專利名稱：血清淀粉狀蛋白a基因在診斷和治療青光眼和鑒定抗青光眼活性劑中的用途的制作方法
背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及診斷和治療青光眼的領(lǐng)域。更特別地，本發(fā)明提供了用于診斷和治療青光眼的和鑒定潛在用于治療青光眼的活性劑的方法和組合物。
2.相關(guān)文獻(xiàn)的描述有許多通過(guò)視神經(jīng)乳頭損傷、眼組織變性和/或眼內(nèi)壓升高引起或惡化的眼的疾病。例如，“青光眼”是一組虛弱性眼病，是美國(guó)和其它發(fā)達(dá)國(guó)家中不可逆失明的主要原因。原發(fā)性開(kāi)角型青光眼(“POAG”)是青光眼的最常見(jiàn)形式。該病的特征為小梁網(wǎng)變性，導(dǎo)致房水離開(kāi)眼的正常能力受到阻礙而不閉合虹膜和角膜之間的間隙(例如“角”)(Vaughan，D.等人，(1992))。在這種疾病中此種阻礙的特征為眼內(nèi)壓(“IOP”)升高，如果不進(jìn)行適當(dāng)?shù)暮图皶r(shí)的治療，就會(huì)導(dǎo)致進(jìn)行性視力喪失和失明。該疾病估計(jì)影響40歲以上所有成年人的0.4％到3.3％(Leske，M.C.等人，(1986)；Bengtsson，B.(1989)；Strong，N.P.(1992))。此外，該病的患病率隨年齡升高，75歲或75歲以上的人患病率在6％以上(Strong，N.P.，(1992))。
青光眼影響眼中的三種單獨(dú)組織。與POAG相關(guān)的IOP升高是由于小梁網(wǎng)(TM)的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)的變化，所述小梁網(wǎng)是位于角膜和虹膜之間的角的組織。大部分營(yíng)養(yǎng)性房水通過(guò)TM離開(kāi)眼前段。青光眼的TM細(xì)胞的進(jìn)行性喪失和TM細(xì)胞中細(xì)胞外碎片的積累導(dǎo)致房水流出的阻力增加，因此升高IOP。升高的IOP，以及其它因素諸如局部缺血，引起視神經(jīng)乳頭(ONH)的變性改變，導(dǎo)致ONH的進(jìn)行性“杯狀(cupping)”和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和軸突的喪失。造成TM、ONH和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的青光眼損傷的詳細(xì)分子機(jī)制是未知的。
二十年前，對(duì)眼高壓、局部缺血和視神經(jīng)乳頭的機(jī)械扭曲的相互作用作為引起青光眼中視力喪失的主要因素進(jìn)行了激烈辯論。自此以后，其它因素，包括興奮性神經(jīng)毒性、氧化一氮、重要神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的缺乏、異常的神經(jīng)膠質(zhì)/神經(jīng)元相互作用和遺傳牽涉在變性性疾病的過(guò)程中。由于分子遺傳學(xué)可以最終定義細(xì)胞死亡的機(jī)制和提供多種形式青光眼的區(qū)別，所以對(duì)分子遺傳學(xué)的考慮值得討論。過(guò)去10年中，已經(jīng)對(duì)15種以上的青光眼基因進(jìn)行了作圖并鑒定了7種青光眼基因。這包括原發(fā)性開(kāi)角型青光眼的6種作圖的基因(GLC1A-GLC1F)和兩種鑒定的基因(MYOC和OPTN)、先天性青光眼的兩種作圖的基因(GLC3A-GLC3B)和一種鑒定的基因(CYP1B1)、色素分散性/色素性青光眼的兩種作圖的基因和青光眼的發(fā)育或綜合征形式的許多基因(FOXC1、PITX2、LMX1B、PAX6)。
因此，每種形式的青光眼可以具有獨(dú)特的病理學(xué)，因此可能需要疾病處理的不同治療方法。例如，影響降解視神經(jīng)乳頭的細(xì)胞外基質(zhì)的酶的表達(dá)的藥物不可能防止興奮性神經(jīng)毒性引起的RGC死亡。在青光眼中，通過(guò)稱為編程性細(xì)胞死亡(編程性細(xì)胞死亡)的過(guò)程發(fā)生RGC死亡。推測(cè)可以引起死亡的不同類型損傷可以通過(guò)匯聚幾種共同途徑發(fā)生編程性細(xì)胞死亡。靶向共同途徑的下游區(qū)是可以擴(kuò)大藥物的實(shí)用性和增加藥物在處理不同形式疾病中的效用的可能性的策略。然而，影響多種代謝途徑的藥物更可能產(chǎn)生不希望的副作用。隨著用于鑒定青光眼的特定形式的基于基因的診斷試劑盒的出現(xiàn)，可以檢測(cè)選擇性神經(jīng)保護(hù)活性劑以期降低有關(guān)測(cè)定的反應(yīng)的變化程度。
當(dāng)前青光眼的診斷基于疾病的特定癥狀(特征性的視神經(jīng)乳頭變化和視力喪失)。然而，半數(shù)以上的青光眼患者不知道他們患有此種失明疾病，到診斷他們患此種疾病時(shí)，他們已經(jīng)不可逆地喪失了他們的大約30-50％的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。因此，需要早期診斷青光眼的改進(jìn)方法。
當(dāng)前青光眼的治療針對(duì)降低IOP，所述IOP是青光眼發(fā)生和惡化的主要危險(xiǎn)因素。然而，當(dāng)前的IOP降低療法沒(méi)有一種實(shí)際上干擾負(fù)責(zé)升高的IOP的疾病過(guò)程并且對(duì)前段的進(jìn)行性損傷繼續(xù)進(jìn)行。這就是為什么多數(shù)患者“抵抗”常規(guī)青光眼治療的一個(gè)可能的原因。因此，需要改變(通過(guò)抑制或甚至逆轉(zhuǎn))該疾病過(guò)程的治療方法。
發(fā)明概述本發(fā)明通過(guò)提供診斷青光眼的方法和治療青光眼的組合物，克服了現(xiàn)有技術(shù)的這些和其它缺點(diǎn)。一方面，本發(fā)明提供了通過(guò)向需要治療的患者施用治療有效量的組合物治療青光眼的方法，所述組合物包含與編碼血清淀粉狀蛋白A蛋白(SAA)的基因，或與該基因的啟動(dòng)子序列相互作用的活性劑。該活性劑與編碼SAA的基因，或與它的啟動(dòng)子序列之間的相互作用調(diào)節(jié)SAA的表達(dá)，使患者的青光眼狀況得到治療。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，活性劑將為蛋白質(zhì)、肽、肽模擬物(peptidomimetic)、小分子或核酸。
