專利名稱：：重組細(xì)菌中的腸產(chǎn)毒性大腸桿菌定居因子(cf)抗原的制作方法重組細(xì)菌中的腸產(chǎn)毒性大腸桿菌定居因子(CF)抗原本發(fā)明涉及可用于抗腹瀉疫苗的重組細(xì)菌細(xì)胞，尤其是大腸桿菌(Esc/zen'c/w'aco//)細(xì)胞。大腸桿菌細(xì)胞從重組質(zhì)粒表達(dá)增加量的一或多種定居因子(CF)。重組質(zhì)粒能使一種細(xì)菌細(xì)胞表達(dá)不在相同野生型細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)的至少兩種不同的CF。
背景技術(shù)：
：在世界許多地方的流行性地區(qū)，腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(ETEC)是旅行者腹瀉、痢疾發(fā)病和兒童死亡率的主要原因。細(xì)菌的毒性與介導(dǎo)細(xì)菌與腸的粘附的菌毛定居因子(CF)的表達(dá)以及熱不穩(wěn)定(LT)和/或熱穩(wěn)定(ST)毒素的分泌有關(guān)，所述毒素通過(guò)影響腸電解質(zhì)和液體運(yùn)輸過(guò)程導(dǎo)致以腹瀉為特征的疾病(GaastraandSvennerholm,1996;Qadri等人，2005a;SanchezandHolmgren,2005)。針對(duì)ETEC疾病的保護(hù)與抗體介導(dǎo)的LT中和以及抗CF的免疫應(yīng)答有關(guān)(Levine等人，1994,SvennerholmandHolmgren,1995;SvennerholmandSavarino，2004)。通常，疫苗的目的是在受體中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，所述免疫應(yīng)答提供對(duì)真實(shí)病原體后來(lái)攻擊的保護(hù)。這可以通過(guò)接種病原體的活減毒株即具有降低毒性的株實(shí)現(xiàn)，這樣的話它不引起疾病但仍然刺激有效的免疫應(yīng)答，或者通過(guò)施用病原體的一或多種滅活株，所述滅活株能夠引發(fā)有效抗感染毒性株的保護(hù)性免疫應(yīng)答。對(duì)于抗腸道感染的免疫，疫苗優(yōu)選通過(guò)口服給藥以便在腸粘膜局部有效地刺激有效免疫應(yīng)答，但是其他粘膜途徑或者腸胃外或者甚至經(jīng)皮途徑也可以用于誘導(dǎo)保護(hù)性免疫。開發(fā)能夠針對(duì)ETEC引起的疾病進(jìn)行保護(hù)的有效疫苗是困難的。超過(guò)IOO種不同的血清型與致病株有關(guān)。此外，這些株可能攜帶很多CF中的一或多種(其每種是抗原性不同的)，所述CF促進(jìn)感染在腸中的發(fā)生(GaastraandSvennerholm,1996)。很多證據(jù)證明針對(duì)CF的免疫應(yīng)答是保護(hù)性的，腸中的粘膜免疫應(yīng)答對(duì)保護(hù)特別重要(Svennerholm等人，1988,1990;Levine等人，1994;Qadri等人，2005)。為誘導(dǎo)這類應(yīng)答，ETEC疫苗優(yōu)選口服給藥。我們之前已經(jīng)開發(fā)了口服的滅活全細(xì)胞ETEC疫苗，其包含代表常見ETEC血清型并表達(dá)幾個(gè)最常見的CF的5個(gè)菌株(在幾種情況下通常稱為coli表面[CS]蛋白)，所述CF即CFA/I、CS1、CS2、CS3、CS4和CS5以及重組霍亂毒素B亞基(CTB，其與ETECLT的B亞基高度同源)(SvennerholmandHolmgren,1995;SvennerholmandSavarino,2004)。利用該疫苗的初期臨床試驗(yàn)在瑞典志愿者、隨后在埃及和孟加拉國(guó)的成人和兒童中引起顯著的抗CTB和疫苗中存在的特異性CF的免疫反應(yīng)(Jertbom等人，1993;Ahren等人，1998;Savarino等人，1998，1999,Qadri等人,2005a,2005b)。該疫苗還提供針對(duì)腹瀉的顯著保護(hù)，所述腹瀉嚴(yán)重到足以干擾將要去墨西哥和危地馬拉的美國(guó)旅行者的日常活動(dòng)(Sack等人，2002;SvennerholmandSavarino2004)。但是，在6-18個(gè)月埃及嬰兒中發(fā)現(xiàn)該疫苗的保護(hù)效力是低的(Savarino等人，待發(fā)表)。這表明盡管該疫苗有效的抵御旅行者更加嚴(yán)重的疾病，但它不足以有效保護(hù)生活在流行性地區(qū)的嬰兒(SvennerholmandSteele,2004)。所述ETEC疫苗在嬰兒中低效力的一個(gè)原因被認(rèn)為是由于在這個(gè)年齡組中發(fā)現(xiàn)的對(duì)CF抗原相對(duì)低的抗體反應(yīng)(SavarinoandSvennerholm,2004)。這種弱反應(yīng)可以通過(guò)給予更高劑量的不同CF來(lái)改進(jìn)，因此增加疫苗劑量中這些抗原的量是繼續(xù)開發(fā)滅活ETEC全細(xì)胞疫苗優(yōu)先考慮的。它不是簡(jiǎn)單的在給予每個(gè)疫苗劑量時(shí)增加ETEC細(xì)菌的數(shù)量，因?yàn)橐呀?jīng)顯示給予6-18個(gè)月的幼兒大量滅活大腸桿菌(甚至大腸桿菌K12安慰劑制品)可能導(dǎo)致以嘔吐形式出現(xiàn)的可能歸因于大量的內(nèi)毒素(LPS)的不良反應(yīng)。如果給予較低(低3倍)劑量的細(xì)菌，則觀察不到這些副作用(Qadri等人2005b，Savarino等人，待發(fā)表)。因此解決該問題的一個(gè)策略可以是使用表達(dá)升高水平的ETECCF的大腸桿菌重組株，這樣的話可以增加疫苗中這些抗原的量而不增加疫苗中大腸桿菌細(xì)菌的總數(shù)。該策略可以結(jié)合將表達(dá)ETECCF的至少一種重組質(zhì)粒插入表達(dá)另一種ETECCF的細(xì)菌細(xì)胞，從而提供來(lái)自一種重組細(xì)菌菌株表達(dá)的CF的非天然組合。發(fā)明描述本發(fā)明涉及細(xì)菌菌株，即被遺傳工程化從重組質(zhì)粒表達(dá)一或多種與腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(ETEC)有關(guān)的定居因子(CF)的大腸桿菌菌株，與ETEC野生型參照菌株表達(dá)的所述CF相比，所述遺傳工程化大腸桿菌菌株表達(dá)的CF的量增加。大腸桿菌菌株是例如非產(chǎn)毒性大腸桿菌菌株，CF例如選自由CFA/I,CS1,CS2，CS3,CS4，CS5和CS6組成的組。本發(fā)明包括表達(dá)至少兩種不同CF的非天然組合的大腸桿菌菌株，例如表達(dá)兩種不同CF的非天然組合的菌株，所述兩種不同CF選自但不限于由CFA/I+CS2，CFA/I+CS6和CS2+CS4組成的組。本發(fā)明的大腸桿菌菌株可以是不表達(dá)抗生素抗性基因的菌株。此外，本發(fā)明的大腸桿菌菌株可以攜帶一或多種可以通過(guò)一或多種質(zhì)?；パa(bǔ)的可互補(bǔ)染色體缺失或者突變。