MiR?30a/HP1γ作為結(jié)直腸癌的診斷標(biāo)志物的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和腫瘤藥學(xué)領(lǐng)域。涉及miR?30a及HP1γ蛋白在結(jié)直腸癌診斷中的用途，以及miR?30a和HP1γ作為標(biāo)志物用于結(jié)直腸癌的檢測方法。本發(fā)明運用Real?timePCR、免疫組化(IHC)技術(shù)和蛋白印跡分析等方法檢測結(jié)直腸癌病人腫瘤組織及其配對的正常組織中的miR?30a和HP1γ的表達(dá)水平。結(jié)果表明miR?30a在結(jié)直腸癌組織中顯著低于其配對的正常組織；而HP1γ在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)明顯高于其配對的正常組織,并且miR?30a能特異性調(diào)節(jié)HP1γ蛋白的表達(dá)。由于HP1γ的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者的腫瘤分化程度和術(shù)后生存率之間均呈顯著負(fù)相關(guān)，本發(fā)明表明miR?30a/HP1γ能同時作為結(jié)直腸癌臨床診斷的潛在標(biāo)志物。
【專利說明】M i R-30a/HP1 γ作為結(jié)直腸癌的診斷標(biāo)志物的應(yīng)用
[0001] 在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對 本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及生物科學(xué)領(lǐng)域，更具體地說，涉及癌癥診斷領(lǐng)域。特別是，本發(fā)明涉及 利用miR-30a(Hsa-miR-30a_5p)和其革巴基因 ΗΡ1 γ (Heterochromatin Protein lHomolog Gamma，Q13185-CBX3_HUMAN)共同作為結(jié)直腸癌診斷的腫瘤標(biāo)志物，即通過檢測miR-30a/ HP1 γ雙表達(dá)水平來區(qū)分癌變細(xì)胞和正常細(xì)胞。
【背景技術(shù)】
[0003] 結(jié)直腸癌是人類常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率一直呈上升趨勢，在全球惡性腫 瘤發(fā)病率中已上升至第三位，其死亡率居惡性腫瘤第二位。近些年來全球每年有一百多萬 人死于結(jié)直腸癌。由于結(jié)直腸癌的發(fā)生與生活習(xí)慣，特別是飲食習(xí)慣密切相關(guān)，因此近年隨 著我國人民生活水平的逐漸提高，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和致死率在我國飛速增長。在我國，早 期發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者診斷率不足10%。目前診斷結(jié)直腸癌的"金標(biāo)準(zhǔn)"是結(jié)腸鏡，目前公認(rèn)， 年齡大于50歲的人均應(yīng)該接受結(jié)腸鏡篩查。美國以及歐洲等權(quán)威部門指，對于具有家族性 高發(fā)病史或由于個人習(xí)慣患病風(fēng)險高的人來說腸鏡篩查尤為重要。但是我國目前還不上具 備在體檢中廣泛進(jìn)行腸鏡檢測的條件，受試者的痛苦也不言而喻，所以廣泛推行結(jié)腸鏡檢 測并不現(xiàn)實。
[0004] 迄今為止，全球的結(jié)直腸癌篩查方案尚不成熟。人們已經(jīng)確定了一些存在于結(jié)直 腸組織、糞便或血清中的生物標(biāo)記物，如癌胚抗原(CEA)等，來用于結(jié)腸癌的早期診斷和預(yù) 測。目前，CEA是臨床上唯一一個推薦用于結(jié)直腸癌患者診斷及預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物，遠(yuǎn) 遠(yuǎn)不能滿足臨床需求，因此亟待尋找更多結(jié)直腸癌相關(guān)腫瘤標(biāo)志物。最近還報道了一些組 織、糞便和血清中的結(jié)直腸癌分子標(biāo)記物，但其效果也遠(yuǎn)低于結(jié)腸鏡。