另一方面，本發(fā)明提供了通過(guò)向需要治療的患者施用治療有效量的組合物治療青光眼的方法，所述組合物包含抑制血清淀粉狀蛋白A蛋白(SAA)與它的受體相互作用的活性劑。優(yōu)選地，該活性劑將為過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)激動(dòng)劑、速激肽和它們的非肽類似物或α-硫辛酸。最優(yōu)選地，活性劑應(yīng)為非諾貝特、Wy-14643、(4-氯-6-(2，3-二甲代苯氨基)-2-嘧啶基硫羥)-乙酸)、環(huán)丙貝特、2-溴代十六烷酸、必降脂和環(huán)格列酮(ciglitizone)、bafilomycin、concanamycin或pseudolaric acid B。
本發(fā)明還提供了用于治療青光眼的藥物組合物，所述藥物組合物包含治療有效量的血清淀粉狀蛋白A蛋白(SAA)拮抗劑和藥物載體。組合物中含有的拮抗劑可以是以上鑒定的任意一種化合物。
在再一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過(guò)以下步驟診斷青光眼的方法a)自患者獲得生物學(xué)樣品；和b)分析所述樣品中編碼血清淀粉狀蛋白A蛋白(SAA)的基因或它的啟動(dòng)子區(qū)或它的基因產(chǎn)物的異常水平、異常生物活性或突變，其中編碼SAA的所述基因包含SEQ ID NO1或SEQ ID NO3中給出的序列，其中它的啟動(dòng)子區(qū)包含SEQ ID NO12或SEQ ID NO13中給出的序列，并且其中SAA包含SEQ ID NO2或SEQ ID NO4中給出的序列；其中SAA基因或基因產(chǎn)物的異常的高水平、異常的高生物活性的突變指出診斷為青光眼。
在優(yōu)選的方面，生物學(xué)樣品為眼組織、淚液、房水、腦脊液、鼻或頰拭子或血清。最優(yōu)選地，生物學(xué)樣品包含小梁網(wǎng)細(xì)胞。
備選地，本發(fā)明提供了通過(guò)以下步驟診斷患者中青光眼的方法a)從患者收集細(xì)胞；b)從所述細(xì)胞分離核酸；c)將樣品與一種或多種引物接觸，所述引物在一定條件下特異雜交SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO12或SEQ ID NO13的至少一種等位基因的5’和3’從而發(fā)生該等位基因的雜交和擴(kuò)增；和d)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物；其中樣品中SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO12或SEQ ID NO13的異常水平或突變指出診斷為青光眼。
本發(fā)明也提供了通過(guò)以下步驟鑒定潛在用于治療青光眼的活性劑的方法a)獲得表達(dá)SAA(SEQ ID NO1或SEQ ID NO2)的細(xì)胞或含有SAA啟動(dòng)子/報(bào)道基因從而該報(bào)道基因得到表達(dá)的細(xì)胞；b)混合候選物質(zhì)與細(xì)胞；和c)確定細(xì)胞中SAA蛋白質(zhì)(SEQ ID NO2或SEQ ID NO4)的水平或基因表達(dá)的水平；其中在存在所述候選物質(zhì)時(shí)SAA蛋白質(zhì)的產(chǎn)生或基因表達(dá)的增加或減少表明所述候選物質(zhì)是潛在用于治療青光眼的活性劑。
另一方面，本發(fā)明提供了通過(guò)以下步驟鑒定潛在用于治療青光眼的活性劑的方法a)形成包含
(i)SAA蛋白質(zhì)或表達(dá)SAA或通過(guò)SAA啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的報(bào)道基因的細(xì)胞；(ii)SAA蛋白質(zhì)結(jié)合配偶體；和(iii)受試化合物的反應(yīng)混合物；和b)在存在受試化合物和不存在受試化合物時(shí)，檢測(cè)SAA蛋白質(zhì)與結(jié)合配偶體的相互作用或報(bào)道基因產(chǎn)物的水平；其中相對(duì)于不存在受試化合物時(shí)的相互作用，存在受試化合物時(shí)SAA蛋白質(zhì)與它的結(jié)合配偶體的相互作用的減少或增加表明所述受試化合物是潛在用于治療青光眼的活性劑。
另一方面，本發(fā)明提供了通過(guò)以下步驟鑒定潛在用于治療青光眼的活性劑的方法a)形成反應(yīng)混合物，其包含(i)包含SAA重組蛋白(SEQ ID NO2或SEQ ID NO4)的細(xì)胞或包含表達(dá)載體的細(xì)胞，所述表達(dá)載體包含SEQ ID NO1或SEQ IDNO3；和(ii)受試化合物；b)檢測(cè)存在受試化合物和不存在受試化合物時(shí)對(duì)下游信號(hào)傳遞(IL-8)的影響；其中相對(duì)于不存在受試化合物時(shí)的相互作用，存在受試化合物時(shí)下游信號(hào)傳遞減少或增加指出所述受試化合物是潛在用于治療青光眼的活性劑。
在優(yōu)選的方面，含有SAA蛋白質(zhì)或表達(dá)載體的細(xì)胞將是HL-60細(xì)胞。
附圖簡(jiǎn)述以下附圖形成本說(shuō)明書的部分并且包括在本說(shuō)明書中用來(lái)闡明本發(fā)明的某些方面。通過(guò)與文中給出的特定實(shí)施方案的詳述相結(jié)合參考這些附圖可以更好地理解本發(fā)明。


圖1.12名青光眼與11名正常的TM組織中SAA表達(dá)的QPCR分析。NTM和GTM分別表示正常組和青光眼組中基因的平均表達(dá)水平。
圖2A.TM細(xì)胞系中SAA表達(dá)的QPCR分析。NTM和GTM分別表示正常組和青光眼組中基因的平均表達(dá)水平。
圖2B.視神經(jīng)乳頭組織中SAA表達(dá)的QPCR分析。NTM和GTM分別表示正常組和青光眼組中基因的平均表達(dá)水平。
圖3.來(lái)自正常和青光眼供者(n＝6)的TM組織中的SAA蛋白。與正常組織相比，在青光眼TM組織中觀察到SAA的顯著升高(3倍)(p＝0.031)。條線表示平均數(shù)+/-s.e.m。
圖4.來(lái)自正常和青光眼個(gè)體的人房水中通過(guò)ELISA確定的SAA蛋白。值表示為平均SAA(ng)/ml房水，+/-s.e.m.(p＝0.005)。
圖5.HL-60細(xì)胞響應(yīng)rhSAA的升高的濃度進(jìn)行的IL-8分泌。
