一種壬基酚同分異構(gòu)體混合物的單克隆抗體的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是關(guān)于一種壬基酚同分異構(gòu)體混合物的單 克隆抗體的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 壬基酚（NP)是一種重要的化工原料和化學(xué)合成中間體，同時(shí)也是一種重要的環(huán) 境內(nèi)分泌干擾物，為淡黃色或無(wú)色液體，稍帶苯酚氣味，相對(duì)分子質(zhì)量為220. 24,不溶于水， 溶于二甲基亞砜、甲醇或丙酮等有機(jī)溶劑，具有較強(qiáng)的疏水性，在環(huán)境和紡織物中，其由非 離子表面活性劑壬基酚聚氧乙烯醚（ΝΡηΕΟ,η表示乙烷基的數(shù)目，為1-20)降解而來(lái)。不 僅難以降解，而且具有較強(qiáng)的雌激素效應(yīng)和生物毒性。對(duì)藻類、林蛙蝌蚪、斑馬魚等水生生 物的性別分化和繁殖產(chǎn)生重大影響，并通過(guò)生物鏈的累積對(duì)人類健康產(chǎn)生潛在危害。因此， 部分國(guó)家和地區(qū)對(duì)環(huán)境和紡織物中的ΝΡ含量作出了嚴(yán)格限制：我國(guó)在2011年初發(fā)布的 《中國(guó)嚴(yán)格限制進(jìn)出口的有毒化學(xué)品目錄》中首次將ΝΡ列為禁止進(jìn)出口的物質(zhì)；加拿大環(huán) 境保護(hù)法將ΝΡ列為第二大優(yōu)先控制的污染物；美國(guó)環(huán)保局提出在淡水中ΝΡ含量不應(yīng)高于 6. 6μg/L，在咸水中不應(yīng)高于1. 7μg/L;歐盟早在2003年正式頒布REACH法規(guī)要求ΝΡ作 為成品或原料，其濃度等于或大l〇〇〇mg/kg時(shí)，不得在市場(chǎng)上銷售或使用；瑞典于2013年提 交了相應(yīng)的REACH法規(guī)附件XV卷宗，其指出在限制條款生效60個(gè)月后，如果產(chǎn)品中含有NP 和ΝΡΕ0的單一濃度或濃度和等于或高于100mg/kg，則這些紡織品將不得投放市場(chǎng)。
[0003] NP由苯酚基團(tuán)和壬烷基鏈組成。由于壬烷基鏈可以與酚羥基的鄰位和對(duì)位兩個(gè)連 接位點(diǎn)連接以及壬烷基鏈自身直鏈和支鏈的多樣性，導(dǎo)致了壬基酚具有多種同分異構(gòu)體。 其中對(duì)位NP(4-NP)占NP的90-93 %，而鄰位NP(2-NP)只占NP的3-6 %。通過(guò)氣相色譜-質(zhì) 譜法研究發(fā)現(xiàn)，4-NP具有21種同分異構(gòu)體（表一），各同分異構(gòu)體所占比例不同。環(huán)境和 紡織物中的NP是多種同分異構(gòu)體的混合物，給NP含量的檢測(cè)帶來(lái)眾多困難。
[0004] 表一部分壬基酚同分異構(gòu)體
[0005]
[0006] NP的定量檢測(cè)技術(shù)的研究具有較強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。紡織物中NP的檢測(cè)方法也越趨 多樣化，較為成熟的方法是高效液相色譜法（HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS)、氣相 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS)等傳統(tǒng)儀器檢測(cè)方法。這些方法較為費(fèi)時(shí)、費(fèi)力且對(duì)儀器要求 較高。近些年來(lái)，眾多免疫學(xué)檢測(cè)方法被用于對(duì)NP含量的檢測(cè)，其中最常見的是酶聯(lián)免疫 吸附法（ELISA)，免疫學(xué)方法通常具有方便、快捷和高靈敏度等特點(diǎn)。而基于免疫學(xué)或分子 材料的其他方法也開始陸續(xù)出現(xiàn)，如化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)法、生物傳感器免疫分析法、超臨界 流體色譜法、分子印跡法等。其中最常用的方法是HPLC和GC-MS，而酶聯(lián)免疫吸附法近年 來(lái)得到廣大研究者的青睞。而目前市場(chǎng)上的單克隆抗體僅識(shí)別九碳直鏈NP或?qū)盘贾ф?NP識(shí)別較差，因此制備對(duì)整個(gè)NP同分異構(gòu)體混合物具有高親和力的單克隆抗體的顯得尤 其重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種壬基酚同分異構(gòu)體混合物的單克隆抗體的制備方法， 以克服現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述缺點(diǎn)和不足。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0009] -種壬基酚同分異構(gòu)體混合物的單克隆抗體的制備方法，將NP結(jié)構(gòu)類似物與載 體蛋白的偶聯(lián)物作為完全抗原免疫小鼠獲得抗NP同分異構(gòu)體混合物的單克隆抗體。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明，所述方法包括如下步驟：
[0011] 步驟一、將NP結(jié)構(gòu)類似物與載體蛋白的偶聯(lián)物作為完全抗原免疫小鼠；
[0012] 步驟二、將被免疫動(dòng)物的脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合；
