一種尿液外泌體elisa的檢測(cè)方法及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供一種外泌體檢測(cè)的ELISA方法，具體步驟包括：樣本收集、包被孵育、封閉、加樣、終止反應(yīng)、判定結(jié)果、構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行臨床樣本測(cè)試。本發(fā)明還提供一種檢測(cè)尿液外泌體的ELISA檢測(cè)方法在膀胱癌疾病的評(píng)估和防治方面的應(yīng)用。本方法具有高度特異性的特點(diǎn)，本發(fā)明的檢測(cè)方法也不需要昂貴且精密的實(shí)驗(yàn)儀器，具有很大的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】
_種尿液外泌體ELISA的檢測(cè)方法及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種尿液外泌體ELISA檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]膀胱癌是指發(fā)生在膀胱黏膜上的惡性腫瘤。是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是全身十大常見(jiàn)腫瘤之一。占我國(guó)泌尿生殖系腫瘤發(fā)病率的第一位，而在西方其發(fā)病率僅次于前列腺癌，居第2位。檢查方法包括尿常規(guī)檢查、尿脫落細(xì)胞學(xué)、尿腫瘤標(biāo)記物、腹部和盆腔B超等檢查。根據(jù)上述檢查結(jié)果決定是否行膀胱鏡、靜脈尿路造影、盆腔CT或/和盆腔MRI等檢查明確診斷。其中，膀胱鏡檢查是診斷膀胱癌的最主要方法。然而膀胱鏡檢測(cè)費(fèi)用高，并不適用于基層醫(yī)療單位或者貧困地區(qū)的普及應(yīng)用，臨床上亟待尋找一種針對(duì)膀胱癌檢測(cè)的生物標(biāo)志物來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。外泌體(exosomes)是一種直徑約為40-120nm，具有雙層質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的囊泡，由細(xì)胞通過(guò)胞吐作用釋放至細(xì)胞外隙或生物學(xué)體液中。近年來(lái)，外泌體成為新的研究熱點(diǎn)，因其內(nèi)包含來(lái)源細(xì)胞所特有的mRNAs、micr0RNAs及蛋白等多種信號(hào)分子，在信號(hào)傳導(dǎo)和免疫系統(tǒng)中起重要作用，并由完整的膜性結(jié)構(gòu)包裹而減少微環(huán)境干擾，這使其在疾病診斷方面具有獨(dú)特的優(yōu)越性，是研究生物標(biāo)志物和進(jìn)行腫瘤免疫的新的生物材料，同時(shí)也具有治療潛力。
[0003]目前針對(duì)外泌體的研究主要分為分離技術(shù)和檢測(cè)技術(shù)。分離技術(shù)包括超速離心法、過(guò)濾離心法、密度梯度超速離心法、免疫磁珠結(jié)合超速離心法和色譜法等。檢測(cè)技術(shù)主要包括:掃描電子顯微鏡觀察形態(tài)(但SEM對(duì)樣品的預(yù)處理和制備上面要求較高，樣品的準(zhǔn)備階段比較復(fù)雜，不適合對(duì)外泌體進(jìn)行大量快速的測(cè)量，而且由于外泌體經(jīng)過(guò)了預(yù)處理和制備過(guò)程，無(wú)法準(zhǔn)確的進(jìn)行外泌體濃度的測(cè)量)、動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)(但由于動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)是測(cè)量光強(qiáng)的波動(dòng)數(shù)據(jù)，所以大顆粒的光強(qiáng)波動(dòng)信號(hào)會(huì)掩蓋較小顆粒的光強(qiáng)波動(dòng)信號(hào)，所以動(dòng)態(tài)光散射不適合大小不一的復(fù)雜外泌體樣本的測(cè)量，只適合通過(guò)色譜法制備的大小均一的外泌體的尺寸測(cè)量，并且無(wú)法測(cè)量樣品中外泌體的濃度。)、流式細(xì)胞儀檢測(cè)技術(shù)(流式細(xì)胞儀不僅可以檢測(cè)囊泡的大小、數(shù)量，而且通過(guò)熒光標(biāo)記可以檢測(cè)囊泡的來(lái)源，將囊泡進(jìn)行分類，因此，流式細(xì)胞儀是進(jìn)行囊泡快速、高通量、多參數(shù)檢測(cè)的最優(yōu)選擇。然而，傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀針對(duì)的樣本主要是細(xì)胞，散射光的檢測(cè)極限通常是300-500nm，而大多數(shù)細(xì)胞外囊泡的直徑都在300nm以下，因此很難進(jìn)行精確地定量和定性分析。)