優(yōu)選實(shí)施方案詳述青光眼是共有某些臨床特征的視神經(jīng)病的異質(zhì)群。青光眼中的視力喪失是由于神經(jīng)視網(wǎng)膜中視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的選擇性死亡，所述選擇性死亡在臨床上診斷為視野中的特征性改變、神經(jīng)纖維層缺陷和ONH的進(jìn)行性杯化(cupping)。發(fā)生青光眼的主要危險(xiǎn)因素之一是存在眼高壓(升高的眼內(nèi)壓，IOP)。IOP似乎也涉及正常眼壓性青光眼的致病原因中，所述正常眼壓性青光眼的患者具有常常認(rèn)為正常的IOP。與青關(guān)眼相關(guān)的升高的IOP是由于小梁網(wǎng)(TM)中房水流出阻力升高，小梁網(wǎng)是位于眼前房虹膜-角膜角中的小特化組織。TM的青關(guān)眼變化包括TM細(xì)胞損失和細(xì)胞外碎片(包括蛋白質(zhì)斑狀材料)的沉積和積累。此外，在青光眼性視神經(jīng)乳頭(ONH)中也發(fā)生變化。在青光眼的眼中，在ONH神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中有形態(tài)和流動(dòng)性改變。對(duì)IOP升高和/或暫時(shí)的局部缺血損傷的反應(yīng)是ONH細(xì)胞外基質(zhì)的組成的改變和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突形態(tài)的改變。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在青光眼TM組織和細(xì)胞中血清淀粉狀蛋白A(SAA)mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)顯著上調(diào)。本發(fā)明人通過(guò)實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(QPCR)用Affymetrix基因芯片證實(shí)了所看到的差別mRNA表達(dá)并通過(guò)SAA ELISA證實(shí)了升高的SAA蛋白質(zhì)水平。這是第一次表明SAA在TM中表達(dá)。
人SAA包含許多小的、差別表達(dá)的載脂蛋白，其由位于11號(hào)染色體短臂上的基因編碼。有四種SAA同種型。SEQ ID NO1編碼的SAA1(SEQID NO2)和SEQ ID NO3編碼的SAA2(SEQ ID NO4)稱為急性期反應(yīng)物，如C-反應(yīng)蛋白，即它們通過(guò)促炎細(xì)胞因子顯著上調(diào)。也提供了SAA1和SAA2基因的5’UTR啟動(dòng)子區(qū)(分別為SEQ ID NO12和SEQ ID NO13)。SAA3(SEQ ID NO5)是假基因，SAA4(SEQ ID NO6)是編碼組成型SAA4(SEQ ID NO7)的低水平組成性表達(dá)的基因。SAA2具有兩種同種型SEQ ID NO8編碼的SAA2α(SEQ ID NO9)和SEQ ID NO10編碼的SAA2β(SEQ BD NO11)，這兩種同種型僅僅有一個(gè)氨基酸不同。SAA1和SAA2蛋白在氨基酸水平(分別為SEQ ID NO2和SEQ ID NO4)有93.5％的同一性，這些基因在核苷酸水平(分別為SEQ ID NO1和SEQ ID NO3)有96.7％的同一性。
SAA為急性期反應(yīng)物，作為身體對(duì)多種損傷，包括創(chuàng)傷、感染、炎癥和瘤形成的反應(yīng)的部分，所述SAA在血液中的水平升高大約1000倍。作為急性期反應(yīng)物，認(rèn)為肝臟是主要表達(dá)部位。然而，最初描述了小鼠組織中肝外SAA表達(dá)，后來(lái)描述了人粥樣硬化病變的細(xì)胞中SAA的表達(dá)(O′Hara等人，2000)。隨后，發(fā)現(xiàn)在許多組織學(xué)正常人組織中SAA mRNA廣泛表達(dá)。在多種組織包括乳腺、胃、小腸和大腸、前列腺、肺、胰腺、腎、扁桃體、甲狀腺、垂體、胎盤、皮膚表皮和腦神經(jīng)元中注意到SAA mRNA的局部表達(dá)。在淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中也觀察到SAA mRNA的表達(dá)。在組織學(xué)正常的人肝外組織中也報(bào)道了與SAA mRNA表達(dá)共定位的SAA蛋白表達(dá)(Liang等人，1997；Urieli-Shoval等人，1998)。
SAA同種型是載脂蛋白，其成為哺乳動(dòng)物血漿中高密度脂蛋白(HDL)主要組分并且轉(zhuǎn)移來(lái)自HDL顆粒的A-I(ApoA-I)和磷脂(Miida等人，1999)。SAA結(jié)合膽固醇并且可以作為瞬時(shí)膽固醇結(jié)合蛋白。此外，SAA1或SAA2的過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致在淀粉狀蛋白沉積物中形成線性原纖維，所述線性原纖維可以導(dǎo)致發(fā)病(Uhlar和Whitehead 1999；Liang等人，1997)。SAA在感染、炎癥和組織修復(fù)刺激中起重要作用。炎癥、感染、壞死后，SAA濃度可以升高達(dá)1000倍，恢復(fù)后SAA濃度快速降低。因此，認(rèn)為血清SAA濃度是監(jiān)測(cè)炎性疾病活性的有用標(biāo)志。SAA的肝生物合成受到促炎細(xì)胞因子上調(diào)，導(dǎo)致急性期反應(yīng)。SAA濃度緩慢升高是繼發(fā)性淀粉狀蛋白病發(fā)病的必要條件，所述繼發(fā)性淀粉狀蛋白病是進(jìn)行性的并且有時(shí)為致死性疾病，其特征為主要器官中主要由蛋白水解切割的SAA組成的不溶性斑點(diǎn)的沉積。此種同樣的過(guò)程也可以導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化。需要正和負(fù)SAA控制機(jī)制來(lái)維持穩(wěn)態(tài)。這些機(jī)制允許快速誘導(dǎo)SAA表達(dá)以完成宿主保護(hù)功能，但他們也必須保證SAA的表達(dá)快速返回到基線水平以防止淀粉狀蛋白病。這些機(jī)制包括啟動(dòng)子活性的調(diào)節(jié)，例如涉及誘導(dǎo)物核因子kB(NF-kB)和它的抑制劑IkB，白細(xì)胞介素-6核因子(NF-IL6)家族的轉(zhuǎn)錄因子的上調(diào)和轉(zhuǎn)錄阻抑物，如yin和yang 1(YY1)。涉及mRNA穩(wěn)定性和翻譯效率改變的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)允許實(shí)現(xiàn)SAA蛋白合成的進(jìn)一步上調(diào)和下調(diào)控制。在AP反應(yīng)的晚期階段，SAA的表達(dá)通過(guò)細(xì)胞因子拮抗劑諸如白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑(IL-IRa)和可溶性細(xì)胞因子受體的增加的產(chǎn)生有效地下調(diào)，導(dǎo)致通過(guò)促炎細(xì)胞因子驅(qū)動(dòng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)降低(Jensen和Whitehead 1998)。