本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)攜帶重組質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞的方法，所述大腸桿菌細(xì)胞能夠表達(dá)一或多種與腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(ETEC)有關(guān)的定居因子(CF)，與ETEC野生型參照菌株表達(dá)的所述CF相比，所述大腸桿菌細(xì)胞表達(dá)的CF的量增加。該方法包括以下步驟在質(zhì)粒中組裝ETECCF表達(dá)所需的基因；控制CF表達(dá)的非ETEC強(qiáng)啟動(dòng)子；用于質(zhì)粒維持的選擇標(biāo)記；質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)；和任選地，調(diào)節(jié)CF表達(dá)水平的元件。本發(fā)明還涉及抗腹瀉的疫苗組合物，其包括本發(fā)明的至少一種大腸桿菌菌株，以及藥學(xué)上可接受的賦形劑、緩沖液和/或稀釋劑，例如適于疫苗口服輸送的賦形劑、緩沖液和/或稀釋劑。合適的賦形劑、緩沖液和稀釋劑是現(xiàn)有技術(shù)中已知的，在美國(guó)或者歐洲藥典中可以發(fā)現(xiàn)用于合理選擇的指導(dǎo)。如本領(lǐng)域公知，存在數(shù)種與ETEC的人致病株有關(guān)的CF類型，但CFA/I,CFA/II和CFA/IV是主要類型，目前與大約40-80。/。的臨床分離物有關(guān)。CFA/1是單一的菌毛抗原，而CFA/II和CFA/IV可以由一種以上類型的CF/CS蛋白組成。野生型ETEC中CF表達(dá)似乎是受限的，所以天然株最多只在某些組合中表達(dá)兩種或者三種類型的CF抗原。因此，天然CFA/IIETEC株通常表達(dá)CS1和CS3，CS2和CS3或者單獨(dú)的CS3。類似地，天然CFA/IVETEC株通常表達(dá)CS4和CS6,CS5和CS6或者單獨(dú)的CS6。但是，例如還沒有在相同野生型菌株中發(fā)現(xiàn)CS1和CS2，并且類似地CS4和CS5在天然存在的菌株中不一起表達(dá)。此外，對(duì)野生型菌株來(lái)說(shuō)還沒有描述CS4，CS5或者CS6和CS1或者CS2或者CS3的表達(dá)。對(duì)抗ETEC疫苗提出的最低要求是它應(yīng)該具有誘導(dǎo)抗ETEC株的保護(hù)的潛力，所述ETEC株表達(dá)CFA/I以及CFA/II和CFA/IV的不同亞成分，即CS1-CS6。因此，基于野生型株的ETEC疫苗可能最低需要至少5個(gè)菌株，表達(dá)CFA/1、CS1+CS3、CS2+CS3、CS4+CS6和CS5+CS6。但是，本發(fā)明描述了一種產(chǎn)生細(xì)菌細(xì)胞的方法，所述細(xì)菌細(xì)胞的CF抗原表達(dá)不受限制，并且作為主要的附加特征，以比野生型株中發(fā)現(xiàn)的水平更高的水平表達(dá)相關(guān)CF。因此，本發(fā)明提供過(guò)表達(dá)ETECCF的細(xì)菌細(xì)胞，尤其是過(guò)表達(dá)至少兩種不同的CF，例如CFA/I+CS2、CFA/I+CS6、CS2+CS4或CS1+CS5。根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的細(xì)菌細(xì)胞可用于制備抗ETEC疾病的疫苗。因此，本發(fā)明還提供一種生產(chǎn)疫苗的方法，所述疫苗預(yù)期還在幼兒中對(duì)于感染ETEC引起的腹瀉是保護(hù)性的。因?yàn)樗龇椒ū苊饬酥癈F抗原表達(dá)在某些天然組合中的限制，本發(fā)明可以提供抗腹瀉疫苗，所述疫苗包括少至3-4個(gè)細(xì)菌菌株，其一起過(guò)表達(dá)CFA/1、CS1、CS2、CS3、CS4、CS5和CS6，即每株表達(dá)兩種CF。因此，該疫苗總體上將包括更少的菌株，或許具有額外的優(yōu)點(diǎn)，即比稍早試驗(yàn)的滅活ETEC疫苗可以使用更低的劑量每種菌株。此外本發(fā)明提供接種哺乳動(dòng)物抗ETEC腹瀉的方法，包括所述口服給予所述細(xì)胞或者疫苗。本發(fā)明特別涉及一種細(xì)菌菌株，其己被遺傳工程化為從質(zhì)粒表達(dá)一或多種與腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(ETEC)有關(guān)的定居因子(CF)，其表達(dá)CF的量超過(guò)到目前為止表征的ETEC野生型株表達(dá)所述CF的量，即與ETEC野生型參照株表達(dá)的所述CF相比，所述菌株表達(dá)CF的量增加。當(dāng)前優(yōu)選的菌株屬于腸桿菌(五wfera^cfer/ac^)科，最優(yōu)選的是大腸桿菌Ce;.co/o菌株。預(yù)期用于本發(fā)明疫苗生產(chǎn)的i達(dá)CF與哺乳動(dòng)物尤其是人類中ETEC引起的腸感染和疾病有關(guān)。優(yōu)選本發(fā)明的菌株在細(xì)菌表面表達(dá)所述CF。本發(fā)明特別優(yōu)選的菌株是表達(dá)CF并攜帶一或多種質(zhì)粒的菌株，所述質(zhì)粒含有ETECCF表達(dá)和組裝所需的基因；控制CF表達(dá)的非ETEC強(qiáng)啟動(dòng)子；用于質(zhì)粒維持的選擇標(biāo)記；質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)；和任選地，調(diào)節(jié)CF表達(dá)水平的元件(圖O。通過(guò)免疫方法可以檢測(cè)細(xì)菌表面上本發(fā)明得到的CF的表達(dá)水平，例如通過(guò)應(yīng)用抑制ELISA測(cè)定，CF的表達(dá)水平比任意迄今為止表征的表達(dá)相應(yīng)CF的ETEC野生型株高至少3倍或者通過(guò)應(yīng)用斑點(diǎn)印跡試驗(yàn)高至少5倍。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述被研究的菌株是不表達(dá)抗生素抗性基因的菌株。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的菌株攜帶可互補(bǔ)染色體缺失或者突變。用于本發(fā)明菌株的質(zhì)粒可以是互補(bǔ)染色體突變的質(zhì)粒。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)本發(fā)明菌株表達(dá)的CF以如下形式表達(dá)，即允許它們與針對(duì)來(lái)自ETEC株的相應(yīng)CF產(chǎn)生的特異性抗體反應(yīng)，所述ETEC株最初從患腸ETEC感染的哺乳動(dòng)物大便分離。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)本發(fā)明菌株表達(dá)的CF以以下形式表達(dá)，即當(dāng)所述菌株以有效量用于哺乳動(dòng)物免疫時(shí)，導(dǎo)致抗表達(dá)的CF的抗體形成，所述抗體能夠與來(lái)自ETEC株的相應(yīng)CF反應(yīng)，所述ETEC株最初從患腸ETEC感染的哺乳動(dòng)物大便分離。