾后利用超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜系 統(tǒng)進(jìn)行定性定量分析檢測(cè)。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)分析方法，其特征在于，所述待測(cè)樣品中的內(nèi)分泌干擾物 包括雌酮、17β_雌二醇、雌三醇、17α-乙炔雌二醇、己烯雌酚、壬基酚、辛基酚、雙酸A、2,2_二 (4-羥基苯基）丁烷、4，4 亞乙基雙苯酚、4，4二羥基二苯基甲烷、4，4-二羥基二苯砜、六氟 雙酸A、4,4'-(l-苯乙基）雙酚、4-溴雙酸A、及對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、對(duì)羥 基苯甲酸丙酯、對(duì)羥基苯甲酸異丙酯、對(duì)羥基苯甲酸丁酯、對(duì)羥基苯甲酸異丁基酯、對(duì)羥基 苯甲酸芐酯、三氯生。4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的檢測(cè)分析方法，其特征在于，步驟a中所述的萃取劑為溴 苯;所述分散劑為乙腈。5. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的檢測(cè)分析方法，其特征在于:步驟a所述的4碳酰氯-羅丹 明-分散劑溶液的摩爾濃度為1 X ΠΓ2 mol/L。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)分析方法，其特征在于，所述4'-碳酰氯-羅丹明采用以下 方法制備而成:將0.922 g 4'-羧基-羅丹明加入30 mL氯化亞砜，滴入0.1 mL N，N-二甲基 甲酰胺，磁力攪拌，升溫至50~80°C，反應(yīng)5~6 h，減壓蒸除氯化亞砜，冷卻至室溫，得紫色 固體，用乙醚重結(jié)晶，得紫色針狀晶體即為4'-碳酰氯-羅丹明。7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)分析方法，其特征在于：步驟a中，所述超聲波頻率為40 KHz〇8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的檢測(cè)分析方法，其特征在于:所述的超高效液相色譜 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)中色譜分離使用安捷倫SB C18色譜柱:2.1 mm X 50 mm，1.8 μ m，進(jìn)樣體積為2 yL，柱溫30°C，采用梯度洗脫法。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測(cè)分析方法，其特征在于：所述的梯度洗脫法，時(shí)間為20 min，流速為0.2 mL/min，流動(dòng)相A為5%乙腈水溶液含有0.1%甲酸，流動(dòng)相B為乙腈含有0.1% 甲酸，0 min流動(dòng)相組成為80%A+20%B，5 min時(shí)65%A+35%B，10 min時(shí) 15%A+85%B，15 min時(shí)5% A+95%B，20 min時(shí)0%A+100%B。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK106018612SQ201610466428
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年6月24日
【發(fā)明人】趙先恩, 魏娜, 王仁君, 顏平, 王玉花, 和永瑞, 宋翠華, 朱樹(shù)蕓, 尤進(jìn)茂
【申請(qǐng)人】曲阜師范大學(xué)