例如用糞便DNA特異 地甲基化位點作為標(biāo)記，當(dāng)特異度達(dá)到90%時，靈敏度只有50%。每年大約報道上千種腫瘤 分子標(biāo)記物，但是最后應(yīng)用于臨床的分子標(biāo)志物廖廖無幾。早期的篩查和診斷已經(jīng)成為結(jié) 直腸癌防治急需解決的重大科學(xué)問題。腫瘤標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和合理應(yīng)用是腫瘤早期發(fā)現(xiàn)、早 期診斷的前提。然而，目前對于有關(guān)結(jié)直腸癌的發(fā)病機制和特性的認(rèn)識仍然不足。因此，開 發(fā)新的結(jié)直腸癌早期診斷和治療策略成為當(dāng)務(wù)之急。
[0005] 迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)可供臨床應(yīng)用的、能有效地早期篩查和診斷結(jié)直腸的檢測試 劑。本發(fā)明以miR-30a/HPl γ作為標(biāo)志物用于結(jié)直腸癌的檢測試劑及方法，將為早期發(fā)現(xiàn)和 診斷結(jié)直腸癌，以及為腫瘤患者提供可靠的輔助治療方案具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供miR-30a/HPl γ的新用途。本發(fā)明提供了miR-30a/HPl γ作為 結(jié)直腸癌輔助診斷標(biāo)志物的用途，以及使用miR-30a/HPl γ為靶標(biāo)篩選抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞 增殖和侵襲的藥物，為結(jié)直腸癌的診斷和治療提供參考依據(jù)。本發(fā)明采用Real-time PCR， Western Blot和免疫組化技術(shù)對結(jié)直腸癌病人的腫瘤標(biāo)本與正常組織中miR-30a/HPl γ的 表達(dá)水平進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)miR-30a的表達(dá)水平在結(jié)直腸癌組織中顯著低于其配對的正常組 織，而ΗΡΙγ在結(jié)直腸癌組織中顯著高于其配對的正常組織并且其蛋白質(zhì)表達(dá)水平直接受 miR-30a調(diào)控，表明miR-30a/HPl γ能夠作為結(jié)直腸癌的一種輔助診斷標(biāo)志物。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案主要包括如下內(nèi)容：
[0008] 一種與癌細(xì)胞或腫瘤輔助診斷相關(guān)的標(biāo)志物，該標(biāo)志物為miR-30a和ΗΡ1 γ中的任 意一種或兩種，所述的ΗΡ1 γ為ΗΡ1 γ基因或/和ΗΡ1 γ蛋白。該標(biāo)志物優(yōu)選為miR-30a和ΗΡ1 γ蛋白的組合。
[0009] miR-30a和ΗΡ1 γ中的任意一種或兩種在作為癌細(xì)胞或腫瘤輔助診斷標(biāo)志物中的 應(yīng)用。優(yōu)選為miR_30a和ΗΡ1 γ蛋白在作為癌細(xì)胞或腫瘤輔助診斷標(biāo)志物中的應(yīng)用。
[0010] 上述的標(biāo)志物在制備癌細(xì)胞或腫瘤輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0011] -種用于檢測miR_30a表達(dá)水平的試劑盒或生物芯片，該試劑盒或生物芯片中包 括用于檢測血液或腫瘤組織中的miR-30a表達(dá)水平的特異性引物。
[0012] 一種用于檢測ΗΡΙγ蛋白表達(dá)水平的試劑盒，該試劑盒中包括用于檢測血液或腫 瘤組織中的ΗΡ1 γ蛋白表達(dá)水平的特異性抗體。
[0013] -種癌細(xì)胞或腫瘤輔助診斷試劑盒或生物芯片，該試劑盒或生物芯片用于檢測血 液或腫瘤組織中的miR-30a和ΗΡ1 γ蛋白mRNA的雙表達(dá)水平。上述的癌細(xì)胞或腫瘤輔助診斷 試劑盒或生物芯片，該試劑盒或生物芯片含有用于檢測miR_30a表達(dá)水平和HP1 γ蛋白mRNA 的特異性引物和用于檢測HP1 γ蛋白表達(dá)水平的特異性抗體。