有一些報(bào)導(dǎo)提出原發(fā)性淀粉狀蛋白病可能與青光眼有關(guān)。例如，發(fā)現(xiàn)在原發(fā)性系統(tǒng)性性淀粉狀蛋白病患者中淀粉狀蛋白沉積在多種眼組織，包括玻璃體、視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜、虹膜、晶狀體和TM中(Schwartz等人，1982)。Ermilov等人(1993)報(bào)導(dǎo)在25至90歲，患有白內(nèi)障、青光眼和/或糖尿病的313名患者的478只眼中，66只眼(14％)含有淀粉狀蛋白-假片狀剝落淀粉狀蛋白(PEA)。Krasnov等人(1996)報(bào)導(dǎo)具有開(kāi)角型青光眼的115名患者中44.4％顯示淀粉狀蛋白的細(xì)胞外沉積。82％的病例的鞏膜中顯示淀粉狀蛋白病并且70％的病例中顯示虹膜中淀粉狀蛋白病。許多臨床疾病，包括阿爾茨海默氏病，顯示與疾病相關(guān)的異常淀粉狀蛋白組織沉積。然而，淀粉狀蛋白是分子異質(zhì)的并且由不同的淀粉狀蛋白基因編碼。關(guān)于哪種淀粉狀蛋白可能與青關(guān)眼相關(guān)，以前的報(bào)導(dǎo)是不清楚的。本發(fā)明人第一次證明在青關(guān)眼TM組織中，SAA基因表達(dá)顯著升高。升高的SAA可能涉及產(chǎn)生升高的IOP和損傷視神經(jīng)，導(dǎo)致青關(guān)眼患者中視力喪失。本發(fā)明提供了用升高的SAA表達(dá)的發(fā)現(xiàn)來(lái)診斷青光眼的方法。本發(fā)明還提供了用于篩選改變SAA表達(dá)或功能的活性劑以鑒定可能的抗青光眼活性劑的方法。另一方面，本發(fā)明提供了用拮抗SAA作用和/或與其它蛋白質(zhì)相互作用的活性劑治療青光眼的方法和組合物。
診斷青光眼基于發(fā)明人發(fā)現(xiàn)某些青光眼受試者的SAA表達(dá)水平升高，本發(fā)明提供了用于診斷青光眼的多種方法。本發(fā)明的某些方法可以檢測(cè)導(dǎo)致SAA蛋白不適當(dāng)?shù)馗咚降暮怂嵝蛄兄械耐蛔??；谌薙AA的已知核酸序列或編碼的氨基酸序列，可以開(kāi)發(fā)這些診斷法(參見(jiàn)Miller 2001)。基于人SAA的基因組序列或調(diào)節(jié)SAA表達(dá)的基因的序列，可以開(kāi)發(fā)其它的方法?；谠趍RNA水平上SAA基因表達(dá)水平的改變，還可以開(kāi)發(fā)其它方法。
在備選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可以檢測(cè)SAA信號(hào)蛋白或編碼SAA信號(hào)蛋白的基因的活性或水平。例如可以開(kāi)發(fā)此類方法來(lái)檢測(cè)不適當(dāng)?shù)牡蚐AA信號(hào)活性，包括例如導(dǎo)致SAA信號(hào)組分的不適當(dāng)功能，包括IL-8的SAA誘導(dǎo)的突變。此外，可以用基于非核酸的技術(shù)檢測(cè)任意這些SAA信號(hào)蛋白的量或比活性的改變。
當(dāng)前技術(shù)人員可以獲得多種方法用于檢測(cè)基因和基因產(chǎn)物的異常水平或活性。這些方法是技術(shù)人員公知的并成為常規(guī)方法。例如，可以獲得許多方法用于檢測(cè)人多態(tài)性基因座上的特定等位基因。檢測(cè)特定多態(tài)性等位基因的優(yōu)選的方法部分取決于多態(tài)性的分子性質(zhì)。多態(tài)性基因座的多種等位基因形式可以通過(guò)DNA的單個(gè)堿基對(duì)而不同。此種單個(gè)核苷酸多態(tài)性(或SNP)是遺傳變異的主要貢獻(xiàn)者，包含所有已知多態(tài)性的大約80％，它們?cè)谌嘶蚪M中的密度估計(jì)為平均每1,000個(gè)堿基對(duì)1個(gè)?？色@得多種方法用于檢測(cè)個(gè)體中特定單核苷酸多態(tài)性等位基因的存在。本領(lǐng)域的進(jìn)展提供了準(zhǔn)確的、容易的和便宜的大規(guī)模SNP基因型分型。例如，參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)4,656,127；法國(guó)專利2,650,840；PCT申請(qǐng)?zhí)朩O91/02087；PCT申請(qǐng)?zhí)朩O92/15712；Komher等人，1989；Sokolov 1990；Syvanen等人，1990；Kuppuswamy等人，1991；Prezant等人，1992；Ugozzoli等人，1992；Nyren等人，1993；Roest等人，1993；和van der Luijt等人，1994)。
可以利用任意細(xì)胞類型或組織以獲得用于在文中描述的診斷法中使用的核酸樣品。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)已知技術(shù)(例如靜脈穿刺術(shù))從體液，例如血液或口腔細(xì)胞獲得DNA樣品。最優(yōu)選地，用于本發(fā)明方法中的樣品獲得自血液或口腔細(xì)胞。備選地，可以對(duì)干燥樣品(例如頭發(fā)或皮膚)進(jìn)行核酸試驗(yàn)。
也可以在從活組織檢查或切除得到的患者組織的組織切片(固定和/或冷凍)上原位直接進(jìn)行診斷步驟，這樣不必進(jìn)行核酸純化。對(duì)于此類原位步驟，核酸試劑可以用作探針和/或引物(參見(jiàn)，例如，Nuovo 1992)。
除了主要集中于檢測(cè)一種核酸序列的方法外，也可以在此類檢測(cè)方案中評(píng)估分布圖。例如，通過(guò)利用差異顯示方法、Northern分析和/或RT-PCR可以產(chǎn)生指紋分布圖。
優(yōu)選的檢測(cè)方法為等位基因特異雜交，其使用探針，所述探針與指示青光眼的SAA信號(hào)組分的至少一個(gè)等位基因的區(qū)域重疊并且具有突變或多態(tài)性區(qū)域周圍大約5、10、20、25或30個(gè)連續(xù)核苷酸。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，能特異雜交涉及青光眼的其他等位基因變體的幾種探針附著到固相支持體例如，“芯片”(可以容納多達(dá)約250,000個(gè)寡核苷酸)。寡核苷酸可以通過(guò)多種方法，包括平版印刷術(shù)結(jié)合到固相支持體上。例如在Cronin等人(1996)中描述了用包含寡核苷酸的這些芯片(也稱為“DNA探針陣列”)進(jìn)行突變檢測(cè)分析。在一個(gè)實(shí)施方案中，芯片包含基因的至少一個(gè)多態(tài)區(qū)域的所有等位基因變體。然后將固相支持體與受試核酸接觸并檢測(cè)與特異探針的雜交。因此，在簡(jiǎn)單的雜交實(shí)驗(yàn)中，可以鑒定一種或多種基因的許多等位基因變體的身份。