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)本發(fā)明菌株表達(dá)的CF以以下形式表達(dá)，即通過(guò)福爾馬林處理或者其他方式滅活菌株后，允許它們與針對(duì)來(lái)自ETEC株的相應(yīng)CF產(chǎn)生的特異性抗體反應(yīng)，所述ETEC株最初從患腸ETEC感染的哺乳動(dòng)物大便分離。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)本發(fā)明菌株表達(dá)的CF以以下形式表達(dá)，即通過(guò)福爾馬林處理或者其他方式滅活菌株后，當(dāng)所述菌株以有效量用于哺乳動(dòng)物免疫時(shí)，導(dǎo)致抗表達(dá)的CF抗體的形成，所述抗體能夠與來(lái)自ETEC株的相應(yīng)CF反應(yīng)，所述ETEC株最初從患腸ETEC感染的哺乳動(dòng)物大便分離。對(duì)本發(fā)明來(lái)說(shuō)，CF的實(shí)例包括在相同或者不同的細(xì)菌細(xì)胞中單獨(dú)的或者從相同或者不同質(zhì)粒表達(dá)的所述CF的兩種或多種的任意組合的CFA/I、CS1、CS2、CS3、(CS4)、CS5或者CS6。有利地，從相同的細(xì)菌細(xì)胞共表達(dá)兩種或多種CF的非天然組合。在液體培養(yǎng)基中利用體外培養(yǎng)菌株的方法培養(yǎng)本發(fā)明的細(xì)菌菌株，提供所述CF的高水平表面表達(dá)。用福爾馬林或者苯酚或者其他方法適度處理，可以滅活本發(fā)明的培養(yǎng)菌株，從而防止菌株復(fù)制，導(dǎo)致菌株保持以與滅活前菌株基本上相同量(原始量的至少50%)過(guò)表達(dá)CF，和基本上相同的與抗體的反應(yīng)性和幾乎相同的免疫原性。本發(fā)明菌株或者這類菌株的組合適合用于抗腹瀉接種方法中，或者用于疫苗制備。本發(fā)明的一或幾種細(xì)菌菌株尤其適用于接種哺乳動(dòng)物抗腹瀉的方法，其包括給哺乳動(dòng)物施用本發(fā)明的菌株或者菌株組合。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的一或幾種菌株被單獨(dú)或者組合作為疫苗使用，用于接種哺乳動(dòng)物如小豬、牛犢、羔羊或者馬，或者尤其是人。這類疫苗優(yōu)選通過(guò)口服途徑給予。現(xiàn)在本發(fā)明通過(guò)下列、附圖、序列表、材料和方法和實(shí)施例以及表格進(jìn)行說(shuō)明，但應(yīng)了解本發(fā)明不限于任何公開的細(xì)節(jié)。圖1.該圖顯示實(shí)施例1所述過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的典型特征。C/fl-^/B/C/￡是CFA/I表達(dá)和組裝所需的基因?；虮磉_(dá)受tac啟動(dòng)子的控制。利用由6/"表達(dá)的氨芐青霉素作為選擇標(biāo)記維持質(zhì)粒，復(fù)制起點(diǎn)來(lái)自于ColEI(pBR322)。CFA/I的表達(dá)受/a詢表達(dá)的乳糖抑制體的控制。圖2.該圖顯示圖1所述過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的典型特征。此外，質(zhì)粒pAF-thyA-CFA/I-AMP(圖2，頂部)含有基因WM，編碼胸腺嘧啶的產(chǎn)生，使胸腺嘧啶依賴株不再對(duì)胸腺嘧啶依賴。質(zhì)粒pAF-thyA-CFA/I(圖2,底部)與pAF-thyA-CFA/I-AMP具有相同的特征，但是缺少Wa表達(dá)的對(duì)于氨芐青霉素的選擇標(biāo)記，因此利用表達(dá)的胸腺嘧啶作為選擇標(biāo)記來(lái)維持該質(zhì)粒。圖3.該圖顯示pAFl-CS2表達(dá)載體的構(gòu)建。擴(kuò)增完整的CS2操縱子和側(cè)翼區(qū)，并克隆到表達(dá)載體pAFl，產(chǎn)生pAFlCS2，如結(jié)果所述(1B)。圖4.該圖顯示TOP10-pAFl-CS2和參照58R957株的抑制ELISA效價(jià)。如材料和方法所述，通過(guò)抑制ELISA測(cè)定CS2的表達(dá)水平。柱圖顯示3個(gè)制品(一式三份)ELISA效價(jià)(+SD)的幾何平均數(shù)。星號(hào)表示TOP10-pAFl-CS2和參照株58R957之間CS2表達(dá)的顯著差異(P<0.05)，通過(guò)Student，st-檢驗(yàn)來(lái)測(cè)定。圖5.該圖顯示免疫金標(biāo)記的TOP10-pAFl-CS2株的電子顯微照片，利用抗CS2的單克隆抗體(MAb抗-CS210:3)。圖6.該圖顯示pMT-CS2表達(dá)載體的構(gòu)建，如實(shí)施例5所述。圖7.該圖顯示TOP10-pMT-CS2(泳道2)和參照58R957(泳道l)株的CS2表達(dá)水平。通過(guò)斑點(diǎn)印跡顯示抗CS2特異性單克隆抗體(10:3)與每株的免疫反應(yīng)性。每種菌株均在LB中培養(yǎng)，細(xì)菌的初始濃度是109/1111。在條帶旁標(biāo)明稀釋度。圖8.該圖顯示免疫金標(biāo)記的TOP10-CFA/1-CS2株的電子顯微照片，利用抗CFA/I(MAb1:16)(頂部)和CS2(MAb10:3)(底部)的單克隆抗體。圖9.該圖顯示滅活TOP10-CFA/I-CS2和相應(yīng)參照株325542-3(CFA/I)和58R957(CS2)的CFA/I和CS2表達(dá)水平。通過(guò)斑點(diǎn)印跡顯示抗CFA/I和抗CS2特異性單克隆抗體與每株的免疫反應(yīng)性。每種菌株均在LB中培養(yǎng)，福爾馬林滅活細(xì)菌的初始量是109/ml。在條帶旁標(biāo)明稀釋度。圖IO.該圖顯示用滅活的TOP10-CFA/I-CS2和參照株325542-3(CFA/I)和58R957(CS2)口服免疫小鼠后血清中的IgA抗體效價(jià)。在第二次免疫后兩周收集血清樣品，通過(guò)ELISA測(cè)定抗CFA/I和抗CS2IgA效價(jià)。效價(jià)表示為每組3只動(dòng)物的幾何平均效價(jià)倒數(shù)(+SE)，所述^J物用TOP10-CFA/I-CS2或者參照株免疫。圖11.該圖顯示用福爾馬林滅活的TOP10-CFA/I-CS2和參照株325542-3(CFA/I)和58R957(CS2)口服免疫小鼠后血清中的IgG+M抗體效價(jià)。在第二次免疫后兩周收集血清樣品，通過(guò)ELISA測(cè)定抗CFA/I和抗CS2IgG+M的效價(jià)。效價(jià)表示為每組3只動(dòng)物的Log,o幾何平均效價(jià)倒數(shù)(+標(biāo)準(zhǔn)差)，所述動(dòng)物用TOP10-CFA/I-CS2或者參照株免疫。星號(hào)表示與參照株相比的顯著差異(P〈0.05)，通過(guò)student'st-檢驗(yàn)測(cè)定。圖12.該圖顯示用滅活的TOP10-CFA/I-CS2和參照株325542-3和58R957口服免疫小鼠后血清中的抗體效價(jià)。在第二次免疫后兩周收集血清樣品，通過(guò)ELISA測(cè)定抗CTIgA的效價(jià)。效價(jià)表示為每組3只動(dòng)物的Log10幾何平均效價(jià)倒數(shù)(+標(biāo)準(zhǔn)差)，所述動(dòng)物用TOP10-CFA/I-CS2或者參照株免疫。材料和方法細(xì)菌菌株和培養(yǎng)條件。