一種用于食品中腸產(chǎn)毒性大腸桿菌檢測的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于食品中腸產(chǎn)毒性大腸桿菌檢測的試劑盒。腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(ETEC)性腸炎主要通過污染的水源、食品、牛奶、飲料等傳播?，F(xiàn)有技術(shù)的檢測方法耗時(shí)耗力，檢測不便，而本發(fā)明提供了特異性檢測腸產(chǎn)毒性大腸桿菌的試劑盒，試劑盒中含有特異性結(jié)合腸產(chǎn)毒性大腸桿菌的適配子，所述適配子為單鏈DNA。本發(fā)明試劑盒具有檢測時(shí)間短、研發(fā)周期短、質(zhì)量穩(wěn)定、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，在食品與衛(wèi)生安全檢測中得到廣泛應(yīng)用。
【專利說明】一種用于食品中腸產(chǎn)毒性大腸桿菌檢測的試劑盒 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于食品檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于食品中腸產(chǎn)毒性大腸桿菌檢測 的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(ETEC)性腸炎主要通過污染的水源、食品、牛奶、飲料等傳播， 產(chǎn)毒性大腸桿菌(ETEC)產(chǎn)生的毒素分為不耐熱腸毒素(LT)和耐熱腸毒素(ST)，根據(jù)其來源 不同，耐熱腸毒素又可分為豬源性（STp)和人源性（STa)，它們分別由位于質(zhì)粒上的三種毒 力基因編碼，產(chǎn)毒性大腸桿菌(ETEC)-般含有三個(gè)毒力基因中的一個(gè)或幾個(gè)基因。腸產(chǎn)毒 性大腸桿菌(ETEC)檢測以LT檢測為主，但是約有5~10%腸產(chǎn)毒性大腸桿菌不具有LT基因， 容易漏檢。
[0003] 在中國，腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(EnterotoxigenicE.coli，ETEC)是由致瀉性大腸桿 菌引起的腹瀉疾病的最常見病原菌。國內(nèi)不同省市地區(qū)關(guān)于由DEC引起的腹瀉疾病的流行 病學(xué)調(diào)查顯示，ETEC無論在地區(qū)覆蓋范圍還是在出現(xiàn)頻率上，在引起腹瀉的病原菌中始終 處于最顯著地位。國際上對(duì)于ETEC的相關(guān)報(bào)道也說明，它是在發(fā)展中國家引起嬰幼兒腹瀉 和旅游者腹瀉的最主要病原菌。
[0004] 據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，發(fā)展中國家每年受ETEC感染的5歲以下兒童約有2.8_4億人次，5-14歲兒童大約1億人次，15歲以上成年人大約4億人次之多;在非洲、亞洲和拉丁美洲所出現(xiàn) 過的旅游者腹瀉事件中有1/5-1/3都是由ETEC所引起的；世界上每年都有30-50萬人死于 ETEC引起的腹瀉，其中大部分為嬰幼兒。
[0005] 目前，國內(nèi)外在食品中大腸桿菌檢測時(shí)常用的檢測方法因其檢測手段、識(shí)別對(duì)象 各有不同而各具優(yōu)缺點(diǎn)。傳統(tǒng)檢測大腸桿菌的方法需要先分離再培養(yǎng)，然后用經(jīng)典的方法 鑒定，耗時(shí)、不靈敏是這些方法普遍存在的問題。免疫學(xué)方法簡單、方便、迅速、特異性較好， 但是仍有交叉反應(yīng)比較嚴(yán)重、假陽性多、靈敏度偏低等不足之處。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技 術(shù)雖具有準(zhǔn)確、靈敏、快速的特點(diǎn)，但其在檢測數(shù)目較多的樣品時(shí)操作比較繁雜，因此在聚 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)的基礎(chǔ)上又衍生出很多新型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，如多重 PCR技術(shù)，然而多重PCR雖簡化了PCR實(shí)驗(yàn)的操作，但是由于該技術(shù)需數(shù)對(duì)引物同時(shí)進(jìn)行擴(kuò) 增，很容易產(chǎn)生非特異性條帶或假陽性，影響檢測結(jié)果。