這些技術(shù)還可以包括在分析前擴(kuò)增核酸的步驟。擴(kuò)增技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括但不限于克隆、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、特定等位基因的聚合酶鏈反應(yīng)(ASA)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、嵌套式聚合酶鏈反應(yīng)、自動(dòng)維持序列擴(kuò)增(Guatelli等人，1990)、轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增系統(tǒng)(Kwoh等人，1989)和Q-Beta復(fù)制酶(Lizardi等人，1988)。
可以以多種方法測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物，包括大小分析、限制性消化后大小分析、檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物中的特異標(biāo)記的寡核苷酸引物、等位基因特異寡核苷酸(ASO)雜交、等位基因特異5’外切核酸酶檢測(cè)、測(cè)序、雜交、SSCP等等。
基于PCR的檢測(cè)方法可以包括同時(shí)對(duì)許多標(biāo)記的多重?cái)U(kuò)增。例如選擇PCR引物以產(chǎn)生大小不重疊并可以同時(shí)分析的PCR產(chǎn)物是本領(lǐng)域公知的。備選地，可以用差別標(biāo)記并且因此可以區(qū)別檢測(cè)的引物擴(kuò)增不同標(biāo)志。當(dāng)然，基于檢測(cè)方法的雜交允許在一個(gè)樣品中差別檢測(cè)多種PCR產(chǎn)物。其它技術(shù)是本領(lǐng)域已知的以允許多種標(biāo)志的多重分析。
在僅僅闡明性實(shí)施方案中，該方法包括步驟(i)自患者收集細(xì)胞樣品，(ii)自樣品的細(xì)胞中分離核酸(例如，基因組、mRNA或基因組和mRNA)，(iii)在一定條件下將核酸樣品與特異雜交指示青光眼的SAA的至少一種等位基因的5’和3’的一種或多種引物接觸從而發(fā)生等位基因雜交和擴(kuò)增，和(iv)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。如果核酸分子以非常低的數(shù)目存在，那么這些檢測(cè)方案特別用于檢測(cè)此類核酸分子。
在主題測(cè)定法的優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)限制性內(nèi)切酶切割帶型的改變鑒定指示青光眼的SAA的異常水平或活性。例如，分離樣品和對(duì)照DNA，擴(kuò)增(任選)，用一種或多種限制性內(nèi)切酶消化，通過(guò)凝膠電泳確定片段長(zhǎng)度大小。
在再一個(gè)實(shí)施方案中，本領(lǐng)域已知的任意多種測(cè)序反應(yīng)可以用于直接等位基因測(cè)序。代表性測(cè)序反應(yīng)包括基于Maxim和Gilbert(1977)或Sanger(1977)開(kāi)發(fā)的技術(shù)的測(cè)序反應(yīng)。也可以預(yù)計(jì)在進(jìn)行主題測(cè)定時(shí)，可以利用任意多種自動(dòng)測(cè)序方法，包括通過(guò)質(zhì)譜測(cè)定法測(cè)序(參見(jiàn)，例如WO94/16101；Cohen等人，1996；Griffin等人，1993)。本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的是，對(duì)于某些實(shí)施方案，在測(cè)序反應(yīng)中需要確定僅僅一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)核酸堿基的發(fā)生。例如，僅僅檢測(cè)一個(gè)核酸時(shí)，可以進(jìn)行A-track等等。
在另一實(shí)施方案中，對(duì)切割劑(諸如核酸酶、羥胺或四氧化鋨和哌啶)的保護(hù)可以用于檢測(cè)RNA/RNA或RNA/DNA或DNA/DNA異源雙鏈體的錯(cuò)配堿基(Myers等人1985b；Cotton等人1988；Saleeba等人1992)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以標(biāo)記對(duì)照DNA或RNA用于檢測(cè)。
在再一個(gè)實(shí)施方案中，錯(cuò)配切割反應(yīng)利用識(shí)別雙鏈DNA中錯(cuò)配堿基對(duì)的一種或多種蛋白質(zhì)(也稱為“DNA錯(cuò)配修復(fù)”酶)。例如，大腸桿菌(E.coli)的mutY酶切割G/A錯(cuò)配中的A，來(lái)自HeLa細(xì)胞的胸苷DNA糖基化酶切割T和G/T錯(cuò)配(Hsu等人，1994；美國(guó)專利號(hào)5,459,039)。
在其它實(shí)施方案中，電泳遷移率的改變用于鑒定指示青光眼的SAA的異常水平或活性。例如，單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)可以用于檢測(cè)突變體和野生型核酸之間電泳遷移率的差異(Orita等人1989；Cotton 1993；Hayashi1992；Keen等人1991)。
在再一個(gè)實(shí)施方案中，用變性梯度凝膠電泳(DGGE)測(cè)定了含有變性劑梯度的聚丙烯酰胺凝膠中等位基因的移動(dòng)(Myers等人1985a)。在另外的實(shí)施方案中，用溫度梯度代替變性劑梯度以鑒定對(duì)照和樣品DNA的遷移率中的差異(Rosenbaum和Reissner 1987)。
用于檢測(cè)等位基因的其它技術(shù)的實(shí)例包括但不限于，選擇性寡核苷酸雜交、選擇性擴(kuò)增或選擇性引物延伸。例如，可以制備寡核苷酸引物，在所述寡核苷酸引物中將已知突變或核苷酸差異(例如，等位基因變體中)置于中間然后在僅僅發(fā)現(xiàn)精確匹配時(shí)允許雜交的條件下與靶DNA雜交(Saiki等人1986；Saiki等人1989)。寡核苷酸與PCR擴(kuò)增的靶DNA雜交時(shí)，此類等位基因特異的寡核苷酸雜交技術(shù)可以用于每次反應(yīng)檢測(cè)一個(gè)突變或多態(tài)性區(qū)域，或當(dāng)寡核苷酸附著雜交膜并與標(biāo)記的靶DNA雜交時(shí)，所述技術(shù)可以用于檢測(cè)許多不同突變或多態(tài)性區(qū)域。