本申請(qǐng)描述的菌株列于表1。通過(guò)實(shí)施例1中過(guò)表達(dá)CFA/I菌株的構(gòu)建舉例說(shuō)明過(guò)表達(dá)CF重組菌株的構(gòu)建。菌株在-7(TC冷藏于含有甘油的冷凍培養(yǎng)基中直到使用。在37t接種瓊脂平板過(guò)夜以確定生長(zhǎng)和純度后，細(xì)菌在CFA肉湯(酪蛋白氨基酸10g,酵母提取物1.5g,MgS047H20102mg,MnCl24H208mg/升)中生長(zhǎng)，37。C振蕩16-18小時(shí)。重組CF在細(xì)菌表面的過(guò)表達(dá)。重組CF表達(dá)菌株的過(guò)夜培養(yǎng)物以1/100的比例稀釋于CFA肉湯，必要時(shí)添加lOOpg/ml氨芐青霉素。所獲培養(yǎng)物在37'C振蕩孵育2小時(shí)(在搖床中150rev/min)。為了誘導(dǎo)在細(xì)菌表面CF的表達(dá)，然后添加終濃度為lmM的異丙基-P-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)，在相同條件下繼續(xù)孵育另外4小時(shí)。然后收集細(xì)菌，重懸于PBS。幼，M大腸桿菌K12突變株的分離。利用先前描述的三甲氧芐二氨嘧啶選擇(StaceyandSimson,1965)進(jìn)行大腸桿菌K12(TOP10)株AW(胸苷酸合成酶)突變體的構(gòu)建，除了M9培養(yǎng)基添加酪蛋白氨基酸(Difco，BecktonDickinson,Sweden)到終濃度0.05%并且使用濃度為200pg/ml的三甲氧芐二氨嘧啶。細(xì)菌的滅活。為了使細(xì)菌失活(滅活)，洗滌每株培養(yǎng)物并重懸于PBS到1(^細(xì)菌/ml的密度。添加滅活劑例如福爾馬林到合適的終濃度，即0.05-0.2M，懸浮液在溫和攪拌條件下在37'C孵育2小時(shí)，之后它在4'C靜置3天，無(wú)需攪拌。在洗滌和用相同體積的PBS重懸后，將100^1細(xì)菌懸液涂布到血液瓊脂平板，在對(duì)細(xì)菌表面各種CF的量對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分析前，在37'C孵育直至一周來(lái)檢測(cè)生長(zhǎng)。評(píng)價(jià)重組和參照株中表面CF水平的方法。兩種不同的方法，斑點(diǎn)印跡和抑制ELISA測(cè)定，這兩種方法都能夠測(cè)定表面表達(dá)的CF，被用于評(píng)價(jià)重組細(xì)菌中每種CF的量并與相應(yīng)的參照株進(jìn)行比較a)斑點(diǎn)印跡。為了分別評(píng)價(jià)每種重組和參照株上CF的存在和數(shù)量，利用抗相應(yīng)CF和相應(yīng)參照株的單克隆抗體(MAb)進(jìn)行各個(gè)斑點(diǎn)印跡測(cè)定。不同試驗(yàn)使用的MAb列于表2。如下進(jìn)行試驗(yàn)硝酸纖維素膜(SorbentAB，Sweden)浸泡在磷酸鹽緩沖液(PBS)中，風(fēng)干。此后，將溶于PBS的2-或者3-倍稀釋全細(xì)菌(109細(xì)菌/1111;OD6Q。=0.8)的2^1等份上樣于膜，再次風(fēng)干。用于PBS的1%(wt/vol.)牛血清白蛋白(BSA)(Sigma-Aldrich)溫和攪拌30分鐘進(jìn)行封閉。所有孵育均在室溫下進(jìn)行。用PBS洗滌兩次后，在溫和攪拌條件下硝酸纖維素膜與相應(yīng)抗CFMAb(適當(dāng)?shù)南♂層?.1%BSA-PBS-0.05%Tween-20(Sigma-Aldrich))孵育過(guò)夜。用PBS"0.05。/oTween洗膜三次，添加于0.1%BSA-PBS-0.05%Tween中稀釋的抗小鼠IgG-辣根過(guò)氧化物酶綴合物(JacksonImmunoResearch;GTFSweden)。孵育2小時(shí)后，膜用PBS-Tween洗滌兩次，PBS洗滌一次，然后通過(guò)利用過(guò)氧化氫(0,012%)作為底物和4-氯萘酚(Bio-RadLaboratories)作為色原顯色5到10分鐘。白色背景上的染色斑點(diǎn)表明陽(yáng)性結(jié)果。對(duì)每個(gè)菌株分別檢測(cè)在硝酸纖維素片上造成可見斑點(diǎn)的109細(xì)菌/ml懸浮液的最高稀釋度倒數(shù)。b)抑制ELISA.為了分別測(cè)定重組和參照株表面CF的量，通過(guò)ELISA抑制方法來(lái)測(cè)定CF表達(dá)細(xì)菌抑制相應(yīng)抗CFMAb與同源的固相結(jié)合CF的結(jié)合的能力。不同試驗(yàn)中用于包被的MAb和CF列于表2。以1()S細(xì)菌/ml的初始濃度檢測(cè)細(xì)菌，如下面抑制ELISA中所述進(jìn)行試驗(yàn)來(lái)定量ETECCF/CS-因子。測(cè)定造成Nab與相應(yīng)固相抗原的50%抑制的測(cè)試細(xì)菌懸液的最高內(nèi)推稀釋度倒數(shù)。動(dòng)物免疫。雌性Balb/c小鼠(6-8周齡)用于所有免疫實(shí)驗(yàn)。按照先前描述(Rhagavan等人，2002)，在麻醉狀態(tài)下重組和參照CF表達(dá)株的滅活細(xì)菌分別以109細(xì)菌和10嗎CT的劑量口服施用。間隔兩周給予所有動(dòng)物兩次相同的免疫，在緊挨第一次劑量前和第二次劑量后兩周收集用于制備血清的血液。用于抗CF抗體效價(jià)測(cè)定的ELISA。通過(guò)ELISA測(cè)定免疫前和免疫后小鼠血清中抗相應(yīng)CF抗原的IgA和IgG同種型的抗體效價(jià)。ELISA微滴定板用lpg/ml的純化CF在37'C包被過(guò)夜(100pl每孔)。板用1%BSA-PBS溶液在37'C封閉30分鐘后，室溫下血清在含有0.1%BSA-Tween的PBS中的3倍稀釋液在板中孵育1.5小時(shí)。然后通過(guò)添加抗小鼠HRP-綴合的抗IgA或者抗IgG+M綴合物，利用H202作為酶底物和OPD作為色原，顯示結(jié)合的抗體。效價(jià)確定為酶與其底物反應(yīng)5到20分鐘后在450nm產(chǎn)生高于背景的吸光度為0.4時(shí)的稀釋度的倒數(shù)。分別分析來(lái)自不同動(dòng)物的血清，計(jì)算每組中的各個(gè)效價(jià)倒數(shù)的幾何平均值和平均值的標(biāo)準(zhǔn)差(SE)。用于定量ETECCF/CS-因子的抑制ELISA的詳細(xì)說(shuō)明通過(guò)抑制ELISA對(duì)全(活或者滅活的)細(xì)菌表面CF量的測(cè)定如下進(jìn)行A.在37'C用于磷酸鹽緩沖液(PBS)中稀釋的各自純化CF抗原包被微滴定平板(例如NUNC聚苯乙烯ELISA板)過(guò)夜，10(Hil/孔。合適的抗原和包被濃度顯示于表2。板在4'C保存至14天直到使用。B.用1。/。牛血清白蛋白(BSA)封閉未包被的平板，200^1/孔，37°C30分鐘。C.向未包被、封閉板的所有孔中添加60pl/孔的含有0.05%Tween20的O.l%BSA-PBS，除了每排的第一個(gè)孔。向每排的第一個(gè)孔中添加90pl樣品?；旌喜脑摽邹D(zhuǎn)移30^1到第二個(gè)孔，在另6個(gè)孔中繼續(xù)這種3倍稀釋；在每排的最后一個(gè)孔中只留下BSA-PBS-Tween。