[0006] 通過指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)技術(shù)篩選獲得的寡核苷酸序列稱為適配子(aptamer)。其 原理就是利用分子生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建人工合成的單鏈隨機(jī)寡核苷酸文庫，其隨機(jī)序列長度 在20-100個(gè)堿基左右，將隨機(jī)寡核苷酸文庫與靶分子相互作用，保留結(jié)合的寡核苷酸配基， 經(jīng)反復(fù)擴(kuò)增、篩選數(shù)個(gè)循環(huán)，即可使與該靶子特異結(jié)合的寡核苷酸序列得到富集，最終獲得 靶分子的特異寡核苷酸配基。該技術(shù)具有庫容量大、靶分子范圍廣、親和力高、特異性強(qiáng)等 優(yōu)點(diǎn)。在臨床檢測方面，特別是對(duì)一些未知的致病性細(xì)菌或病毒的研究，雖然不知道其內(nèi)部 結(jié)構(gòu)、功能以及這些物質(zhì)的表位，但將其作為靶物質(zhì)，通過SELEX技術(shù)篩選到其相應(yīng)的適配 子，以檢測靶物質(zhì)，已成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。
[0007] 利用SELEX技術(shù)篩選獲得的適配子識(shí)別分子的模式與蛋白抗體類似，但與蛋白類 抗體相比，核酸類配基具有更多的優(yōu)越性，如不受免疫條件和免疫源性限制，可體外人工合 成，變性與復(fù)性可逆，可修飾并有利于長期保存和室溫運(yùn)輸?shù)取８匾氖?，適配子的靶分 子更為廣泛，包括金屬離子、有機(jī)染料、氨基酸、細(xì)胞因子、輔因子、氨基糖苷、抗生素、堿基 類似物、核苷酸和多肽等。其中蛋白質(zhì)類靶分子最多，包括酶、生長因子、抗體、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì) 胞粘附分子和選擇素等。完整的病毒顆粒和細(xì)菌病原體，甚至完整的細(xì)胞也可以通過復(fù)合 靶子SELEX技術(shù)或消減SELEX技術(shù)篩選出高親和力的寡核苷酸配基。適配子比抗體具有更高 的特異性和精確識(shí)別能力，甚至能識(shí)別單抗不能區(qū)分的蛋白質(zhì)分子。這些特性使得適配子 在生物醫(yī)藥和食品衛(wèi)生研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，成為不可缺少的有力工具。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明公開了一種高特異高敏感檢測腸產(chǎn)毒性大腸桿菌ETEC的方法，提高了它的 檢測和診斷效率。
[0009] 為了解決現(xiàn)有大腸氏菌檢測中存在的檢測周期長、靈敏度低、假陽性多等問題，本 發(fā)明提供一種特異識(shí)別腸產(chǎn)毒性大腸桿菌ETEC的試劑盒及其應(yīng)用。
[0010] 上述試劑盒，適配子可以采用生物素標(biāo)記。
[0011] 本發(fā)明中，所述的核酸適配體能夠特異結(jié)合腸產(chǎn)毒性大腸桿菌。
[0012] 本發(fā)明另外提供一種腸產(chǎn)毒性大腸桿菌ETEC適配子的篩選方法。
[0013] 隨機(jī)單鏈DNA文庫和引物由上海生物工程有限公司合成。
[0014] 隨機(jī)單鏈DNA文庫:5'_
[0015] TTGGACAGTGGACGTGAAGC(N36)GACCAAGTGACAGTGACGAG-3 '（注：n36代表36個(gè)A、T、C、 G堿基中任意一種的36個(gè)集合）。
[0016] 引物1:5 ' -TTGGACAGTGGACGTGAAGC-3 '
[0017] 引物 Π : 5 ' -CTCGTCACTGTCACTTGGTC-3 '
[0018]
[0019]引物1￥:5'-生物素-(：1^611^(^611^(：11^61'(：-3'。
