血清淀粉樣蛋白a(saa)測定試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種血清淀粉樣蛋白A(SAA)測定試劑盒及其測定方法,屬于醫(yī)學生物檢測技術領域。該試劑盒包括試劑1、試劑2、校準品及質控品,試劑1包含Tris?HCl、疊氮鈉、PEG?6000,試劑2包含Tris?HCl、包被了抗人血清淀粉樣蛋白A抗體膠乳顆粒、疊氮鈉、辛基苯酚聚氧乙烯和尼泊金甲酯,校準品包含血清淀粉樣蛋白A抗原、疊氮鈉,質控品包含血清淀粉樣蛋白A抗原、疊氮鈉。本發(fā)明提供的一種血清淀粉樣蛋白A(SAA)測定試劑盒及其測定方法,采用膠乳免疫比濁技術,具有分析靈敏度高、結果準確、操作簡單、成本適合等優(yōu)點,便于推廣。
【專利說明】
血清淀粉樣蛋白A(SAA)測定試劑盒
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬醫(yī)學生物檢測技術領域,具體涉及一種血清淀粉樣蛋白A(SAA)測定試劑 盒及其使用方法。
【背景技術】
[0002] 血清淀粉樣蛋白A(serum amyloid A,SAA)是一種急性時限反應蛋白,屬于載脂蛋 白家族中的異質類蛋白質,相對分子量約12 000。在急性時限反應中,經IL-1、IL-6和TNF刺 激,SAA在肝臟中由被激活的巨噬細胞和纖維母細胞合成,可升高到最初濃度的100-1000 倍,但半衰期極短,只有50分鐘左右。血清淀粉樣蛋白A與高密度脂蛋白(HDL)有關,它能在 炎癥期間調節(jié)高密度脂蛋白的代謝。血清淀粉樣蛋白A-個特別重要的特性是其降解產物 能以淀粉樣蛋白A(AA)原纖維的方式沉積在不同的器官中,在慢性炎癥疾病中這是一種嚴 重的并發(fā)癥。
[0003] 與C反應蛋白(CRP)類似,血清淀粉樣蛋白A的含量濃度是反映感染性疾病早期炎 癥的敏感指標,有助于診斷炎癥、評估其活性、監(jiān)控其活動及治療。但是,血清淀粉樣蛋白A 檢測在診斷發(fā)生病毒感染、腎移植排斥反應的患者(特別是進行免疫抑制治療的患者)以及 用腎上腺皮質激素治療的囊性纖維化患者方面,比C反應蛋白更確鑿。研究發(fā)現,在患炎性 關節(jié)炎的案例中,血清淀粉樣蛋白A與疾病活動性的關系最密切。同時檢測C反應蛋白和血 清淀粉樣蛋白A能提高對感染的診斷靈敏度。對于淀粉樣蛋白A淀粉樣變性患者,以將血清 淀粉樣蛋白A水平回復至正常為宗旨的治療,能改善病情。
[0004]目前已知檢測血清淀粉樣蛋白A的試劑盒較少,方法也存在較大的缺陷,如測定靈 敏度不足,操作繁瑣,成本昂貴等,均不利于臨床推廣使用。
【發(fā)明內容】
[0005] 本發(fā)明提供一種血清淀粉樣蛋白A(SAA)測定試劑盒。
[0006] 本發(fā)明還提供上述試劑盒的檢測方法。
[0007] 為解決上述技術問題,本發(fā)明采用的技術方案如下:
[0008] -種血清淀粉樣蛋白A(SAA)測定試劑盒,它包括:試劑1(緩沖液)、試劑2(反應 液)、校準品及質控品。
[0009] 上述血清淀粉樣蛋白A(SAA)測定試劑盒,具體包括如下組分:
[0010] (1)試劑l:Tris lOOmM,疊氮鈉5g/L,PEG-6000 4g/L,PH值為8.1;
[0011] (2)試劑2:Tris lOOmM,疊氮鈉lg/L,辛基苯酚聚氧乙烯lg/L,尼泊金甲酯lg/L,抗 人血清淀粉樣蛋白A抗體膠乳顆粒1 g/L,PH值為6.0;
[0012] (3)校準品:水平1含血清淀粉樣蛋白A抗原6.25mg/L,疊氮鈉5g/L,水平2含血清淀 粉樣蛋白A抗原12.5mg/L,疊氮鈉5g/L,水平3含血清淀粉樣蛋白A抗原25mg/L,疊氮鈉5g/L, 水平4含血清淀粉樣蛋白A抗原50mg/L,疊氮鈉5g/L;
[0013] ⑷質控品:血清淀粉樣蛋白A抗原10mg/L,疊氮鈉5g/L。
[0014] 所述的試劑1、試劑2、校準品及質控品的溶劑為電導率(25°C)不大于O.lmS/m的純 凈水。
[0015]所述的抗人血清淀粉樣蛋白A抗體為兔抗人多克隆抗體。
[0016] 所述的膠乳顆粒為粒徑為80-100nm。