D.添加60pl/孔的于0.1%BSA-PBS-Tween中稀釋的相應(yīng)單克隆抗體(MAb)。各種MAb的命名、同種型和合適濃度顯示于表2。E.在溫和振蕩條件下平板在室溫孵育1小時(shí)。F.用PBS洗滌CF抗原包被的平板兩次。G.通過(guò)將平板用1%BSA，200W〃L，在37。C孵育30分鐘，對(duì)CF抗原包被平板固相的殘余結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行封閉。H.用PBS-Tween洗平板一次。從最后一個(gè)孔(含有BSA-PBS-Tween)開始，從非包被"抑制平板"轉(zhuǎn)移100pl/孔的每種混合物到CF抗原包被、BSA封閉的平板。I.平板靜置在室溫下孵育90分鐘。J.用PBS-Tween洗平板3次。K.添加于0.1%BSA-PBS-Tween中稀釋的抗小鼠Ig辣根過(guò)氧化物酶(HRP)綴合物，10(Hil/孔。(必須確定每種新綴合物批次的合適綴合物濃度)。在室溫下孵育60-90分鐘。L.用PBS-Tween洗平板3次。M.添加酶底物，即鄰苯二胺(OPD)，通過(guò)在10mlO.IM擰檬酸鈉緩沖液(pH4.5)中溶解10mgOPD制備，使用前再向其中添加4^1的30%過(guò)氧化氫。每孔添加100pl該混合物，10或者20分鐘后用分光光度計(jì)(例如Labsystem，Multiskan)在450nM讀數(shù)。最后孔(緩沖液+MAb)的吸光度應(yīng)該是LO。N.通過(guò)吸光值對(duì)樣品稀釋度作圖繪制曲線，確定每個(gè)標(biāo)本的50%抑制濃度(計(jì)算見下文)。50%抑制效價(jià)的測(cè)定MaxAbs:MAb+BSA-PBS-Tween(每排最后一個(gè)孔吸光值的平均)MinAbs:MAb+相應(yīng)CFA參照的最高濃度50%抑制濃度=MaxAbs—MinAbs+MinAbs250%抑制效價(jià)確定為當(dāng)MAb與相應(yīng)固相結(jié)合的CF抗原反應(yīng)時(shí)，造成吸光度50%抑制的細(xì)菌稀釋度倒數(shù)。此處引用的文獻(xiàn)教導(dǎo)被引入該說(shuō)明書作為參考。實(shí)施例實(shí)施例1.過(guò)表達(dá)CFA/I重組株的構(gòu)建。具有在細(xì)菌表面過(guò)表達(dá)ETECCF抗原的能力的大腸桿菌菌株的構(gòu)建利用產(chǎn)生這樣一種菌株的描述在此舉例說(shuō)明，當(dāng)在合適的培養(yǎng)條件下在體外生長(zhǎng)時(shí)，所述大腸桿菌菌株能夠產(chǎn)生過(guò)量的大腸桿菌定居因子抗原I(CFA/I)。采取的方法是將來(lái)自生產(chǎn)CFA/I的野生型ETEC株的由4個(gè)基因組成的完整CFA/I操縱子克隆入質(zhì)粒表達(dá)載體，然后將該質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌K12(大腸桿菌TOP10)株。這通過(guò)SambrookeandRussell(2001)描述的DNA操作標(biāo)準(zhǔn)程序或者根據(jù)隨試劑提供的說(shuō)明書來(lái)實(shí)現(xiàn)。利用PCR擴(kuò)增來(lái)自CFA/I陽(yáng)性野生型參照株325542-3的CFA/I操縱子的有關(guān)基因。通過(guò)從瓊脂平板挑取細(xì)菌的新鮮菌落并在lOOpl雙蒸無(wú)菌水中懸浮細(xì)胞來(lái)制備模板DNA。懸浮液在水浴煮沸5分鐘，隨后在臺(tái)式離心機(jī)上全速旋轉(zhuǎn)5分鐘。所獲上清等分被用作模板。利用合適的正反向引物(顯示于表l)和ExpandHighFidelityPCRSystem(RocheDiagnosticsGmbH,Germany)進(jìn)行擴(kuò)增。CFA/I-正向引物與cfaA上游的22堿基對(duì)(bp)序列同源，攜帶EcoRI和Eco311的限制性位點(diǎn)，而CFA/I-反向引物，其延伸cfaE下游lbp，在5'端攜帶HindIII和Eco31I的限制性位點(diǎn)(圖1)。PCR條件如下95°C5分鐘，31個(gè)循環(huán)的94°C15秒、58°C30秒和68°C4分鐘，72'C最終延伸7分鐘。所獲5041bp片段攜帶cfaA、cffi、cfaC和cfaE基因(CFA/1)，是CFA/I菌毛產(chǎn)生和組裝必需的。然后用Eco3II限制性酶切擴(kuò)增的CFA/IDNA,獲得側(cè)翼為EcoRI和HindIII相容末端的片段(圖1)。用EcoRI和HindIII限制性酶切表達(dá)載體pAF-tac(Sadeghi等人2002)后，將消化的PCR片段和載體混合，利用T4DNA連接酶連接。連接的DNA被電穿孔入大腸桿菌K12株TOP10(Invitrogen,Lifetechnologies,Sweden)。通過(guò)PCR針對(duì)CFA/IDNA的存在對(duì)菌落進(jìn)行初篩，并利用分離質(zhì)粒的限制性酶切分析進(jìn)一步分析陽(yáng)性克隆。發(fā)現(xiàn)在44個(gè)被測(cè)菌落中，34個(gè)含有攜帶CFA/I的質(zhì)粒。其中CFA/I操縱子位于IPTG-誘導(dǎo)的tac啟動(dòng)子下游的8850bp質(zhì)粒被命名為pAF-CFA/I-AMP。然后選擇一個(gè)菌落，用作攜帶pAF-CFA/I-AMP的重組大腸桿菌K12株的親代菌落(TOP10-CFM)。然后按照實(shí)施例2所述檢測(cè)該菌株CFA/I的表面過(guò)表達(dá)。類似方法還分別用于產(chǎn)生過(guò)表達(dá)CS2、CS4和CS6的重組株。用于構(gòu)建這些重組株的引物(正反向)列于表l。實(shí)施例2.重組大腸桿菌K12株表面CF過(guò)表達(dá)的驗(yàn)證。為了測(cè)定重組大腸桿菌K12株中不同ETECCF的表達(dá)，使用兩種不同的測(cè)定，即斑點(diǎn)印跡和抑制ELISA。在斑點(diǎn)印跡測(cè)定中，2^1于PBS中2-或者3-倍稀釋的全細(xì)菌以1(f細(xì)菌/ml的初始濃度上樣于硝酸纖維素膜。按照材料和方法中所述，膜與相應(yīng)抗CFMAb孵育后，洗滌膜，與抗小鼠IgG-辣根過(guò)氧化物酶綴合物孵育，然后顯色。還可以通過(guò)使用抑制ELISA來(lái)測(cè)定重組和參照株細(xì)菌表面的CF表達(dá)，其中測(cè)定各菌株的CF抑制相應(yīng)抗CFMAb與固相結(jié)合的CF結(jié)合的能力，如定量ETECCF/CS-因子的抑制ELISA中所述。斑點(diǎn)印跡試驗(yàn)中，與參照株相比，測(cè)試重組大腸桿菌K12株(大腸桿菌TOP10)表達(dá)ETECCF的能力的結(jié)果顯示于表3，所述參照株即先前發(fā)現(xiàn)表達(dá)最高水平相應(yīng)ETECCF的臨床菌株。所示效價(jià)表示在硝酸纖維素膜上每株菌株產(chǎn)生可見斑點(diǎn)的平均最高稀釋度倒數(shù)。當(dāng)比較各重組株和相應(yīng)參照株之間的CF水平時(shí)，星號(hào)表示顯著差異(PO.Ol)，通過(guò)Student'st-檢驗(yàn)來(lái)測(cè)定。如表3所示，所有重組株比相應(yīng)參照株表達(dá)顯著更高水平的CF。