[0014] 上述的癌細(xì)胞或腫瘤輔助診斷試劑盒或生物芯片，該試劑盒中還包括PCR技術(shù)常 用的試劑和免疫組化技術(shù)常用的試劑。
[0015] -種在癌細(xì)胞或腫瘤中高表達(dá)的ΗΡ1 γ蛋白的活性、作用、及表達(dá)量的抑制物，該 抑制物為ΗΡ1 γ基因及其蛋白產(chǎn)物的抑制物，優(yōu)選的該抑制物為包括抗體、化學(xué)抑制物、和 miRNA抑制物以及類似物中的至少一種。所述的miRNA抑制物為miR-30a以及類似物，優(yōu)選為 miR-30a〇
[0016] miR-30a在制備抑制癌細(xì)胞或腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0017] 所述的癌細(xì)胞包括結(jié)直腸癌細(xì)胞及其他類似的上皮癌細(xì)胞;所述的腫瘤包括腸癌 及其他上皮腫瘤。所述的上皮腫瘤包括肺癌、肝癌、胃癌、卵巢癌、宮頸癌。
[0018] 上述技術(shù)方案中，miR-30a和HP1 γ蛋白表達(dá)水平的檢測分析過程分別包括以下步 驟：
[0019] l)miR-30a表達(dá)水平的檢測分析
[0020] a)收集結(jié)直腸癌病人的新鮮腫瘤組織標(biāo)本，提取總RNA
[0021] b)Real-time PCR檢測miR-30a表達(dá)水平
[0022] c)miR-30a與HP1 γ蛋白表達(dá)相關(guān)性分析
[0023] 2)ΗΡ1 γ蛋白表達(dá)水平的檢測分析
[0024] a)收集結(jié)直腸癌病理標(biāo)本，提取總蛋白
[0025] b)使用特異的HP1 γ抗體進(jìn)行Western blot實驗，測定HP1 γ蛋白的表達(dá)水平
[0026] c)收集癌癥病人的石臘切片
[0027] d)免疫組織化學(xué)染色（IHC)檢測分析HP1 γ蛋白表達(dá)情況。
[0028] 采用本發(fā)明所述的標(biāo)志物確定受檢細(xì)胞是癌細(xì)胞還是正常細(xì)胞的檢測方法，同時 檢測病人血液或腫瘤組織中miR-30a(Hsa-miR-30a_5p)和ΗΡ1 γ蛋白（Heterochromatin Protein lHomolog Gamma，Q 13185-CBX3_HUMAN)的表達(dá)情況。如果病人樣品中ΗΡΙγ 蛋白 水平升高且miR_30a水平低于正常組織對照，則可初步判定此病人患有腫瘤。
[0029] 所述的癌細(xì)胞包括了結(jié)直腸癌細(xì)胞及其他類似的上皮癌細(xì)胞（epithelial cancer cell)。
[0030] 所述的腫瘤組織包括：腸癌及其他上皮腫瘤如肺癌、肝癌、胃癌、卵巢癌、宮頸癌 等。
[0031] 包括利用PCR技術(shù)、微陣列芯片、測序技術(shù)及免疫組化技術(shù)對miR-30a和HP1 γ蛋白 質(zhì)的表達(dá)水平進(jìn)行分析以確定病人樣品中細(xì)胞癌變信息的方法。
[0032]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)一種能抑制本發(fā)明所鑒定出的在結(jié)直腸癌中高表達(dá)的ΗΡ1 γ蛋白 (Heterochromatin Protein lHomolog Gamma，Q13185_CBX3_HUMAN)的活性、作用、及表達(dá) 量的方法，以及由此產(chǎn)生的新的結(jié)直腸癌或其他上皮腫瘤的診斷和治療方案。其中包括HP1 γ基因及其蛋白產(chǎn)物的抑制物，包括:抗體、化學(xué)抑制物、和miRNA抑制物以及類似物。其中， 所述的miRNA抑制物包括本發(fā)明所鑒定出的與結(jié)直腸癌相關(guān)的miR-30a(Hsa-miR-30a-5p) 以及類似物。
[0033]本發(fā)明的實驗結(jié)果用獨立實驗的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示，用雙側(cè)t檢驗來比較差異。 P〈0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)差異，P〈0.01為顯著性差異。所有數(shù)據(jù)采用SPSS V13.0軟件或者具 備類似統(tǒng)計功能的軟件分析。
[0034]本發(fā)明的有益效果：