備選地，依賴于選擇性PCR擴(kuò)增的等位基因特異擴(kuò)增技術(shù)可以與本發(fā)明聯(lián)合使用。用作特異擴(kuò)增引物的寡核苷酸可以在分子的中央攜帶突變或目的多態(tài)性區(qū)域(從而擴(kuò)增取決于差別雜交)(Gibbs等人1989)，或在一個(gè)引物的3’末端攜帶突變或目的多態(tài)性區(qū)域，在該情況中，在適當(dāng)條件下，錯(cuò)配可以防止或降低聚合酶延伸(Prossner 1993)。此外希望在突變區(qū)導(dǎo)入新的限制性位點(diǎn)以產(chǎn)生基于切割的檢測(cè)(Gasparini等人1992)。預(yù)計(jì)在某些實(shí)施方案中使用用于擴(kuò)增的Taq連接酶也可以進(jìn)行擴(kuò)增(Barany 1991)。在此種情況下，只有在5’序列的3’末端存在完全匹配才發(fā)生連接，使得可以通過(guò)尋找擴(kuò)增的存在或不存在來(lái)檢測(cè)在特定位點(diǎn)已知突變的存在。
在另一實(shí)施方案中，如在美國(guó)專利號(hào)4,998,617和在Landegren等人1988中描述地，用寡核苷酸連接測(cè)定法(OLA)進(jìn)行等位變體的鑒定。Nickerson等人描述了組合PCR和OLA性質(zhì)的核酸檢測(cè)測(cè)定法(Nickerson等人1990)。在此方法中，PCR用于實(shí)現(xiàn)靶DNA的指數(shù)擴(kuò)增，然后用OLA檢測(cè)靶DNA。
已經(jīng)基于此種OLA方法開(kāi)發(fā)了幾種技術(shù)，此類技術(shù)可以用于檢測(cè)指示青光眼的SAA的異常水平或活性。例如美國(guó)專利號(hào)5,593,826和Tobe等人(1996)描述了常常使用的此類技術(shù)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在藥學(xué)可接受的組合物中可以配制過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)激動(dòng)劑非諾貝特并且可以通過(guò)調(diào)節(jié)SAA表達(dá)用于治療青光眼。研究顯示非諾貝特和WY 14643治療降低了血漿SAA濃度(Yamazaki等人2002)。認(rèn)為其它PPARα激動(dòng)劑，諸如環(huán)丙貝特、2-溴代十六烷酸、必降脂、環(huán)丙貝特和ciglitizone也可以用于治療青光眼。
本發(fā)明人還假定防止淀粉狀蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的活性劑可以用于保護(hù)TM和前眼球血管膜和眼后的其它的眼組織，特別是視網(wǎng)膜和視神經(jīng)乳頭。
本發(fā)明的化合物可以摻入用于遞送到眼(例如，局部、intracamerally或通過(guò)植入)的多種類型的眼科制劑中。所述化合物優(yōu)選摻入局部眼科制劑中用于遞送到眼。所述化合物可以與眼科可接受的防腐劑、表面活性劑、粘性增強(qiáng)劑、滲透增強(qiáng)劑、緩沖劑、氯化鈉和水組合以形成含水的、無(wú)菌眼科懸浮液或溶液。通過(guò)在生理學(xué)上可接受的等滲水性緩沖劑中溶解化合物可以制備眼科溶液制劑。此外，眼科溶液可以包括眼科可接受的表面活性劑以幫助溶解該化合物。而且，眼科溶液可以含有增加粘性的活性劑，諸如，羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等等以改善結(jié)膜囊中制劑的保持。也可以使用膠凝劑，包括但不限于膠凝糖(gellan)和黃原膠。為了制備無(wú)菌眼膏制劑，將活性成分與防腐劑在適當(dāng)載體，諸如礦物油、液體羊毛脂或白礦脂中組合。根據(jù)相似眼科制劑的公開(kāi)制劑可以在從例如carbopol-974等等的組合制備的親水基質(zhì)中懸浮所述化合物制備無(wú)菌眼科凝膠制劑；可以摻入防腐劑和張度劑。
所述化合物優(yōu)選作為局部眼科懸浮液或溶液配制，pH大約為4至8。對(duì)每個(gè)個(gè)體的特定劑量方案的建立由臨床醫(yī)生決定。在這些制劑中含有的所述化合物的量通常按重量計(jì)為0.01％至5％，但優(yōu)選0.05％至2％和最優(yōu)選按重量為0.1至1.0％。劑型可以是溶液劑、混懸劑、微乳劑。因此，根據(jù)熟練臨床醫(yī)生的決定，對(duì)于局部施用每天1-4次，每次1至2滴將這些劑型遞送到眼表面。
所述化合物也可以與用于治療青光眼的其它活性劑諸如，但不限于β-阻斷劑、前列腺素、碳酸酐酶抑制劑、α2激動(dòng)劑、縮瞳劑和神經(jīng)保護(hù)劑組合使用。
包括以下實(shí)施例用來(lái)闡明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解以下實(shí)施例中公開(kāi)的技術(shù)代表本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的在本發(fā)明的實(shí)踐中運(yùn)行良好的技術(shù)，因此可以考慮組成本發(fā)明實(shí)踐的優(yōu)選方式。然而，根據(jù)本公開(kāi)的專利，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解可以對(duì)公開(kāi)的特定實(shí)施方案進(jìn)行許多修改并且仍獲得相同或相似結(jié)果而不背離本發(fā)明的精神和范圍。
實(shí)施例1.青光眼TM細(xì)胞和組織中SAA1和SAA2的升高的表達(dá)用Affymetric基因芯片(GeneChips)組(HG-U133)對(duì)來(lái)自13名正常供者對(duì)9名青光眼供者的TM組織的RNA庫(kù)確定基因表達(dá)。與正常TM組織相比，鑒定了青光眼中淀粉狀蛋白A2的表達(dá)增加了4倍。為了證實(shí)此結(jié)果，用來(lái)自12名青光眼和11名正常TM組織的單獨(dú)RNA進(jìn)行QPCR。來(lái)自12名青光眼TM組織中的5名(42％)顯示SAA1/2表達(dá)的顯著增加。12名青光眼TM中SAA表達(dá)的平均值是11名正常TM的5.4倍(圖1)。此外，在青光眼TM細(xì)胞或青光眼視神經(jīng)乳頭組織中觀察到SAA差別表達(dá)的相似趨勢(shì)。與正常TM細(xì)胞相比，青光眼TM細(xì)胞中(14名青光眼對(duì)11名正常TM細(xì)胞系，圖2A)平均升高5.4倍，青光眼視神經(jīng)乳頭組織(14名青光眼對(duì)12名正常組織，圖2B)中平均增加118倍。來(lái)自6名正常和6名青光眼供者的TM組織中SAA的ELISA顯示，與正常TM組織相比，在青光眼TM組織中SAA蛋白也顯著增加。青光眼組織中SAA的濃度與正常組織相比有3倍差異(分別為11.3和3.8μg/mg蛋白質(zhì))。這些數(shù)據(jù)在圖3中顯示。
