一種檢測汞離子的比色傳感器及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測汞離子的比色傳感器。采用如下步驟制備而成：探針的雜交，信號放大和比色檢測，本發(fā)明制備的傳感器實(shí)現(xiàn)了對目標(biāo)物汞離子的高特異性檢測；利用核酸工具酶，起到了信號放大的作用。
【專利說明】
一種檢測汞離子的比色傳感器及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]
本發(fā)明涉及傳感器技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種檢測汞離子的比色傳感器。
【背景技術(shù)】
[0002]
汞是銀白色閃亮的重質(zhì)液體，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于酸也不溶于堿。汞常溫下即可蒸發(fā)，汞蒸氣和汞的化合物多有劇毒(慢性)。汞是自然生成的元素，見于空氣、水和土壤中。汞是一種劇毒非必需元素，廣泛存在于各類環(huán)境介質(zhì)和食物鏈(尤其是魚類)中，其蹤跡遍布全球各個角落。汞可以在生物體內(nèi)積累，很容易被皮膚以及呼吸道和消化道吸收。水俁病是萊中毒的一種。萊破壞中樞神經(jīng)系統(tǒng)，對口、粘I旲和牙齒有不良影響。長時間暴露在尚萊環(huán)境中可以導(dǎo)致腦損傷和死亡。盡管汞沸點(diǎn)很高，但在室內(nèi)溫度下飽和的汞蒸氣已經(jīng)達(dá)到了中毒劑量的數(shù)倍。因而對食品、藥品及飲用水中金屬汞進(jìn)行檢測是十分必要的。
[0003]檢測汞的傳統(tǒng)方法主要有三種，分別是原子熒光光譜分析法、冷原子吸收光譜法和二硫腙比色法，這些方法有儀器操作復(fù)雜，需要專業(yè)操作人員等缺點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

本發(fā)明針對現(xiàn)有檢測方法中儀器操作復(fù)雜，需要專業(yè)操作人員的缺點(diǎn)，提供了一種檢測汞的比色傳感器。
[0004]本發(fā)明是通過以下步驟得到的:
本發(fā)明中一共用到了 2條probe鏈，其序列分別是:
Probe 1:5’- TCTTGCTTYkGT kS，(SEQ ID NO:1);
Probe2: 5 ’ -AACCCAACCCGCCCTACCCCCTCAGCTTGGGTTATCG TACTATTGCTTGA-?, ’ (SEQ IDN0:2)；
其中Probe I的斜體部分是Hg的識別，下劃線部分標(biāo)注的是5個無汞的不穩(wěn)定堿基。Probe 2中5 ’端為血紅素適配體的互補(bǔ)列，中間下劃線部分為切割位點(diǎn)，黑色斜體標(biāo)注的部分與5’端互補(bǔ)成發(fā)卡，斜體下劃線部分為汞的識別。
[0005]本發(fā)明中用到了兩種酶:phi29 DNA聚合酶和Nb.BbvCI內(nèi)切酶。phi29 DNA聚合酶在引物與模板的作用下，沿著模板鏈從5’端向3’端生長，聚合出與模板鏈堿基完全互補(bǔ)的系列。他.BbvCI內(nèi)切酶可以在特異性位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)對DNA雙鏈的特異性切割，其特異性的切割識別序列是:CCTCAGC，切割位點(diǎn)是最后兩個喊基之間。
[0006]本發(fā)明中汞的檢測是在均相溶液中實(shí)現(xiàn)的，通過循環(huán)的方式來實(shí)現(xiàn)信號的放大，從而實(shí)現(xiàn)汞的高靈敏檢測，并獲得較低的檢測下限。