[0035]本發(fā)明提供了一種快速簡便的結(jié)直腸癌輔助診斷標(biāo)記物(miR-30a/HPl γ )的檢測 方法，可以作為結(jié)直腸癌診斷的輔助指標(biāo)。
【附圖說明】
[0036] 圖1 Western Blot實驗檢測結(jié)直腸癌病人腫瘤組織及配對的正常組織的ΗΡΙγ蛋 白表達(dá)水平
[0037]圖2 ΗΡΙγ在結(jié)直腸癌臨床病理標(biāo)本中表達(dá)分析 [0038]圖3 miR_30a在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)情況及相關(guān)性分析
[0039] 圖4 HP1 γ為miR-30a下游靶基因 [0040]圖5 miR-30a抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖與克隆形成能力 [0041 ] 圖6 miR_30a在體內(nèi)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞生長
【具體實施方式】
[0042]本發(fā)明人經(jīng)過廣泛的研究，發(fā)現(xiàn)miR-30a和HP1 γ在結(jié)直腸癌組織中存在異常表 達(dá)，并且二者呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的關(guān)系，從而提示miR-30a和ΗΡΙγ在結(jié)直腸癌發(fā)生和發(fā)展過程中 起到較為重要的作用。miR-30a/HPl γ可以同時作為結(jié)直腸癌的一種診斷標(biāo)志物，有助于結(jié) 直腸癌的早期診斷、靶向治療和臨床預(yù)后。
[0043]本發(fā)明具體實施例中所涉及的試劑除特別說明外，均為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常 規(guī)試劑。本發(fā)明中所述的室溫為25 ± 5°C。
[0044] [1]ΗΡ1 γ蛋白水平的檢測：
[0045] 采用Western blot技術(shù)檢測ΗΡΙγ蛋白在結(jié)直腸癌組織和相應(yīng)的正常組織中的表 達(dá)情況。圖l(A)Western blot檢測ΗΡ1 γ蛋白在結(jié)直腸癌新鮮組織標(biāo)本中的表達(dá)情況(η = 38)，每一例包括結(jié)直腸癌組織和匹配的正常組織。GAPDH作為內(nèi)參。圖1(B)用Image J軟件 對Western blot圖進(jìn)行灰度分析，并以HP1 γ/GATOH值作為縱坐標(biāo)，比較結(jié)直腸癌(CRC)和 正常組織(NAT)中HP1 γ表達(dá)情況，Western blot實驗結(jié)果表明HP1 γ蛋白在結(jié)直腸癌組織 中顯著高于其配對的正常組織(Ρ〈〇.01)。
[0046]具體實施步驟如下：
[0047] 1)收集病人的腫瘤組織及配對的正常組織，剪成小塊用液氮研磨，加 lmL RAPI蛋 白裂解液裂解細(xì)胞，然后將裂解液移入到1.5mL離心管，冰上裂解30分鐘。
[0048] 2)14000印111，4°(：，10分鐘，收集蛋白上清，-20°(：保存。
[0049] 3)用BSA法測定蛋白質(zhì)濃度。
[0050] 4)取相同質(zhì)量的蛋白量(體積X蛋白質(zhì)濃度），并加入5 X電泳加樣緩沖液。
[0051] 5)10(TC 煮樣 5 分鐘。
[0052] 6)上樣，電泳。90V，大約15-20分鐘，樣品中的溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)分離膠后，電壓調(diào) 至120V，電流過程中保持電壓恒定。當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑迀移至距前沿l-2cm處即停止電泳，約 1-2小時。15%的分離膠和5%的濃縮膠的配方見表1。
[0053]表1 15%的分離膠和5%的濃縮膠：
[0054]
[0055] 7)電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜(24V 35分鐘）
[0056] 8)牛奶封閉。5%牛奶(5g奶粉+100mL PBST)，室溫，搖床上封閉1小時。