、納米微粒追蹤分析技術(shù)(是一種比較新穎的研究納米顆粒的方法，可以直接和實(shí)時(shí)的觀測(cè)納米顆粒。由于外泌體表面有標(biāo)志物CD9、CD63等跨膜分子的存在，在復(fù)雜的背景環(huán)境下(如血清中)，可以用熒光抗體標(biāo)記外泌體，再用NTA的熒光測(cè)量功能實(shí)現(xiàn)在復(fù)雜背景下對(duì)外泌體的測(cè)量，但是需要精密的儀器)、流式細(xì)胞儀分析技術(shù)(但是流式細(xì)胞分析一次只能針對(duì)一個(gè)標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，夕卜泌體太小，由目前的流式細(xì)胞儀設(shè)備檢測(cè)，有必要先綁定外來(lái)抗體包被的磁珠，需要精密的儀器設(shè)備，且操作繁瑣、敏感度各異)、免疫印跡檢測(cè)技術(shù)(操作過(guò)程復(fù)雜)和熒光定量PCR檢測(cè)分析microRNA(提取核酸步驟復(fù)雜，需要昂貴的實(shí)驗(yàn)儀器)。因此，發(fā)展一種能夠可靠、快速、經(jīng)濟(jì)地?zé)o創(chuàng)檢測(cè)外泌體尤其是膀胱癌患者來(lái)源的外泌體的方法非常必要。
[0004]外泌體在尿液中可以穩(wěn)定存在，尤其是尿液樣品可以在非創(chuàng)傷性損傷的前提下大量獲得。因此，如果能夠檢測(cè)尿液外泌體中的癌癥信息，則有望將其用于癌癥的無(wú)創(chuàng)診斷、監(jiān)控等臨床應(yīng)用。然而，實(shí)際上，由于單位體積尿液中的外泌體含量非常低，采用一般方法單次提取得到的外泌體，根本無(wú)法滿足后續(xù)檢測(cè)的要求，所以目前針對(duì)外泌體的檢測(cè)主要是先對(duì)樣本中的外泌體進(jìn)行濃縮處理，之后再采取一定的表征測(cè)量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種外泌體檢測(cè)的ELISA方法，該方法可有效檢測(cè)膀胱癌患者體內(nèi)外泌體的量，檢測(cè)結(jié)果特異性強(qiáng)，實(shí)用性強(qiáng)。在膀胱癌患者外泌體檢測(cè)、監(jiān)測(cè)等方面具有一定的應(yīng)用前景。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
一種外泌體ELISA檢測(cè)技術(shù)方案，具體步驟如下:
(I)樣本收集:收集健康志愿者/膀胱癌患者尿液樣本100 ml，采用2，000 g室溫離心10-15分鐘。去除細(xì)胞及其殘片，將上清液100，OOOg 4°C離心60-70分鐘，收集外泌體沉淀并用PBS (pH 7.0)重懸外泌體，形成外泌體重懸液，保存?zhèn)溆谩?br>[0007](2)包被孵育:按每孔100 yL將外泌體重懸液包被到96孔酶標(biāo)板孔，4 °C孵育1_2小時(shí)一定時(shí)間后，小心移除上清液。
[0008](3)封閉:按每孔100 yL加入1%的BSA封閉液，清清搖勻，4 °(:過(guò)夜或者37 °(:溫育1-2小時(shí)；一定時(shí)間后小心移除孔內(nèi)液體，用排槍按每孔200yL添加PBS洗滌緩沖液(pH7.4)，靜置2-3分鐘，小心后移除孔內(nèi)液體，重復(fù)洗滌2-4數(shù)次后拍干；
每次檢測(cè)同時(shí)設(shè)定空白對(duì)照、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)樣本重復(fù)封閉2-3次。
[0009](4)加樣:對(duì)封閉后的樣本進(jìn)行依次進(jìn)行添加抗體和添加酶標(biāo)反應(yīng)物，之后加底物顯色.(5)終止反應(yīng):按每孔50 yL加入2mol/L H2SO4終止反應(yīng)液，在酶標(biāo)儀內(nèi)測(cè)0D45Q值，并記錄結(jié)果。
[0010](6)判定結(jié)果:試驗(yàn)組OD45q/陰性對(duì)照組OD45Q值大于或等于2.1為陽(yáng)性。
[0011](7)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)判定結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)曲線的對(duì)比進(jìn)行臨床樣本測(cè)試。
[0012]在采用上述技術(shù)方案的同時(shí)，本發(fā)明還可以采用或者組合采用以下進(jìn)一步的技術(shù)方案:
所述添加抗體的步驟具體包括:按每孔100 yL加入l:200-l:500的ant1-CD63(b1tin-labeled)抗體(即濃度為2-5 yg/mL)，清清搖勻，37 °C并溫育1-2小時(shí)。小心后移除孔內(nèi)液體，用排槍按每孔200 yL添加PBS洗滌緩沖液(pH 7.4的)，靜置2-3分鐘，小心后移除孔內(nèi)液體，重復(fù)洗滌2-4數(shù)次后拍干。