[0007]均相中發(fā)生的反應(yīng)主要有:HAP (即Probe2)由三部分組成:血紅素aptamer，內(nèi)切酶Nb.BbvCI的識別序列和引物(primer)的互補(bǔ)序列。當(dāng)有萊存在時，由于血紅素aptamer與目標(biāo)物之間的特異性識別與結(jié)合，可以將發(fā)卡打開，使HAP上內(nèi)切酶Nb.BbvCI的識別序列和引物(primer)的互補(bǔ)序列以單鏈的形式暴露在外面。隨后均相中的primer可以通過堿基互補(bǔ)配對與打開的HAP雜交成一定的雙鏈。在phi29DNA聚合酶的作用下，primer以打開的HAP為模板生長成完全互補(bǔ)的雜交雙鏈，并釋放出目標(biāo)物汞離子，游離出來的汞離子可以繼續(xù)打開別的發(fā)卡，然后重復(fù)上述過程。此為第一步循環(huán)放大(目標(biāo)物誘導(dǎo)的循環(huán)放大)。
[0008]第二步放大仍是在均相中產(chǎn)生的，上述循環(huán)放大的結(jié)果是產(chǎn)生大量的血紅素aptamer。在有大量血紅素aptamer的情況下加入血紅素，在血紅素存在的條件下，血紅素綁定住血紅素aptamer，然后將均相反應(yīng)后的產(chǎn)物滴加ABTS及雙氧水。產(chǎn)生明顯的顏色變化。其具體原理如圖1。
[0009]在均相反應(yīng)中，反應(yīng)條件為37°C，反應(yīng)時間是2h。
[0010]所述的生物傳感器的制備方法，包括以下步驟:
(1)對DNA探針進(jìn)行雜交；
(2)對檢測的特異性序列進(jìn)行信號的放大；
(3)對序列進(jìn)行比色檢測；
所述的制備方法，步驟(I)具體操作步驟如下:將2yLProbe I與2yLProbe 2的混合液，在37°C下孵育0.5h。
[0011]所述的制備方法，步驟(2)具體操作步驟為將(I)中孵育好的混合溶液取出，在這混合溶液中加入dNTPs，phi 29DNA聚合酶與Nb.BbvCI內(nèi)切酶，震蕩30s，放入37 °C的恒溫箱中孵育Ih;
所述的制備方法，對酶添加在低溫下進(jìn)行，確保酶的活性。
[0012]該發(fā)明的檢測方式是比色檢測，利用紫外光譜儀進(jìn)行檢測。在檢測之前，將步驟
(2)中產(chǎn)生的大量的血紅素aptamer與血紅素混合，然后在37°C孵育Ih使其產(chǎn)生信號。最后加入ABTS和雙氧水使信號進(jìn)行顯色，用紫外光譜儀來檢測待測目標(biāo)物。
[0013]本發(fā)明基于核酸適配體與目標(biāo)物的特異性識別，具有鏈置換功能的Phi29DNA聚合酶，核酸內(nèi)切酶在特異性位點(diǎn)對核酸鏈的切割作用，鏈置換等溫放大以及底物顯色劑。該傳感器具有檢測速度快，檢測限低，特異性高等優(yōu)點(diǎn)，可以彌補(bǔ)汞現(xiàn)有檢測方法的缺陷與不足，實(shí)現(xiàn)對其快速，準(zhǔn)確的檢測。
[0014]本發(fā)明的有益效果:
1、利用了核酸適配體的特異型識別，利用血紅素的aptamer作為識別物質(zhì)實(shí)現(xiàn)了對目標(biāo)物萊的尚特異性檢測；
2、利用具有鏈置換功能的phi29DNA聚合酶，實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)物的循環(huán)利用，放大了檢測信號，提高了檢測的靈敏度；
3、利用核限制性核酸內(nèi)切酶對特異性序列的識別和切割作用，結(jié)合聚合酶，生成了大量可作為二級目標(biāo)物的血紅素aptamer，實(shí)現(xiàn)了第二步循環(huán)放大，進(jìn)一步提高了檢測的靈敏度；
4、該傳感器的反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)速度快；
5、檢測原理的主要過程均是在均相中實(shí)現(xiàn)的，提高了反應(yīng)速度，降低了操作的復(fù)雜程度，實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)物的快速，簡單，靈敏的檢測；