[0057] 9)孵育HP1 γ 蛋白一抗（l/1000;Millipore，#05-690)及GAPDH內(nèi)參一抗（1/20000; MBL，#M171-3)，4°C，過夜。
[0058] 10) PBST漂洗，4次，每次10分鐘，室溫?fù)u床。
[0059] 11)孵育與一抗相對應(yīng)種屬的二抗(1/50000; Sigma，#A2304)，室溫?fù)u床2小時。
[0060] 12) PBST漂洗，4次，每次10分鐘，室溫?fù)u床。
[00611 13)加 ECA發(fā)光液反應(yīng)1-2分鐘，顯影，定影，觀察結(jié)果。
[0062] [2]ΗΡ1 γ蛋白免疫組化分析
[0063]圖2(A)免疫組織化學(xué)染色（IHC)檢測ΗΡΙγ蛋白在正常組織、高分化、中分化和低 分化結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示在結(jié)直腸癌組織中ΗΡ1 γ蛋白表達(dá)水平顯著高于 正常組織(11=178，？〈0.001)。圖2(8)即1丫在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)顯著高于正常組織。數(shù) 據(jù)表示為16&11±50，***?〈0.001(11=178) ;圖2(〇冊1丫蛋白在正常(11 = 178)、高分化(11 = 18)、中分化(η=122)和低分化(η = 38)結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況，并且發(fā)現(xiàn)ΗΡΙγ表達(dá)與腫瘤 分化程度呈負(fù)相關(guān)（？〈0.05)。數(shù)據(jù)表示為1^311±50，沖〈0.01，*沖〈0.01 ;圖2(0)1^口1&11-Meier 法分析 ΗΡΙγ 高表達(dá)組（High ΗΡΙγ expression，n = 82)與低表達(dá)組（Low ΗΡΙγ expression，η = 91)臨床預(yù)后之間的關(guān)系(Log Rank，Ρ = 0.001)。結(jié)果顯示，ΗΡ1 γ的表達(dá)水 平與結(jié)直腸癌患者的生存率之間呈負(fù)相關(guān)，在統(tǒng)計學(xué)上有非常顯著的差異(Ρ = 〇.001)。 [0064] 免疫組化主要試劑：
[0065]即用型高效免疫組化試劑盒產(chǎn)品編號為UNIV-IHC-0001，包括試劑Α:內(nèi)源性過氧 化酶阻斷劑(Endogenous peroxidase blocking solution);試劑Β:超級封閉液；試劑C:一 抗放大劑;試劑D:酶標(biāo)二抗聚合物;DAB顯色劑：即用即配。枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液(pH 6.0)、 0.01M磷酸鹽緩沖液(PBS，pH值為7.4)購自武漢博士德生物工程有限公司；蘇木精，樹脂封 片劑，硅化載玻片，蓋玻片;30 %酒精，50 %酒精，70 %和90 %酒精，無水酒精，二甲苯均等。 [0066]具體實施步驟如下：
[0067] 1)180例隨訪5~8年的人類結(jié)直腸癌組織樣本芯片來自于上海國家工程研究中心 生物樣本庫。所有病例手術(shù)時間為2006~2007年間，且術(shù)前均未經(jīng)化學(xué)治療或放射治療， 180例患者中男性104例，女性76例，年齡24~90歲，平均年齡66歲；結(jié)腸癌和直腸癌各90例； 臨床病理分期:結(jié)直腸癌I期18例，Π 期122例，ΙΠ 期38例，未提供病理信息2例，詳細(xì)信息見 附表2。所有的組織標(biāo)本取出后迅速用10%中性甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋備用。 [0068]表2:結(jié)直腸癌標(biāo)本臨床病理參數(shù)統(tǒng)計
[0069]

[0071] 2)石蠟切片脫蠟至水:脫蠟前應(yīng)將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60°C恒溫箱中 烘烤20分鐘。二甲苯I 10分鐘-二甲苯II 5分鐘。酒精梯度：100%，5分鐘-90%，5分鐘- 70%，5分鐘-50%，5分鐘。PBS洗5分鐘，3次。