[0020] 2. SELEX篩選獲得腸產(chǎn)毒性大腸桿菌ETEC特異的寡核苷酸適配子
[0021] 1) SELEX 篩選過程：
[0022] a.首輪篩選，取合成的隨機(jī)單鏈DNA 10yg加入到400ul IX結(jié)合緩沖液，95度變性 5min，然后迅速置于冰上lOmin;
[0023] b.加入lmL腸產(chǎn)毒性大腸桿菌ETEC菌懸液2.0 X 108，于37°C搖床lOOrpm結(jié)合1.2小 時(shí)，使單鏈DNA文庫與菌充分作用；
[0024] c.更換離心管，以去除與管壁結(jié)合的單鏈DNA，室溫下離心10 OOOrpm離心10min分 離未與菌結(jié)合的單鏈DNA文庫；
[0025] d.棄上清，加入600yL 1 X沖洗緩沖液，離心10 OOOrpm離心10min，重復(fù)此過程4 次，目的是洗去未與菌結(jié)合的核酸片段；
[0026] e ·接上步離心后去上清，加入100yL去離子水99°C加熱3min，高速離心18 OOOrpm 離心15min棄沉淀，換管留上清(核酸片段存于上清中），-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0027] 2)PCR富集與腸產(chǎn)毒性大腸桿菌ETEC特異結(jié)合的寡核苷酸適配子：
[0028] 每輪篩選后獲得的與腸產(chǎn)毒性大腸桿菌ETEC特異結(jié)合的寡核苷酸適配子文庫通 過PCR擴(kuò)增得到富集；
[0029] a.以上述上清為模板，通過引物I和引物IV擴(kuò)增產(chǎn)生一端帶生物素標(biāo)記的雙鏈 DNA；
[0030] b. PCR擴(kuò)增條件:95 °C預(yù)變性3min，然后進(jìn)行30循環(huán)95 °C變性35s，60 °C退火37s，72 °C延伸33s，最后72°C延伸lOmin;
[0031] c. PCR產(chǎn)物純化后，一端帶生物素標(biāo)記的雙鏈DNA通過生物素-鏈親合素之間的作 用與鏈親合素交聯(lián)的磁珠結(jié)合，經(jīng)過IX連接（the standard Binding and Washing Buffer，B&W)緩沖液洗滌3次，用lOOmM的新鮮NaOH 37°C變性30min，使不帶生物素的單鏈 DNA從鏈親合素交聯(lián)的磁珠上洗脫下來，測定其單鏈DNA的濃度，用作下一輪篩選的富集庫。 [0032] 3)重復(fù)篩選:重復(fù)上述SELEX篩選過程和PCR擴(kuò)增富集過程，共進(jìn)行14輪篩選，其中 第6、10輪分別用克雷伯菌、腸出血性大腸桿菌進(jìn)行反篩。
[0033]特異識(shí)別腸產(chǎn)毒性大腸桿菌ETEC的寡核苷酸適配子的核苷酸序列如下：

[0057] 本發(fā)明通過SELEX技術(shù)的篩選過程，獲得高親和性特異識(shí)別腸產(chǎn)毒性大腸桿菌 ETEC的寡核苷酸適配子(適配體），用于快速、準(zhǔn)確檢測腸產(chǎn)毒性大腸桿菌ETEC。
[0058] 以上述核酸適配子篩選文庫為基礎(chǔ)，可對(duì)文庫兩端的固定序列的個(gè)別核苷酸進(jìn)行 替換、顛倒、移位，或?qū)ζ溟L度進(jìn)行小幅延長或縮短，或?qū)ξ膸熘虚g的隨機(jī)序列進(jìn)行延長或 縮短，或?qū)U(kuò)增文庫的引物作相應(yīng)的簡單改造，然后制備簡單改造后的文庫和引物進(jìn)行核 酸適配子的篩選、PCR擴(kuò)增和分析與應(yīng)用。
[0059] 本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明設(shè)計(jì)出了一個(gè)性能優(yōu)秀的隨機(jī)單鏈寡核苷酸文庫。文 庫具有接近長度下限的短固定序列和較長的隨機(jī)序列，充分保證了文庫中單鏈寡核苷酸的 多樣性。文庫固定序列（引物序列）的獨(dú)特設(shè)計(jì)能使用高退火溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增，既能有效獲 得目的產(chǎn)物，又能有效抑制非特異性產(chǎn)物。本文庫及引物應(yīng)用于腸產(chǎn)毒性大腸桿菌ETEC的 核酸適配子篩選獲得成功，所述的適配子可以用于制備檢測試劑盒，從而用于食品中的腸 產(chǎn)毒性大腸桿菌ETEC的檢測。本方法具有檢測時(shí)間短、研發(fā)周期短、質(zhì)量穩(wěn)定、操作簡單等 優(yōu)點(diǎn)，在食品與衛(wèi)生安全檢測中能夠得到廣泛應(yīng)用。