[0017 ]所述的PH值調節(jié)試劑為ImM的鹽酸溶液。
[0018] 所述檢測試劑盒用于定量測定血清中血清淀粉樣蛋白A的含量。
[0019] 本發(fā)明第二方面提供所述測定試劑盒的檢測方法,包括如下步驟:
[0020] 1)準備編號為1、2、3、4的4支反應管;
[0021] 2)同時在第1反應管內加入試劑1 150yL,水平1校準品3yL混合均勻,在第2反應管 內加入試劑1 150yL,水平2校準品3yL混合均勻,在第3反應管內加入試劑1 150yL,水平3校 準品3yL混合均勻,在第4反應管內加入試劑1 150yL,水平4校準品3yL混合均勻,4支反應管 均孵育5分鐘;
[0022] 3)5分鐘孵育結束后,同時在第1反應管內加入試劑2 150yL混合均勻,在第2反應 管內加入試劑2 150yL混合均勻,在第3反應管內加入試劑2 150yL混合均勻,在第4反應管 內加入試劑2 150yL混合均勻,均孵育半分鐘;
[0023] 4)半分鐘孵育結束后,分別讀取1、2、3、4反應管吸光度心"12,心3,心4;
[0024] 5)繼續(xù)孵育5分鐘后,再次分別讀取1、2、3、4反應管吸光度A21,A22,A23,A 24;
[0025] 6)分別以4個不同濃度水平校準品濃度為橫坐標,以(A2i-An)、(A22-A12)、(A23-A13)、(A24-A14)為縱坐標作一標準曲線圖;
[0026] 7)再次準備1支反應管,在反應管內加入試劑1 150yL,檢測樣本3yL混合均勻并孵 育5分鐘;
[0027] 8)5分鐘孵育結束后,在反應管內加入試劑2 150yL混合均勻并孵育半分鐘,讀取 吸光度A1;
[0028] 9)繼續(xù)孵育5分鐘,讀取吸光度A2;
[0029] 10)計算A2-A1,然后在標準曲線上找出對應的濃度值,即為樣本中血清淀粉樣蛋 白A的含量。
[0030] 所述的反應孵育溫度為37°C。
[0031]本發(fā)明的有益效果為:
[0032]本發(fā)明所提供的一種血清淀粉樣蛋白A(SAA)測定試劑盒,采用膠乳免疫比濁技 術,并提供配套的校準品及質控品,具有測定結果準確、檢測靈敏度高、方便快捷、穩(wěn)定性 好、特異性高、成本低廉等優(yōu)點,利于臨床推廣使用。
【具體實施方式】
[0033]根據下述實施例,可以更好地理解本發(fā)明。然而,本領域的技術人員容易理解,實 施例僅用于說明本發(fā)明,而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。
[0034]實施例1:抗血清淀粉樣蛋白A抗體膠乳顆粒制備 [0035] 1)配制50mM的MES緩沖液,PH值為6 ? 0;
[0036] 2)用上述MES緩沖液稀釋膠乳微球,濃度為l%(v/v);
[0037] 3)在膠乳微球懸浮液中加入EDAC,加入濃度為40mg/ml,在室溫孵育40分鐘;
[0038] 4)用相同體積的MES緩沖液洗滌膠乳微球,然后13000g/min離心30分鐘,再次用相 同體積的MES緩沖液洗滌膠乳微球,然后13000g/min離心30分鐘,然后再將膠乳微球溶于 MES緩沖液中;
[0039] 5)將兔抗人血清淀粉樣蛋白A抗體溶于上述MES緩沖液中,濃度為lmg/mL;
[0040] 6)將抗體溶液和膠乳微球懸浮液混合,37 °C攪拌反應3小時;
[0041 ] 7)在混合液中加入乙醇胺,加入量為2.5yL/mL,攪拌反應10分鐘;
[0042] 8)除去未結合的抗體,將包被好的抗體膠乳顆粒貯存在MES緩沖液中。
[0043]實施例2:試劑盒的制備方法
[0044] (1)試劑l:Tris lOOmM,疊氮鈉 5g/L,PEG-6000 4g/L,PH值為8.1;
[0045] (2)試劑2:1'1^8 10〇1111,疊氮鈉]^/1,辛基苯酸聚氧乙稀]^/1,尼泊金甲酯]^/1,抗 人血清淀粉樣蛋白A抗體膠乳顆粒1 g/L,PH值為6.0;
[0046] (3)校準品:水平1含血清淀粉樣蛋白A抗原6.25mg/L,疊氮鈉5g/L,水平2含血清淀 粉樣蛋白A抗原12.5mg/L,疊氮鈉5g/L,水平3含血清淀粉樣蛋白A抗原25mg/L,疊氮鈉5g/L, 水平4含血清淀粉樣蛋白A抗原50mg/L,疊氮鈉5g/L;