6、制備方法簡單，性能穩(wěn)定，重復(fù)性好，適用于食品，水中汞的檢測和生物傳感器產(chǎn)業(yè)化的實(shí)際應(yīng)用；7、制作的工藝成本低，適用于產(chǎn)業(yè)化中價廉的要求。
【附圖說明】
[0015]
圖1為本發(fā)明的原理圖；
圖2為汞離子特異性優(yōu)化檢測結(jié)果圖；
圖3為酶特異性檢測結(jié)果圖；
圖4為靈敏度檢測的工作曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明。
[0017]實(shí)施例1
所述的生物傳感器的制備方法，包括以下步驟:
(1)對DNA探針進(jìn)行雜交；；
(2)對檢測的特異性序列進(jìn)行信號的放大；
(3)對序列進(jìn)行比色檢測。
[0018]所述的制備方法，步驟(I)的具體的操作步驟如下:將2yLProbe I與2yLProbe 2的混合液，在37 °C下孵育0.5h。
[0019]所述的制備方法，優(yōu)選將均相反應(yīng)產(chǎn)物修飾到電極表面的操作步驟如下:
將(I )中孵育好的混合溶液取出，在這混合溶液中加入d N T P s，P h i 2 9 D N A聚合酶與Nb.BbvCI內(nèi)切酶，震蕩30s，放入37 °C的恒溫箱中孵育Ih;
所述的制備方法，對酶添加在低溫下進(jìn)行，確保酶的活性。
[0020]在檢測之前，將步驟(2)中產(chǎn)生的大量的血紅素aptamer與血紅素混合，然后在37°C孵育Ih使其產(chǎn)生信號。最后加入ABTS和雙氧水使信號進(jìn)行顯色，用紫外光譜儀來檢測待測目標(biāo)物。
[0021]本發(fā)明基于核酸適配體與目標(biāo)物的特異性識別，具有鏈置換功能的phi29DNA聚合酶，核酸內(nèi)切酶在特異性位點(diǎn)對核酸鏈的切割作用，鏈置換等溫放大以及底物顯色劑。該傳感器具有檢測速度快，檢測限低，特異性高等優(yōu)點(diǎn)，可以彌補(bǔ)汞現(xiàn)有檢測方法的缺陷與不足，實(shí)現(xiàn)對其快速，準(zhǔn)確的檢測。具體原理圖如圖1所示。
[0022]特異性優(yōu)化實(shí)驗(yàn):
鏈循環(huán)的主要步驟如下:
a、在加入目標(biāo)物的離心管中加入2yL的DNTP，2yLPhi29DNA聚合酶，2yLNb.BbvCI內(nèi)切酶；
b、振蕩均勻后，在37°C孵育lh。
[0023]下面介紹一下均相溶液中發(fā)生的反應(yīng)，均相反應(yīng)中的主要步驟:
C、將滅菌水，10 X 的buffer緩沖液、probe2(2yL) , probel(2yL)，phi29 DNA聚合酶(2yL),dNTPs(2 yL),Nb.BBvcI 內(nèi)切酶(2 410和待測目標(biāo)物1^2+及03+，〇(12+，卩62+，〇&2+，012+，Pb2+，Ag+，Zn2Mg2+，加入離心管中，震蕩30s，放入37°C的恒溫箱中孵育Ih。
[0024]d、將水浴好的混合溶液加入phi29 DNA聚合酶與Nb.BBvcI內(nèi)切酶及dNTPs; e、將(d)中的混合溶液繼續(xù)放在37 0C的恒溫箱中孵育Ih。
[0025]d、用ABTS及紫外光譜儀進(jìn)行檢測
加入汞離子的樣品中吸光度的峰值最大，加入其他離子的樣品中吸光度的峰值與空白相差無幾。以此檢測目標(biāo)物具有特異性。
[0026]結(jié)果見圖2。
[0027]酶特異性選擇實(shí)驗(yàn)
a、在離心管中加入2yL的PHI29的buffeKbuffer為購買PHI29DNA聚合酶的配套緩沖液)；
b、將SyL的滅菌水和目標(biāo)物加入離心管中，并振蕩均勻；