【具體實(shí)施方式】
[0060] 實(shí)施例1腸產(chǎn)毒性大腸桿菌ETEC菌液的制備
[00611 將大腸桿菌ETEC-STa+菌株，在LB液體培養(yǎng)基試管中，37攝氏度，180r/min搖動(dòng)過 夜，備用。
[0062]實(shí)施例2適配子的獲得
[0063] 1、隨機(jī)單鏈DNA文庫和引物由上海生物工程有限公司合成。
[0064] 隨機(jī)單鏈DNA文庫：5'_
[0065] TTGGACAGTGGACGTGAAGC (N36)GACCAAGTGACAGTGACGAG-3 '（注：n36代表36個(gè)A、T、C、 G堿基中任意一種的36個(gè)集合）。
[0066] 引物1:5 ' -TTGGACAGTGGACGTGAAGC-3 '
[0067] 引物 Π : 5 ' -CTCGTCACTGTCACTTGGTC-3 '
[0068]
[0069]引物IV: 5' -生物素-CTCGTCACTGTCACTTGGTC-3'。
[0070] 2. SELEX篩選獲得腸產(chǎn)毒性大腸桿菌ETEC特異的寡核苷酸適配子 [0071] 1)SELEX 篩選過程：
[0072] a.首輪篩選，取合成的隨機(jī)單鏈DNA 10yg加入到400ul IX結(jié)合緩沖液，95度變性 5min，然后迅速置于冰上lOmin;
[0073] b ·加入lmL腸產(chǎn)毒性大腸桿菌ETEC菌懸液2 · 0 X 108，于37°C搖床lOOrpm結(jié)合1 · 2小 時(shí)，使單鏈DNA文庫與菌充分作用；
[0074] c.更換離心管，以去除與管壁結(jié)合的單鏈DNA，室溫下離心10 OOOrpm離心10min分 離未與菌結(jié)合的單鏈DNA文庫；
[0075] d.棄上清，加入600yL 1 X沖洗緩沖液，離心10 OOOrpm離心10min，重復(fù)此過程4 次，目的是洗去未與菌結(jié)合的核酸片段；
[0076] e ·接上步離心后去上清，加入100yL去離子水99°C加熱3min，高速離心18 OOOrpm 離心15min棄沉淀，換管留上清(核酸片段存于上清中），-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0077] 2)PCR富集與腸產(chǎn)毒性大腸桿菌ETEC特異結(jié)合的寡核苷酸適配子：
[0078] 每輪篩選后獲得的與腸產(chǎn)毒性大腸桿菌ETEC特異結(jié)合的寡核苷酸適配子文庫通 過PCR擴(kuò)增得到富集；
[0079] a.以上述上清為模板，通過引物I和引物IV擴(kuò)增產(chǎn)生一端帶生物素標(biāo)記的雙鏈 DNA；
[0080] b. PCR擴(kuò)增條件:95 °C預(yù)變性3min，然后進(jìn)行30循環(huán)95 °C變性35s，60 °C退火37s，72 °C延伸33s，最后72 °C延伸lOmin;
[0081] c. PCR產(chǎn)物純化后，一端帶生物素標(biāo)記的雙鏈DNA通過生物素-鏈親合素之間的作 用與鏈親合素交聯(lián)的磁珠結(jié)合，經(jīng)過IX連接（the standard Binding and Washing Buffer，B&W)緩沖液洗滌3次，用lOOmM的新鮮NaOH 37°C變性30min，使不帶生物素的單鏈 DNA從鏈親合素交聯(lián)的磁珠上洗脫下來，測定其單鏈DNA的濃度，用作下一輪篩選的富集庫。 [0082] 3)重復(fù)篩選:重復(fù)上述SELEX篩選過程和PCR擴(kuò)增富集過程，共進(jìn)行14輪篩選，其中 第6、10輪分別用克雷伯菌、腸出血性大腸桿菌進(jìn)行反篩。
[0083] 4)富集寡核苷酸適配子與菌結(jié)合率的測定：