與參照株相比，通過(guò)抑制ELISA測(cè)定的大腸桿菌K12重組株表達(dá)ETECCF的能力顯示于表4。效價(jià)表示各被測(cè)菌株中的ETECCF水平。當(dāng)比較各重組株和相應(yīng)參照株之間的CF水平時(shí)，星號(hào)表示顯著差異(P0.05)，通過(guò)Student'st-檢驗(yàn)來(lái)測(cè)定。如所示，重組株比參照株表達(dá)顯著更高水平的CF。實(shí)施例3.非抗生素抗性標(biāo)記導(dǎo)入重組CFA/I過(guò)表達(dá)大腸桿菌K12株(TOP10畫CFA/I株)。選擇標(biāo)記，如抗生素抗性標(biāo)記，是維持重組株中的表達(dá)載體所需的。但是，為了消除疫苗制品中抗生素殘留的可能性并且為了防止編碼抗生素抗性的基因水平散播到環(huán)境的可能性，應(yīng)當(dāng)在疫苗株中避免這種標(biāo)記。因此我們?cè)谶^(guò)表達(dá)TOP10-CFA/I重組株中，用非抗生素標(biāo)記f/yj(其互補(bǔ)宿主中的f/y^突變，使胸腺嘧啶依賴株不再依賴胸腺嘧啶)取代pAF-thyA-CFA/I-AMP中存在的P-內(nèi)酰胺酶基因(Wa)。攜帶WM基因、側(cè)翼為Sail和Xhol限制性位點(diǎn)的1200bp片段被連接入用Xhol消化的pAF-tac-CFA/I-AMP(圖2)。這獲得10050bp質(zhì)粒pAF-tac-thyA-CFA/I-AMP，所述質(zhì)粒通過(guò)^y^-衍生物電穿孔大腸桿菌K12株并針對(duì)胸腺嘧啶非依賴性和氨芐青霉素抗性進(jìn)行選擇來(lái)分離。通過(guò)DNA測(cè)序確認(rèn)pAF-tac-thyA-CFA/I-AMP中基因的方向，設(shè)計(jì)引物Pl和P2(表l)以通過(guò)反向PCR去除氨芐青霉素抗性基因。PCR擴(kuò)增產(chǎn)生攜帶除了氨芐青霉素抗性基因以外的完整質(zhì)粒的8800bp片段。該片段然后用Eco31I限制性酶切，并自連。所獲質(zhì)粒是pAF-tac-thyA-CFA/1。用IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)物后，通過(guò)斑點(diǎn)印跡和抑制EUSA確認(rèn)所獲菌株的CFA/I表達(dá)。如表5所示，當(dāng)比較從pAF-tac-thyA-CFA/I表達(dá)CFA/I的//7j^-互補(bǔ)的重組大腸桿菌K12株(T0P10)和攜帶pAF-tac-CFA/I-AMP的起始大腸桿菌K12株(TOP10)之間的CFA/I表達(dá)水平時(shí)，沒有觀察到顯著差異。實(shí)施例4.滅活CF過(guò)表達(dá)重組大腸桿菌株并保留抗原性和免疫原性特性的方法。對(duì)于免疫實(shí)驗(yàn)，重組TOP10-CFA/I株和參照株被滅活以防止口服給藥后在腸中的增殖。為實(shí)現(xiàn)細(xì)菌滅活，通過(guò)適度的福爾馬林處理滅活重組和參照株培養(yǎng)物。如材料和方法所述，通過(guò)在37r用福爾馬林溫和的攪拌各細(xì)菌懸液(l(T細(xì)菌/ml)2小時(shí)，然后不用攪拌在4"C3天完成滅活。為了驗(yàn)證細(xì)菌已經(jīng)被該步驟失活(滅活)，在血液瓊脂平板上涂布100pl體積的已處理細(xì)菌懸液，在37"C孵育一周以檢測(cè)生長(zhǎng)。對(duì)于被測(cè)的兩個(gè)菌株，接種后直至一周每天讀板都未發(fā)現(xiàn)菌落，證明福爾馬林處理的滅活效果。為了評(píng)價(jià)福爾馬林處理后的CFA/I抗原性，測(cè)試重組大腸桿菌TOP10-CFM以及參照株的CFA/I表達(dá)水平。如表6所示，在福爾馬林處理前后兩種菌株均未發(fā)現(xiàn)CFA/I表達(dá)水平的顯著差異。為了評(píng)價(jià)福爾馬林滅活TOP10-CFA/I株與參照株相比的免疫原性，小鼠用相應(yīng)劑量的相應(yīng)菌株口服免疫，并比較免疫應(yīng)答。給予所有小鼠兩次劑量的相應(yīng)菌株，每次劑量109細(xì)菌和lOpg霍亂毒素，在第二次劑量緊挨施用前和后兩周收集血清。按照先前描述(Rudin等人1994)，利用CFA/IELISA方法分析血清。如表7所示，重組株比參照株誘導(dǎo)更高的抗CFA/I的IgA(顯著地)和lgG+IgM效價(jià)。實(shí)施例5.共表達(dá)和過(guò)表達(dá)CFA/I和CS2的菌株的構(gòu)建和表征。本實(shí)施例中我們描述了在相同的細(xì)菌細(xì)胞中以增加的量共表達(dá)兩種CF蛋白的菌株的構(gòu)建。CS2操縱子的克隆。利用引物CS2-正向和CS2-反向引物(表8)通過(guò)PCR擴(kuò)增CS2抗原的表達(dá)和組裝所需的基因Co"、Co詔、OfC和Co"。然后將擴(kuò)增片段連入pAF和pMT載體，產(chǎn)生表達(dá)CS2抗原的不同大腸桿菌K12重組株(TOPIO)。CFA/I和CS2的表達(dá)。TOP10-CS2和大腸桿菌K12-CFA/I-CS2的過(guò)夜培養(yǎng)物用CFA肉湯1/100稀釋，所述肉湯分別添加100或者12.5pg/ml氨芐青霉素或者氯霉素，在37。C和150rev/分鐘孵育2小時(shí)，然后添加IPTG到終濃度lmM，在相同條件下孵育4小時(shí)。然后收集細(xì)菌，重懸于PBS。斑點(diǎn)印跡試驗(yàn)。按照(Binsztein等人1991)所述，特異性抗CFA/IMAb1:6和抗CS2MAb10:3分別用于評(píng)價(jià)克隆菌株中CFA/I或者CS2的表達(dá)。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，將2pl已經(jīng)用PBS洗滌一次并用IPTG誘導(dǎo)CFA/I表達(dá)的細(xì)菌培養(yǎng)物(109細(xì)菌/1111，于PBS)上樣于硝化纖維素濾紙，與MAb孵育然后與和HRP綴合的山羊抗小鼠IgG孵育，每個(gè)1.5小時(shí)。通過(guò)于TBS中的4-氯-1-萘酚-11202進(jìn)行最終顯色，直至15分鐘。電子顯微鏡檢查。將lOpl己經(jīng)用PBS洗滌一次的各種細(xì)菌懸液(10"細(xì)菌/ml，于PBS)加在parafilm上。聚乙烯醇縮甲醛樹脂-包被的載網(wǎng)(grid)被置于懸浮液2分鐘，將載網(wǎng)置于燈下15cm以增加樣品溫度。然后通過(guò)將載網(wǎng)置于parafilm上的25^1的PBS-1%BSA洗滌它們兩次，每次10秒，然后用25^1于PBS-Tween0.05。/。-BSA0.1。/。中稀釋的特異性單克隆抗體孵育載網(wǎng)15分鐘。如上用PBS-1%BSA洗滌載網(wǎng)6次，然后用于PBS-0.1°/。BSA-0.05%Tween中的抗小鼠IgG-金綴合物(AmershamInternational,Amersham，UK)孵育15分鐘。然后用PBS"O.P/。BSA洗滌載網(wǎng)三次，用蒸餾水洗滌三次。通過(guò)將載網(wǎng)加到25pl的1。/。鉬酸銨(pH7.0)中50-60秒，然后將載網(wǎng)在濾紙上風(fēng)干5分鐘進(jìn)行負(fù)染色。載網(wǎng)保存在4。C直到通過(guò)電子顯微鏡檢査。