[0013]按每孔100 yL加入I: 2000-1:5000的HRP(streptavidin-labeled)(即濃度為0.2-
0.5 yg/mL)，，清清搖勻，37 °C并溫育1-2小時(shí)。小心后移除孔內(nèi)液體，用排槍按每孔200 yL添加PBS洗滌緩沖液(pH 7.4的)，靜置2-3分鐘，小心后移除孔內(nèi)液體，重復(fù)洗滌2-4數(shù)次后拍干。
[0014]所述加底物顯色的步驟具體包括:按每孔100此加入顯色液，37 °C—定溫度下避光顯色，10-30分鐘后觀察結(jié)果。
[0015]所述步驟(2)中包被于酶標(biāo)板上的包被液為0.1M的NaHCO3，使用前于4°C冰箱放置
1-2小時(shí)。
[0016]洗滌所用的洗滌液為磷酸鹽緩沖液PBS(pH 7.4 土 0.2)，洗滌次數(shù)為2_4次。
[0017]靜置過(guò)程中的靜置反應(yīng)為生物素和鏈霉親合素結(jié)合，其反應(yīng)溫度為35-37V，反應(yīng)時(shí)間為1-2小時(shí)。
[0018]所述顯色液為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，為HRP和TMB結(jié)合反應(yīng)，顯色反應(yīng)時(shí)間一般為10-30分鐘，反應(yīng)溫度一般為35-37°C ;所述的終止反應(yīng)液為2M濃硫酸。
[0019]所述構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟具體包括:將分離自尿液中的外泌體連讀系列倍比稀釋成不同的濃度，根據(jù)濃度不同的外泌體構(gòu)建外泌體ELISA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線；即將所獲得的外泌體懸液，按照1倍系列稀釋法，即原液、1:10、1:100、1:1，000、1:10,000和1:100，000這6個(gè)梯度分別稀釋，之后對(duì)每個(gè)梯度的稀釋液分別進(jìn)行ELISA檢測(cè)，并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果的吸光度值建立對(duì)應(yīng)的曲線，S卩為ELISA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0020]本發(fā)明所要解決的另一個(gè)問(wèn)題是提供一種檢測(cè)尿液外泌體的ELISA檢測(cè)方法在膀胱癌疾病的評(píng)估和防治方面的應(yīng)用。
[0021]本發(fā)明首先進(jìn)行構(gòu)建外泌體ELISA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，即將分離自尿液中的外泌體連讀系列倍比稀釋成不同的濃度，之后構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。后續(xù)，樣本收集測(cè)定結(jié)果與已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對(duì)比，來(lái)判定患者體內(nèi)外泌體的含量。
[0022]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下:
I)本發(fā)明利用外泌體跨膜蛋白⑶6 3這一特有的標(biāo)志物，建立了一種ELISA反應(yīng)體系和快速檢測(cè)方法，該反應(yīng)體系與檢測(cè)方法，可用于檢測(cè)膀胱癌患者尿液樣本或膀胱癌細(xì)胞系培養(yǎng)液上清中外泌體的含量，本方法具有高度特異性的特點(diǎn)。
[0023]2)本發(fā)明的檢測(cè)對(duì)象是從人體中排出的尿液，容易獲得，而且不會(huì)對(duì)人體造成任何負(fù)擔(dān)和創(chuàng)傷，本發(fā)明的檢測(cè)方法也不需要昂貴且精密的實(shí)驗(yàn)儀器，具有很大的應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0024]附圖用于和具體實(shí)施案例結(jié)合對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0025]圖1是exosomes掃描電子顯微鏡圖片。
[0026]圖2是外泌體ELISA檢測(cè)原理圖。
[0027]圖3是外泌體檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0028]圖4是ELISA檢測(cè)方法臨床檢測(cè)箱線圖。