[0084]第7、12、14輪SELEX篩選的產(chǎn)物，以標(biāo)記地高辛的引物ΙΠ和標(biāo)記生物素的引物IV進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，純化的PCR產(chǎn)物與鏈親和素標(biāo)記的磁珠充分反應(yīng)并用NaOH解鏈，地高辛標(biāo)記的 單鏈DNA游離在上清中；
[0085] 5)富集寡核苷酸適配子文庫的測序結(jié)果與分析：
[0086] a.將最后的富集文庫擴(kuò)增為雙鏈，連接pEGM-T載體，轉(zhuǎn)化E. coli DH5a，隨機(jī)挑取 60個(gè)陽性克隆進(jìn)行DNA序列測定，其中23個(gè)為可用序列，見SEQ ID NO: 1-23所示；
[0087] 實(shí)施例3結(jié)合特性驗(yàn)證
[0088] 將適配子分別取1.5yg，用牛小腸堿性磷酸酶(CIP)37°C消化lh，純化回收去磷酸 化的DNA;通過T4多核苷酸激酶標(biāo)記[γ-32P]ATP于去磷酸化的DNA分子末端。lOnmol放射性 標(biāo)記的DNA適配子分別與不同濃度的菌體37°C孵育30min，各組反應(yīng)液經(jīng)硝酸纖維素膜濾 過，洗滌濾膜，干燥濾膜，液閃計(jì)數(shù)儀測定濾膜上殘留的放射量，同一樣品平行做兩次測定。 計(jì)算各個(gè)適配子與菌體的解離常數(shù)。結(jié)果如下：
[0090] 從以上結(jié)果可以看出，本發(fā)明的23個(gè)適配子具有非常強(qiáng)的結(jié)合特性，現(xiàn)有技術(shù)中 也沒有所述結(jié)合特性的適配子能夠結(jié)合所述的菌體。
[0091] 實(shí)施例5菌體的鑒定
[0092]寡核苷酸適配子SEQ ID N0:1-23的序列送上海生物工程有限公司合成并在5'端 標(biāo)記羥基熒光素(FAM)。
[0093] 取5'FAM熒光標(biāo)記的寡核苷酸適配子SEQ ID N0:l-23(100nM)各300yL，分別與腸 產(chǎn)毒性大腸桿菌ETEC，腸侵襲性大腸桿菌，腸致病性大腸桿菌，腸出血性大腸桿菌、化膿性 鏈球菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌（1.5 X 108)于37 °C孵育lh，用1XBB(50mM Tri s-HCl (pH 7.4)，5mM KCl，I00mM NaCl，ImMMgC12)洗滌2次后，將菌體重懸于500yL 1XB B，用BD FACSC alibur流式細(xì)胞分析儀檢測結(jié)合上FAM標(biāo)記的適配子的菌體百分率(測三次取平均 值），結(jié)果顯示腸產(chǎn)毒性大腸桿菌ETEC寡核苷酸適配子競爭結(jié)合腸產(chǎn)毒性大腸桿菌ETEC的 能力為100%，而針對(duì)腸侵襲性大腸桿菌，腸致病性大腸桿菌，腸出血性大腸桿菌、化膿性鏈 球菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌菌沒有結(jié)合率。
[0094] 這充分說明，本發(fā)明的適配子具有較好的特異性和穩(wěn)定性。
[0095] 以上僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人 員來說，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本 發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于食品中腸產(chǎn)毒性大腸桿菌檢測的試劑盒，其含有能特異性結(jié)合腸產(chǎn)毒性大 腸桿菌的核酸適體。2. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述核酸適體序列如SEQ ID No: 1-23任一 所示。3. -種檢測食品中腸產(chǎn)毒性大腸桿菌的方法，其特征在于利用權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所 述的試劑盒。
【文檔編號(hào)】G01N33/569GK106018802SQ201610483756
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年6月27日
【發(fā)明人】楊國林
【申請(qǐng)人】楊國林