[0013] 步驟三、篩選融合的雜交瘤細(xì)胞，獲得特異性的抗NP同分異構(gòu)體混合物的單克隆 抗體。
[0014] 進(jìn)一步的，所述載體蛋白選自：BSA和/或0VA。
[0015] 進(jìn)一步的，所述NP結(jié)構(gòu)類似物為對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)羥基苯丙酸和5-(4-羥基苯基） 戊酸。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明，還包括步驟四，所述步驟四為單克隆抗體的純化。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明，所述單克隆抗體的純化包括如下步驟：
[0018] 步驟A、沉淀法粗提取抗體；
[0019] 步驟B、蛋白G親和層析純化。
[0020] 本發(fā)明的單克隆抗體的有益效果是：
[0021] 1、采用了NP結(jié)構(gòu)類似物與載體蛋白偶聯(lián)作為完全抗原免疫小鼠，制備識(shí)別整個(gè) NP同分異構(gòu)體混合物的單克隆抗體，與市場(chǎng)上僅識(shí)別九碳直鏈NP或?qū)盘贾ф淣P識(shí)別較 差的單抗相比，此抗體具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，為環(huán)境和紡織物中NP含量檢測(cè)做出貢獻(xiàn)；
[0022] 2、采用本發(fā)明的方法獲得的單克隆抗體，其特異性好，且靈敏度高，適用范圍廣， 特別適用于NP含量的檢測(cè)，具有良好的應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0023] 圖1為完全抗原與BSA蛋白SDS-PAGE電泳圖。
[0024] 圖2為完全抗原與BSA蛋白全波段紫外掃描圖。
[0025] 圖3為血清抗體效價(jià)圖。
[0026] 圖4為單克隆抗體間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本 發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0028] 以下實(shí)施例所采用的壬基酚（NP)均為NP同分異構(gòu)體混合物；
[0029] 實(shí)施例1完全抗原的合成
[0030] 完全抗原的合成步驟如下：
[0031] (1)取20mg載體蛋白BSA和20mg載體蛋白0VA，分別溶于2mLddH20中，記為A液；
[0032] (2)分別取20mg半抗原對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)羥基苯丙酸和5-(4-羥基苯基）戊酸，分 別溶于 5mL偶聯(lián)緩沖液（0· 1MMES, 0· 9MNaCl, 0· 02%NaN3,ρΗ4· 7)中，記為B液；
[0033] (3)向2mLΑ液中加入5mLΒ液，混合均勻；
[0034] (4)用10mLddH20溶解100mg的碳化二亞胺（EDC)，并取此溶液500μL立即加入 到A、Β混合液中；
[0035] (5)室溫下攪拌2小時(shí)，然后4°C下透析2-3天，即得到完全抗原。
[0036] 實(shí)施例2實(shí)施例1的完全抗原的SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)
[0037] (一）SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
[0038](1)分離膠：12% (W/V)聚丙烯酰胺
[0039]ddH20 1.6mL;30% 丙烯酰胺混合液 2.0mL;1.5mol/LTrisHC1 緩沖液（pH 8· 8) 1. 3mL;10%SDS50yL;10%過(guò)硫酸銨 50yL;TEMED2yL。
[0040] (2)濃縮膠：5% (W/V)丙烯酰胺
[0041] ddH20 3. 4mL;30 % 丙烯酰胺混合液 0· 83mL;1. 5mol/LTrisHC1 緩沖液 (pH6.8)0.63mL;10%SDS50yL;10%過(guò)硫酸銨 50yL;TEMED5yL。
[0042] (3)樣品預(yù)處理：取loadingbuffer20μL與100倍稀釋的實(shí)施例1獲得的完全 抗原20μL混合均勾，煮沸5min。
[0043](二）SDS-PAGE步驟
[0044] (1)將SDS-PAGE電泳槽搭建好；
[0045] (2)將分離膠室溫混勻后，倒入垂直玻璃板之間，用l_2mL ddH20封閉，待凝；
[0046] (3) 30min后待分離膠凝固，將ddH20倒出，吸水紙吸凈玻板之間的ddH20,將濃縮膠 加入，迅速插入點(diǎn)樣梳點(diǎn)樣，待凝；
[0047] (4)拔出點(diǎn)樣梳，每孔15yL樣品，插好正負(fù)級(jí)，先用90V電壓，等樣品成一條線后 改用150V，2小時(shí)左右關(guān)閉電泳；
[0048] 其中：各泳道依次加入：BSA、對(duì)羥基苯甲酸-BSA、對(duì)羥基苯丙酸-BSA、NP-BSA和 Marker(分子量依次為 97. 2KD、66. 2KD、43. 0KD、3L0KD、20. 1KD);
[0049] (5)染色和脫色：電泳結(jié)束后，小心剝出凝膠。放在染色缸內(nèi)，用染色液浸泡過(guò)夜； 次日將凝膠置于脫色液中，每隔2-3小時(shí)換一次脫色液，直至背景清晰為止。
[0050] (三）電泳圖分析
[005