[0029]圖5是ROC曲線分析結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0030]下面結(jié)合具體實(shí)例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)注意，這些實(shí)例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0031]實(shí)施案例中未注明具體試驗(yàn)條件和試驗(yàn)方法的按照常規(guī)條件和方法或者制造商所建議的條件予以實(shí)施。
[0032]本發(fā)明中未特別說(shuō)明的各種儀器和試劑均為本領(lǐng)域熟知的市售產(chǎn)品，可通過(guò)商業(yè)途徑米購(gòu)獲得。
[0033]實(shí)施案例:參見(jiàn)圖1、圖2、圖3，一種尿液外泌體ELISA檢測(cè)方法，包括如下步驟:
I)在患者知情及倫理委員會(huì)同意的前提下，收集膀胱癌患者(臨床活檢已證實(shí)為膀胱癌)尿液樣本16份，每份100ml，在室溫2，OOOg的離心條件下去除細(xì)胞及大的碎片，然后得到上層清液。
[0034]2)將I)得到的上層清夜，于4°C條件下，100，OOOg超速離心60分鐘，棄掉上清取沉淀，并用ImL pH 7.4的PBS緩沖液重懸外泌體，得到外泌體重懸液(exosomes)(如圖1)。
[0035]3)將2)所得外泌體懸液，按照10倍倍比進(jìn)行系列稀釋，分別保存，以備后續(xù)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0036]4)將3)所備外泌體進(jìn)行ELISA檢測(cè)(原理如圖2)，首先進(jìn)行樣本包被孵育，每孔取100 yL外泌體懸液添加到96孔酶標(biāo)板中，4 °C孵育1-2小時(shí)，小心移除上清液體。
[0037]5)向4)酶標(biāo)板每孔加入100 yL 1%的BSA封閉液，清清搖勻，4 °(:過(guò)夜或者37 °C溫育1-2小時(shí)；小心移除孔內(nèi)液體，用排槍每孔添加200 yL pH 7.4的PBS洗滌緩沖液，靜置
2-3分鐘，小心移除孔內(nèi)液體，重復(fù)洗滌2-4次后拍干;每次檢測(cè)同時(shí)設(shè)定空白對(duì)照、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)樣本重復(fù)2-3次。
[0038]6)向5)酶標(biāo)板添加抗體，每孔加入1:200-1: 500稀釋的100 yL的anti_CD63(b1tin-labeled)抗體(即濃度為2-5 yg/mL)，清清搖勻，37 °C溫育1_2小時(shí)。小心移除孔內(nèi)液體，用排槍每孔添加200 yL pH 7.4的PBS洗滌緩沖液，靜置2-3分鐘，小心移除孔內(nèi)液體，重復(fù)洗滌2-4次后拍干。
[0039]7)向6)酶標(biāo)板加酶標(biāo)反應(yīng)物，每孔加入1:2000-1: 5000稀釋的100 yL的HRP(streptavidin-labeled)(即濃度為0.2-0.5 yg/mL)，清清搖勾，37 °C溫育 1-2小時(shí)。小心移除孔內(nèi)液體，用排槍每孔添加200 yL pH 7.4的PBS洗滌緩沖液，靜置2-3分鐘，小心移除孔內(nèi)液體，重復(fù)洗滌2-4次后拍干。
[0040]8)向7)酶標(biāo)板加底物顯色，每孔加入四甲基聯(lián)苯胺TMB顯色液100 yL，37 °C避光顯色10-30分鐘。
[0041 ] 9)向8)酶標(biāo)板加終止反應(yīng)液，每孔加入2 mo I/L H2S04終止反應(yīng)液50 yL，在酶標(biāo)儀內(nèi)測(cè)0D450值，并記錄結(jié)果。
[0042]10)將9)所得數(shù)據(jù)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖3)，同時(shí)采用上述1)-9)步驟進(jìn)行膀胱癌患者外泌體含量檢測(cè)，并進(jìn)行ROC曲線分析和構(gòu)建箱線圖。檢測(cè)結(jié)果如圖4。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種檢測(cè)尿液外泌體的ELISA檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下具體步驟: (1)樣本收集:收集健康志愿者/膀胱癌患者尿液樣本室溫離心后，上清液離心收集外泌體沉淀并用PBS (pH 7.0)重懸外泌體，形成外泌體重懸液，保存?zhèn)溆茫?