小鼠免疫。雌性Balb/c小鼠(6-8周齡)用于通過(guò)口服途徑的免疫。洗滌福爾馬林滅活的參照株325542-3和58R957的培養(yǎng)物以及重組CF-誘導(dǎo)株TOP10-CFM-CS2，在PBS中重懸到所需細(xì)菌密度。每次免疫使用于0.2mlPBS中的109細(xì)菌和l(HigCT。間隔兩周給予所有小鼠兩次相同的免疫，在緊挨第一次劑量前和第二次劑量后兩周收集血液。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有ELISA和抑制ELISA實(shí)驗(yàn)一式兩份進(jìn)行，在不同天重復(fù)至少三次。每個(gè)特定測(cè)試的斑點(diǎn)印跡實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少兩次。通過(guò)student'st-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，PO.05被認(rèn)為是顯著的。資！CS2的克隆。我們己經(jīng)描述了非產(chǎn)毒性大腸桿菌菌株，過(guò)表達(dá)ETEC定居因子I(CFA/I)的TOP10-CFA/I的構(gòu)建和免疫原性(參見上述實(shí)施例)。相同的表達(dá)載體pAFl和策略用于首先在大腸桿菌K12株(TOP10)表達(dá)CS2，如圖3所示。CS2操縱子由CS2的表達(dá)和組裝所需的基因co"、co岀、cofC和cofD(GenBank登錄號(hào)Z47800)組成。通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得5143bp的完整操縱子(圖3)。該片段然后用Eco311消化，克隆入pAFl載體，產(chǎn)生pAFl-CS2(圖3)，然后電穿孔大腸桿菌K12株(TOP10)，獲得TOP10-pAFl-CS2。通過(guò)應(yīng)用抑制ELISA測(cè)定法，我們發(fā)現(xiàn)菌株TOP10-pAFl-CS2比參照株(58R957)表達(dá)高20倍的CS2(圖4)。為了證明TOP10-pAFl-CS2菌株中CS2的存在，利用特異性抗CS2MAbl0:3作為抗體進(jìn)行IEM。TOP10-pAFl-CS2菌株在其表面表達(dá)大量CS2抗原，沿著完整CF抗原有金顆粒(圖5)。CS2和CFA/I的共表達(dá)。為了共表達(dá)CS2和CFA/I定居因子，我們首先將CS2操縱子克隆入另一個(gè)載體pMT，所述pMT攜帶氯霉素抗性標(biāo)記(Cm,c加)，如圖4所示。首先用XhoI和BamHI限制酶切割pAFl-CS2載體，獲得6720bp的片段，所述片段被克隆入己用Xhol和BamHI切割的pMT載體(圖6)。所獲表達(dá)載體pMT-CS2然后在大腸桿菌K12菌株(TOP10)中增殖，獲得TOP10-pMT-CS2。通過(guò)應(yīng)用斑點(diǎn)印跡測(cè)定，我們發(fā)現(xiàn)菌株TOP10-pMT-CS2比參照株58R957表達(dá)高8倍的CS2(數(shù)據(jù)未顯示)。我們?nèi)缓髮AF-tac-CFA/I-Amp和pMT-tac-CS2-Cm表達(dá)載體電穿孔入TOP10株，產(chǎn)生TOP10-CFA/I-CS2菌株。抑制ELISA測(cè)定顯示TOP10-CFA/I-CS2菌株分別比相應(yīng)參照株表達(dá)高若干倍的CFA/I和CS2(表IO)。培養(yǎng)克隆，利用斑點(diǎn)印跡檢測(cè)兩種表面抗原在不同時(shí)間的表達(dá)，顯示CFA/I和CS2在TOP10-CFA/I-CS2中的穩(wěn)定表達(dá)。分別利用特異性單克隆抗體抗CFA/11:6和抗CS210:3，通過(guò)正M檢測(cè)TOP10-CFA/I-CS2以及參照株325542-3和58R957的CF抗原結(jié)構(gòu)。在相同生長(zhǎng)條件下，與參照株相比，TOP10-CFA/I-CS2菌株在其表面表達(dá)顯著更長(zhǎng)時(shí)間和更多量的CF抗原，以及顯著更多的金顆粒沿著完整CF抗原。為了檢測(cè)TOP10-CFA/I-CS2株在小鼠中的免疫原性，按照材料和方法所述用福爾馬林滅活克隆株。福爾馬林處理后，通過(guò)斑點(diǎn)印跡檢測(cè)CFA/I和CS2的表達(dá)水平，顯示與各個(gè)相應(yīng)參照株相比，克隆株仍然表達(dá)顯著更多量的CFA/I和CS2(圖9)。將TOP10-CFA/I-CS2誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答與參照株325542-3和58R957誘導(dǎo)的進(jìn)行比較。利用福爾馬林滅活的各株細(xì)菌的兩次相同口服給藥免疫Balb/c小鼠。免疫后，通過(guò)ELISA測(cè)定小鼠血清中抗各種CF抗原的抗體，顯示所有用TOP10-CFA/I-CS2或者各參照株免疫的動(dòng)物都作出高水平的血清IgA和IgG+M應(yīng)答(圖10和11)。盡管仍然顯示克隆株的免疫原性，TOP10-CFA/I-CS2免疫小鼠血清中抗CFA/I和CS2的IgA水平與用各相應(yīng)參照株免疫小鼠的水平是相當(dāng)?shù)?圖10)。盡管在克隆和參照株325542-3的抗CFA/I的IgG+M水平中未觀察到顯著差異，但克隆株免疫小鼠的血清中抗CS2的IgG+M水平顯著高于參照株58R957的(圖11)。此外，在施用克隆株或者各參照株的3組小鼠之間未觀察到血清中抗CTIgA效價(jià)的顯著差異(圖12).。實(shí)施例6.幾種共表達(dá)ETECCF的非天然組合的重組大腸桿菌K12株的數(shù)據(jù)。構(gòu)建下列質(zhì)粒，然后基于所需組合，將其中兩種電穿孔入大腸桿菌K12細(xì)菌TOP10。pAF-CFA/I-AmppJT國(guó)C謹(jǐn)國(guó)CmpMT-CS2-CmpJT-CS4-AmppJT-CS6-Amp重組大腸桿菌K12株TOP10-C歸-CS2TOP10-CFA/I-CS6TOP10-CS2-CS4重組大腸桿菌K12株表面上CF共表達(dá)的驗(yàn)證。為了測(cè)定重組大腸桿菌K12株中非天然ETECCF的共表達(dá)，使用兩種不同的測(cè)定，即斑點(diǎn)印跡和抑制ELISA。在斑點(diǎn)印跡測(cè)定中，將2pl于PBS中2-或者3-倍稀釋的全細(xì)菌以109細(xì)菌/1111的初始濃度上樣于硝酸纖維素膜。膜與相應(yīng)抗CFMAb(表2)孵育后，洗滌膜，與抗小鼠IgG-辣根過(guò)氧化物酶綴合物孵育，然后顯色(如材料和方法所述)。如定量ETECCF/CS-因子的抑制ELISA中所述，還可以通過(guò)使用抑制ELISA來(lái)測(cè)定重組和參照株細(xì)菌表面的CF表達(dá)。利用這種測(cè)定，測(cè)定各菌株CF抑制相應(yīng)抗CFMAb與固相結(jié)合的CF結(jié)合的能力，如定量ETECCF/CS-因子的抑制ELISA中所述。斑點(diǎn)印跡結(jié)果列于表9，抑制ELISA結(jié)果列于表10。表h使用的細(xì)菌菌株、質(zhì)粒和引物列表<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>a基于CFA/I操縱子(GeneBank，登錄號(hào)M55661)、CS2操縱子(GeneBank，登錄號(hào)Z47800)、CS6操縱子(GeneBank，登錄號(hào)U04846)設(shè)計(jì)引物。