[OO47] (4)質控品:血清淀粉樣蛋白A抗原10mg/L,疊氮鈉5g/L。
[0048]實施例3:檢測方法
[0049] 本實施例描述的血清淀粉樣蛋白A測定試劑盒,在使用時采用具有雙試劑功能的 全自動生化分析儀,如日立7180全自動生化分析儀等,利用兩點終點法進行測定。將試劑1 和試劑2按1:1放于儀器試劑位上,在樣本盤相應位置上放置好純凈水、校準品和樣本,操作 如下表:
[0050] 表1實施例2試劑檢測方法
[0052]計算:SAA含量(mg/L) = A Ai陡/ A Ai陡X Q濉 [0053]實施例4:分析靈敏度驗證實驗
[0054]用實施例2試劑盒測定已知濃度的樣本,記錄吸光度差值。檢測結果如表2所示。 [0055]表2分析靈敏度實驗結果
[0057]全自動生化分析儀在吸光度大于0.001時均可準確的獲得檢測結果,且儀器噪音 對檢測結果影響較少。本實驗在參考范圍下限(2.Omg/L)及參考范圍上限(8.Omg/L)均取得 了遠大于0.001的吸光度,說明本發(fā)明試劑盒具有很好的分析靈敏度,能很好的滿足臨床檢 測需求。
[0058]實施例5:穩(wěn)定性研究
[0059] (1)在2_8°C儲存條件下,分別在0個月、12個月和24個月對同一標準品樣本(血清 淀粉樣蛋白A抗原含量2.Omg/L)進行測定,每個樣本測定10次,取均值。結果表明(見表3), 測值差異非常小,說明實施例2制備的檢測試劑盒在2-8度儲存條件下至少可以穩(wěn)定24個月 以上。
[0062]對比例試劑盒除試劑2組成與實施例2存在區(qū)別外,其他均同實施例2,具體如下: [0063] 對比例1:試劑2組成為:Tris 100mM,疊氮鈉2g/L,BSA lg/L,抗人血清淀粉樣蛋白 A抗體膠乳顆粒lg/L,PH值為7.5;
[0064] 對比例2:試劑2組成為:Tris 100mM,疊氮鈉lg/L,抗人血清淀粉樣蛋白A抗體膠乳 顆粒lg/L,PH值為6.0;
[0065] 對比例3:試劑2組成為:Tris 100mM,疊氮鈉 lg/L,尼泊金甲酯lg/L,抗人血清淀粉 樣蛋白A抗體膠乳顆粒1 g/L,PH值為6.0;
[0066] 對比例4:試劑2組成為:Tris 100mM,疊氮鈉 lg/L,辛基苯酸聚氧乙稀lg/L,抗人血 清淀粉樣蛋白A抗體膠乳顆粒1 g/L,PH值為6.0。
[0067] (2)將上述試劑盒中的試劑2在37°C下放置7天,通過儀器檢測放置3天和7天后的 試劑2本身的吸光度變化(A^i-A妖),具體如下:
【主權項】
1. 一種血清淀粉樣蛋白A(SAA)測定試劑盒,它包括:試劑1(緩沖液)、試劑2(反應液)、 校準品及質控品。2. 根據權利要求1所述的血清淀粉樣蛋白A(SAA)測定試劑盒,其特征在于,所述試劑1 組成為:Tris lOOmM,疊氮鈉5g/L,PEG-6000 4g/L,PH值為8.1。3. 根據權利要求1所述的血清淀粉樣蛋白A(SAA)測定試劑盒,其特征在于,所述試劑2 組成為:Tris lOOmM,疊氮鈉 lg/L,辛基苯酸聚氧乙稀lg/L,尼泊金甲酯lg/L,抗人血清淀粉 樣蛋白A抗體膠乳顆粒1 g/L,PH值為6.0。4. 根據權利要求1所述的血清淀粉樣蛋白A(SAA)測定試劑盒,其特征在于,所述校準品 為:水平1含血清淀粉樣蛋白A抗原6.25mg/L,疊氮鈉5g/L,水平2含血清淀粉樣蛋白A抗原 12.5mg/L,疊氮鈉5g/L,水平3含血清淀粉樣蛋白A抗原25mg/L,疊氮鈉5g/L,水平4含血清淀 粉樣蛋白A抗原50mg/L,疊氮鈉5g/L。5. 根據權利要求1所述的血清淀粉樣蛋白A(SAA)測定試劑盒,其特征在于,所述質控品 為:血清淀粉樣蛋白A抗原10mg/L,疊氮鈉5g/L。
【文檔編號】G01N33/92GK106053862SQ201610321018
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月16日
【發(fā)明人】張偉林, 黃龍梅, 王鑫
【申請人】河北艾馳生物科技有限公司