(2)包被孵育:按每孔100此將外泌體重懸液包被到酶標(biāo)板孔，孵育一定時(shí)間后，移除上清液； (3)封閉:按每孔100yL加入封閉液，一定時(shí)間后移除孔內(nèi)液體，按每孔洗滌緩沖液(pH 7.4)，靜置后移除孔內(nèi)液體，重復(fù)洗滌數(shù)次后拍干； 每次檢測(cè)同時(shí)設(shè)定空白對(duì)照、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)樣本重復(fù)封閉2-3次； (4)加樣:對(duì)封閉后的樣本進(jìn)行依次進(jìn)行添加抗體和添加酶標(biāo)反應(yīng)物，之后加底物顯色； (5 )終止反應(yīng):按每孔50 yL加入終止反應(yīng)液，在酶標(biāo)儀內(nèi)測(cè)0D45Q值，并記錄結(jié)果； (6)判定結(jié)果:試驗(yàn)組OD45q/陰性對(duì)照組OD45q值大于或等于2.1為陽(yáng)性； (7)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)判定結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)曲線的對(duì)比進(jìn)行檢測(cè)。2.如權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)尿液外泌體的ELISA檢測(cè)方法，其特征在于，所述添加抗體的步驟具體包括:按每孔100 yL加入I: 200-1:500的ant1-Q)63(b1tin-labeled)抗體(即濃度為2-5 yg/mL)并溫育后移除孔內(nèi)液體，按每孔200 yL添加I3BS洗滌緩沖液(pH 7.4的)，靜置后移除孔內(nèi)液體，重復(fù)洗滌數(shù)次后拍干。3.如權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)尿液外泌體的ELISA檢測(cè)方法，其特征在于，所述添加酶標(biāo)反應(yīng)物的步驟具體包括:按每孔100 yL加入1:2000-1:5000的HRP( streptavidin-labeled)(即濃度為0.2-0.5 yg/mL)，并溫育后移除孔內(nèi)液體，按每孔200 yL添加I3BS洗滌緩沖液(pH 7.4的)，靜置后移除孔內(nèi)液體，重復(fù)洗滌數(shù)次后拍干。4.如權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)尿液外泌體的ELISA檢測(cè)方法，其特征在于，所述加底物顯色的步驟具體包括:按每孔100此加入顯色液，一定溫度下避光顯色，10-30分鐘后觀察結(jié)果。5.如權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)尿液外泌體的ELISA檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟(2)中包被于酶標(biāo)板上的包被液為0.1M的NaHCO3，使用前于4°C冰箱放置1_2小時(shí)。6.如權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)尿液外泌體的ELISA檢測(cè)方法，其特征在于，洗滌所用的洗滌液為磷酸鹽緩沖液PBS(pH 7.4 土 0.2)，洗滌次數(shù)為2-4次。7.如權(quán)利要求1、2或3所述的一種檢測(cè)尿液外泌體的ELISA檢測(cè)方法，其特征在于，靜置過(guò)程中的靜置反應(yīng)為生物素和鏈霉親合素結(jié)合，其反應(yīng)溫度為35-37°C，反應(yīng)時(shí)間為1-2小時(shí)。8.如權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)尿液外泌體的ELISA檢測(cè)方法，其特征在于，所述顯色液為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，為HRP和TMB結(jié)合反應(yīng)，顯色反應(yīng)時(shí)間一般為10-30分鐘，反應(yīng)溫度一般為35-37°C ；所述的終止反應(yīng)液為2M濃硫酸。9.如權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)尿液外泌體的ELISA檢測(cè)方法，其特征在于，所述構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟具體包括:將分離自尿液中的外泌體連讀系列倍比稀釋成不同的濃度，根據(jù)濃度不同的外泌體構(gòu)建外泌體ELISA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。10.—種檢測(cè)尿液外泌體的ELISA檢測(cè)方法在膀胱癌疾病的評(píng)估和防治方面的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】G01N33/574GK106053811SQ201610387088
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年6月5日
【發(fā)明人】梁利國(guó), 王書(shū)崎
【申請(qǐng)人】浙江大學(xué)