c、在加入目標(biāo)物的離心管中加入2yL的DNTP，2yLPhi29DNA聚合酶，2yLNb.BbvCI內(nèi)切酶和IyL血紅素；
d、其它的管中，加入2yL的DNTP，2yLPhi29DNA聚合酶:2yL的DNTP，2yLNb.BbvCI內(nèi)切酶；2yL的DNTP，IyL的血紅素；
全部在室溫下孵育一小時，根據(jù)圖3可以看出，2yLPhi29DNA聚合酶，2yLNb.BbvCI內(nèi)切酶和IyL血紅素在實(shí)驗(yàn)中扮演了重要的作用，缺一不可。證明只有在核酸工具酶的作用下，汞離子才能產(chǎn)生血紅素的適配體，從而能和血紅素發(fā)生反應(yīng)，得以對汞離子進(jìn)行特異性的檢測。
[0028]靈敏度實(shí)驗(yàn)
1)在8個離心管中加入241^的口1'<^61和口1'(^62，及241^:)!1129的131^€61'(131^€61'為購買PHI29DNA聚合酶的配套緩沖液)和8yL的滅菌水，I號到7號分別依次加入10—5M, 10—6M, 10—7M,10—8M，10—9M，10—1QM，10—11M濃度的汞離子溶液2yL，0號加入2yL的滅菌水，在37度水浴箱中反應(yīng)I小時；
2)在O到7號的離心管中加入終濃度為2*10—8M的DNTP，20units的Phi29DNA聚合酶，20units Nb.BbvCI內(nèi)切酶，在37度水浴箱中反應(yīng)一小時:
3)在O到7號的離心管中加入終濃度為10—9H1l的血紅素，37度反應(yīng)一小時；
4)最后加入ABTS為6*10—7mol，雙氧水3%濃度的雙氧水3yL，即可通過紫外光譜儀進(jìn)行檢測。
[0029 ]結(jié)果如圖4所示，通過圖4可知，當(dāng)汞離子的濃度到I O—11M/!時，峰值和空白相差不大，當(dāng)汞離子的濃度到10—5 M/L時，峰值和10—6M/L相差不大，所以汞離子的檢測范圍是在10—5 M/L到 10—nM/L之間。
[0030]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受實(shí)施例的限制，其它任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所做的改變、修飾、組合、替代、簡化均應(yīng)為等效替換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種檢測汞離子的比色傳感器，其特征在于，其制備包括以下步驟: (1)對探針進(jìn)行雜交； (2)信號的放大； (3)比色檢測。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測汞離子的比色傳感器，其特征在于，步驟(I)的具體工藝為:將2yLProbe I與2yLProbe 2的混合液，在37°C下孵育0.5h。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測汞離子的比色傳感器，其特征在于，步驟(2)的具體工藝為:將步驟(I)制備孵育液加入dNTPs，phi29DNA聚合酶與Nb.BbvCI內(nèi)切酶，震蕩30s，放入37°(:的恒溫箱中孵育lh。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測汞離子的比色傳感器，其特征在于，步驟(3)為將(2)中的混合溶液與血紅素一同混合，并繼續(xù)放在37°C的恒溫箱中孵育lh，采用紫外光譜儀進(jìn)行比色檢測。
【文檔編號】G01N21/33GK106093023SQ201610406300
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月12日
【發(fā)明人】王玉, 崔雪君, 黃加棟, 劉素, 冉令芝, 郭玉娜, 邱婷婷
【申請人】濟(jì)南大學(xué)