SAA的升高的表達(dá)與青光眼的相關(guān)性在人房水中進(jìn)一步證實(shí)。通過(guò)ELISA測(cè)定來(lái)自16名正常個(gè)體和20名青光眼個(gè)體的房水中的SAA蛋白質(zhì)。發(fā)現(xiàn)SAA在青光眼房水中比正常樣品中的高幾乎3倍(分別為10.0ng/ml對(duì)3.7ng/ml)。此結(jié)果在圖4中顯示。
實(shí)施例2.用于局部應(yīng)用的非諾貝特的制劑1％非諾貝特用于局部應(yīng)用以減少SAA和降低眼中的IOP。
描述濃度 單位目的非諾貝特1％ W/V％ 活性成分(AL18543)，NOC羥丙基甲基纖0.5％W/V％ 粘度改進(jìn)劑(2910)維素 (E4M)，USP磷酸氫二鈉 0.2％W/V％ 緩沖劑(無(wú)水)，usp氯化鈉，usp 0.75％ W/V％ 張度劑EDTA二鈉0.01％ W/V％ 螯合劑(乙二胺四乙酸二鈉)，usp聚山梨醇酯 0.05％ W/V％ 濕潤(rùn)劑80，nf苯扎氯銨，nf0.01％ W/V％ 防腐劑氫氧化鈉，nf q.s.pH W/V％調(diào)節(jié)pH鹽酸，nf q.s.pH W/V％調(diào)節(jié)pH純化水，usp q.s.100％W/V％載體實(shí)施例3.用于篩選和鑒定改變SAA mRNA或SAA蛋白質(zhì)的表達(dá)的化合物的方法可以用于篩選改變SAA表達(dá)和功能的活性劑的一種方法是確定SAA蛋白質(zhì)水平的改變。用于定量確定動(dòng)物或人血清、血漿、緩沖溶液、細(xì)胞培養(yǎng)基和組織或細(xì)胞提取物中的血清淀粉狀蛋白A(SAA)的體外測(cè)定試劑盒可通過(guò)商業(yè)途徑獲得。此測(cè)定法是固相夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)。將對(duì)SAA特異的單克隆抗體包被在微量滴定板的孔上。將包括已知SAA含量的標(biāo)準(zhǔn)樣品或未知SAA含量的樣品加到這些孔中，一起還加入綴合堿性磷酸酶或過(guò)氧化物酶的二級(jí)抗體。構(gòu)建抗體使得一種抗體不干擾另一種抗體的結(jié)合表位。在一步步驟中，將SAA通過(guò)固定化抗體捕獲在板上并用綴合的二級(jí)抗體標(biāo)記。孵育期后，將板清洗以除去所有未結(jié)合的材料并加入底物(PNPP或過(guò)氧化物)。有色產(chǎn)物的強(qiáng)度與未知樣品中存在的SAA濃度是成比例的。
實(shí)施例4.培養(yǎng)細(xì)胞系中SAA的誘導(dǎo)用于篩選改變SAA mRNA或蛋白質(zhì)表達(dá)的化合物人肝癌細(xì)胞系HepG2廣泛用于通過(guò)細(xì)胞因子對(duì)SAA誘導(dǎo)的研究、用于用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和報(bào)道子測(cè)定。在一些人肝癌細(xì)胞系(包括PCL/PRF/5、HepB和HepG2)中可以通過(guò)多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)SAA mRNA和蛋白質(zhì)合成(Uhlar和Whitehead 1999)。人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HASMC)的SAA的合成是通過(guò)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的而不是通過(guò)促炎細(xì)胞因子IL-1、IL-6、和TNF-α誘導(dǎo)的，所述促炎細(xì)胞因子刺激肝癌細(xì)胞產(chǎn)生SAA(Kumon等人2002b；Kumon等人2001；Thorn和Whitehead 2002)。當(dāng)用Chemotaxicell培養(yǎng)腔測(cè)定時(shí)，SAA以依賴劑量的方式刺激HASMC的趨化性移行(Kumon等人2002a)。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞的原代培養(yǎng)物中證明了SAA mRNA表達(dá)和蛋白質(zhì)產(chǎn)生(O’Hara等人2000)。
實(shí)施例5.培養(yǎng)細(xì)胞中SAA的功能分析SAA的細(xì)胞因子樣性質(zhì)包括誘導(dǎo)嗜中性粒細(xì)胞分泌IL-8(Furlaneto和Campa，2002；He等人2003)。鑒定了早幼粒細(xì)胞細(xì)胞系HL-60細(xì)胞，其應(yīng)答SAA而增加IL-8分泌，并且可用于SAA功能的體外測(cè)定。用升高濃度的重組人SAA處理HL-60細(xì)胞4小時(shí)，通過(guò)ELISA測(cè)定培養(yǎng)基中的IL-8。IL-8的分泌以依賴劑量的方式增加(圖5)。HL-60細(xì)胞可以用作功能測(cè)定的替代細(xì)胞系以鑒定改變SAA功能和表達(dá)水平的活性劑。
按照本公開(kāi)，不用過(guò)度實(shí)驗(yàn)就可以進(jìn)行和執(zhí)行文中公開(kāi)的和要求專利保護(hù)的所有組合物和/或方法。盡管本發(fā)明的組合物和方法按照優(yōu)選的實(shí)施方案描述，但是如本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的，可以對(duì)文中描述的組合物和/或方法和方法步驟或步驟的順序進(jìn)行改變而不背離本發(fā)明概念、精神和范圍。更特別地，顯然，化學(xué)和結(jié)構(gòu)相關(guān)的某些活性劑可以替代文中描述的活性劑以實(shí)現(xiàn)相似結(jié)果。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的所有此類代替和修飾都在如所附權(quán)利要求定義的本發(fā)明的精神、范圍和概念內(nèi)。
參考文獻(xiàn)將以下參考文獻(xiàn)特別引用作為參考，它們對(duì)文中給出的參考文獻(xiàn)示例性程序上的或者其他細(xì)節(jié)補(bǔ)充。