表2:CF抑制ELISA中使用的抗原和抗體<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>定居因子(CF)單克隆抗體(MAb)a檢測(cè)ELISA的包被抗原ELISA的包被濃度命名同種型測(cè)定中的稀釋度抑制ELISA斑點(diǎn)印跡CFA/ICFA/1-181jug/mlCFA/I1:6IgGl1/2001/50CS2CS2-18/71pg/mlCS210:3IgGl1/2001/50CS6rCS60.3pg/mlCS62a:14IgGl1/1001/50MAb是克隆的雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)物濾液(50-100pgIg/ml濾液)。表3.<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>通過(guò)斑點(diǎn)印跡測(cè)定的重組和相應(yīng)參照株中CF相對(duì)量的比較斑點(diǎn)印跡測(cè)定的效價(jià)a表面CF大腸桿菌ETEC重組株參照株CFA/I32(10-52)*4.5(2-7)CS231(29.5-32.5)*3.5(2.8-4.2)CS624(15-33)'2.5(1.3-3.7)a效價(jià)表示初始濃度109細(xì)菌/1111中的最高細(xì)菌稀釋度倒數(shù)，所述稀釋度用相應(yīng)特異性MAb產(chǎn)生可見反應(yīng)；顯示的值是至少3次實(shí)驗(yàn)的算術(shù)平均數(shù)和平均士SD的范圍；就CS2來(lái)說(shuō)，結(jié)果是2次實(shí)驗(yàn)的算術(shù)平均值。*表示顯著差異(p0.05)表4.<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>通過(guò)抑制ELISA測(cè)定的重組和相應(yīng)參照株的抑制效價(jià)倒數(shù)的比較抑制ELISA測(cè)定的效價(jià)a大腸桿菌ETEC表面CF重組株參照株CFA/I595(450-795)*135(105-175)CS267(41-93)*4(3.2-4.8)CS630(23-37)*5.7(4.7-6.7)a效價(jià)表示為初始濃度109細(xì)菌/1111的各細(xì)菌懸液抑制稀釋度倒數(shù)，其在如定量ETECCF/CS-因子的抑制ELISA所述的ELISA中造成特異性MAb與相應(yīng)固相結(jié)合的CF結(jié)合的50%抑制。顯示的值是至少3次實(shí)驗(yàn)的算術(shù)平均值和平均值士SD的范圍。表5.氨芐青霉素抗性和ThyA依賴性重組大腸桿菌株中CFA/I水平的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>a在斑點(diǎn)印跡測(cè)定中，效價(jià)表示與相應(yīng)特異性MAb產(chǎn)生可見和明顯反應(yīng)的細(xì)菌最高稀釋度倒數(shù)；在抑制ELISA中，效價(jià)表示為造成特異性MAb與各CF結(jié)合的50%抑制的抑制效價(jià)倒數(shù)，如定量ETECCF/CS-因子的抑制ELISA所述進(jìn)行計(jì)算。在兩種測(cè)定中，細(xì)菌初始濃度是109細(xì)菌/1111。b結(jié)果是單次實(shí)驗(yàn)的值。e結(jié)果是一次實(shí)驗(yàn)中一式兩份的值。表6.福爾馬林滅活前后重組TOP10-CFA/I株和CFA/I陽(yáng)性參照中CFA/I水平的比較。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>a數(shù)值顯示經(jīng)過(guò)和未經(jīng)滅活的CFA/I水平，通過(guò)抑制ELISA測(cè)定來(lái)測(cè)量。未經(jīng)滅活的CFA/I水平的值被設(shè)定為100%。表7.用重組TOPIO-CFA/I株和CFA/I陽(yáng)性參照株的福爾馬林滅活細(xì)菌口服免疫的小鼠中IgA和IgG+IgM同種型抗CFA/I效價(jià)的比較。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>a數(shù)值顯示基于兩次實(shí)驗(yàn)的logK)效價(jià)士SE的幾何平均值倒數(shù)，對(duì)于每種待測(cè)菌株利用3只小鼠進(jìn)行。'表示顯著差異(P<0.05)。表S.使用的菌株、質(zhì)粒和引物列表。.<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>表9.斑點(diǎn)印跡結(jié)果。通過(guò)斑點(diǎn)印跡測(cè)定的重組和相應(yīng)參照株中CF相對(duì)量的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>a效價(jià)顯示初始濃度為1(f細(xì)菌/ml的細(xì)菌最高稀釋度倒數(shù)，與相應(yīng)特異性MAb產(chǎn)生可見反應(yīng)。表10.抑制ELISA結(jié)果。通過(guò)抑制ELISA測(cè)定的重組和相應(yīng)參照株的抑制效價(jià)倒數(shù)的比較。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>a效價(jià)表示為初始濃度1(^細(xì)菌/ml的各細(xì)菌懸液的抑制稀釋度倒數(shù)，其在如定量ETECCF/CS-因子的抑制ELISA所述的ELISA中造成特異性MAb與相應(yīng)固相結(jié)合的CF結(jié)合的50%抑制。*斑點(diǎn)印跡顯示比表9中參照野生型株高4倍的CS2(TOP10-CS2-CS4中)。表ll.福爾馬林滅活重組大腸桿菌K12株的免疫原性<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>a數(shù)值顯示基于兩次實(shí)驗(yàn)的loglO效價(jià)+SEM的幾何平均值倒數(shù)，對(duì)于每種待測(cè)菌株利用3只小鼠進(jìn)行。*表示顯著差異(尸<0.05)。參考文獻(xiàn)Ahren,C.M.Jertbom,andA.M.Svennerholm.1998.Intestinalimmuneresponsestoaninactivatedoralenterotoxigenic_Esc/zen-c/n'aco//vaccineandassociatedimmunoglobulinAresponsesinblood.Infect.Immun.66:3311-3316.<formula>formulaseeoriginaldocumentpage26</formula>choleratoxinenhancesinvitroantigenpresentationandinductionofbystandersuppressioninvivo.Immunology10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