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序列表<110>愛(ài)爾康公司<120>血清淀粉狀蛋白A基因在診斷和治療青光眼和鑒定抗青光眼活性劑中的用途<130>2441 WO F<140>未知<141>2003-11-07<160>13<170>PatentIn版本3.1<210>1<211>369<212>DNA<213>人(homo sapiens)<400>1atgaagcttc tcacgggcct ggttttctgc tccttggtcc tgggtgtcag cagccgaagc60
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1.治療青光眼的方法，所述方法包括向需要其的患者施用治療有效量的組合物，該組合物包含與編碼血清淀粉狀蛋白A蛋白(SAA)的基因相互作用的活性劑，其中所述相互作用調(diào)節(jié)SAA的表達(dá)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述活性劑為蛋白質(zhì)、肽、肽模擬物、小分子或核酸。
3.治療青光眼的方法，所述方法包括向需要其的患者施用治療有效量的組合物，所述組合物包含抑制血清淀粉狀蛋白A蛋白(SAA)與它的受體相互作用的活性劑。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述活性劑為過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)激動(dòng)劑、速激肽和它們的非肽類似物或α-硫辛酸。
5.權(quán)利要求4的方法，其中活性劑為非諾貝特、Wy-14643、(4-氯-6-(2，3-二甲代苯氨基)-2-嘧啶基硫羥)-乙酸)、環(huán)丙貝特、2-溴代十六烷酸、必降脂和環(huán)格列酮(ciglitizone)、bafilomycin、concanamycin或pseudolaric acidB。
6.藥物組合物，其包含治療有效量的血清淀粉狀蛋白A蛋白(SAA)拮抗劑和藥物載體。
7.診斷青光眼的方法，所述方法包括a)從患者獲得生物學(xué)樣品；和b)分析所述樣品中編碼血清淀粉狀蛋白A蛋白(SAA)的基因、它的啟動(dòng)子區(qū)或它的基因產(chǎn)物的異常水平、異常生物活性或突變，其中編碼SAA的所述基因包含SEQ ID NO1或SEQ ID NO3中給出的序列，所述啟動(dòng)子區(qū)包含SEQ ID NO12或SEQ ID NO13中給出的序列，并且其中SAA包含SEQ ID NO2或SEQ ID NO4中給出的序列；其中SAA基因或基因產(chǎn)物的異常的高水平或生物活性或突變表明診斷為青光眼。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述生物學(xué)樣品為眼組織、淚液、房水、腦脊液、鼻拭子或頰拭子或血清。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述生物學(xué)樣品包含小梁網(wǎng)細(xì)胞。
10.診斷患者中青光眼的方法，所述方法包括a)從患者收集細(xì)胞；b)從所述細(xì)胞分離核酸；c)將樣品與一種或多種引物接觸，所述引物在一定條件下特異雜交SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO12或SEQ ID NO13的至少一種等位基因的5’和3’從而發(fā)生該等位基因的雜交和擴(kuò)增；和d)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物；其中樣品中SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的異常水平或突變表明診斷為青光眼。
11.鑒定潛在用于治療青光眼的活性劑的方法，所述方法包括步驟a)獲得表達(dá)SAA(SEQ ID NO1或SEQ ID NO2)的細(xì)胞或含有SAA啟動(dòng)子/報(bào)道基因從而該報(bào)道基因得到表達(dá)的細(xì)胞；b)混合候選物質(zhì)與細(xì)胞；和c)確定細(xì)胞中SAA蛋白質(zhì)(SEQ ID NO2或SEQ ID NO4)的水平或基因表達(dá)的水平；其中存在所述候選物質(zhì)時(shí)SAA蛋白質(zhì)產(chǎn)生或基因表達(dá)的增加或減少表明所述候選物質(zhì)是潛在用于治療青光眼的活性劑。
12.鑒定潛在用于治療青光眼的活性劑的方法，所述方法包括步驟a)形成反應(yīng)混合物，其包含(i)包含SAA重組蛋白(SEQ ID NO2或SEQ ID NO4)的細(xì)胞或包含表達(dá)載體的細(xì)胞，所述表達(dá)載體包含SEQ ID NO1或SEQ ID NO3；和(ii)受試化合物；和b)檢測(cè)存在受試化合物和不存在受試化合物時(shí)對(duì)下游信號(hào)傳遞(IL-8)的影響；其中相對(duì)于不存在受試化合物時(shí)的相互作用，存在受試化合物時(shí)下游信號(hào)傳遞減少或增加指出所述受試化合物是潛在用于治療青光眼的活性劑。
13.鑒定潛在用于治療青光眼的活性劑的方法，所述方法包括a)形成反應(yīng)混合物，其包含(i)SAA蛋白質(zhì)或表達(dá)SAA或通過(guò)SAA啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的報(bào)道基因的細(xì)胞；(ii)SAA蛋白質(zhì)結(jié)合配偶體；和(iii)受試化合物；和b)在存在受試化合物和不存在受試化合物時(shí)，檢測(cè)SAA蛋白質(zhì)與結(jié)合配偶體的相互作用或報(bào)道基因產(chǎn)物的水平；其中相對(duì)于不存在受試化合物時(shí)的相互作用，存在受試化合物時(shí)SAA蛋白質(zhì)與它的結(jié)合配偶體的相互作用的減少或增加表明所述受試化合物是潛在用于治療青光眼的活性劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于治療青光眼的組合物和方法，用于診斷青光眼的方法和用于鑒定可以用于治療青光眼的活性劑。更特別地，本發(fā)明描述了調(diào)節(jié)血清淀粉狀蛋白A表達(dá)的活性劑的用途。
文檔編號(hào)A61K31/7042GK1993136SQ200480037061
公開(kāi)日2007年7月4日 申請(qǐng)日期2004年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月17日
發(fā)明者A·F·克拉克, 王萬(wàn)恒, L·麥克納特 申請(qǐng)人:愛(ài)爾康公司