[0072] 3)抗原修復(fù):將切片置于10mM pH6.0檸檬酸緩沖液(pH 6.0)中，微波爐加熱15分 鐘。
[0073] 4)過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶:3 %H2〇2，室溫10分鐘，PBS洗5分鐘，3次。
[0074] 5)正常血清封閉：擦凈切片背面水分及切片正面組織周圍的水分(保持組織呈濕 潤狀態(tài)），滴加正常山羊或兔或牛血清（1 %BSA，0.05g BSA+5ml PBS)(與第二抗體同源動物 血清），室溫，1小時，PBS洗5分鐘，3次。
[0075] 6)10%正常山羊血清室溫封閉20分鐘后加 HP1 γ蛋白一抗（1:500)，室溫孵育1小 時，PBS洗5分鐘，3次。
[0076] 7)加二抗(與一抗相對應(yīng)），室溫1小時（1:200)，PBS洗5分鐘，3次。
[0077] 8 )DAB顯色，終止后自來水沖洗，蘇木素復(fù)染。
[0078] 9)梯度酒精脫水:50%乙醇1分鐘-70%乙醇1分鐘-90%乙醇1分鐘-100%乙醇 1分鐘。二甲苯透明：二甲苯I和Π 按序各5分鐘。
[0079] 10)中性樹脂封片，顯微鏡下觀察HP1 γ蛋白水平。
[0080] 11)結(jié)果判定:在光學(xué)顯微鏡下，胞漿或胞核出現(xiàn)棕黃顆粒為陽性細(xì)胞。免疫組化 陽性反應(yīng)的分級采用兼顧陽性細(xì)胞染色強度和陽性細(xì)胞所占百分比的判斷標(biāo)準(zhǔn)。具體方法 為每張切片隨機取5個高倍視野，盡量避開邊緣區(qū)。用微微測量網(wǎng)格計數(shù)所有細(xì)胞數(shù)以及陽 性細(xì)胞數(shù)，計算陽性細(xì)胞所占比例的平均值。按染色強度評分:無色為〇分，淡黃色為1分，棕 黃色為2分，棕褐色為3分;按陽性細(xì)胞所占百分比評分：陰性為0分，陽性細(xì)胞<10%為1分， 11 %~50%為2分，51 %~75%為3分，>75%為4分。染色強度與陽性百分比得分的乘積>3為 免疫陽性。并按乘積分?jǐn)?shù)分為4個等級:一 (0，1，2); + (3,4);++(6,8);+++(9，12)。
[0081 ] [3]miR_30a在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)情況及相關(guān)性分析
[0082] 我們利用Real-time PCR技術(shù)在38例結(jié)直腸癌組織和相應(yīng)的正常組織中檢測了 miR-30a表達(dá)情況。數(shù)據(jù)顯示為Mean 土 SD，獨立實驗重復(fù)3次，采用獨立樣本t檢驗方法。結(jié)果 表明miR-30a在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)顯著低于其配對的正常組織（圖3A和B)，*P〈0.05，**P〈 0.01;圖3(C)38對結(jié)直腸癌組織標(biāo)本中miR-30a表達(dá)水平與HP1 γ蛋白表達(dá)水平相關(guān)性分析 (R = -0.5981，#Ρ〈0.01)，miR-30a表達(dá)水平與ΗΡ1 γ蛋白表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)。
[0083]具體實施步驟如下：
[0084] 3.1收集結(jié)直腸癌病人的新鮮腫瘤組織標(biāo)本，提取總RNA
[0085] 38例新鮮結(jié)直腸癌組織標(biāo)本從江蘇省中醫(yī)院（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院）收集，每 例包括腫瘤組織和相應(yīng)的癌旁組織，采集前均通過江蘇省中醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)及患者知 情同意。所有標(biāo)本均經(jīng)病理診斷確診為結(jié)直腸癌，所有患者未接受放化療治療。收集病人的 腫瘤組織及配對的正常組織，液氮保存?zhèn)溆谩?br>[0086] 采用QIAGEN公司的miRN^;asy?Minikit(cat·no·217004)可以提取純化含有 miRNA的總RNA，詳細(xì)步驟如下：
[0087] 1)加 700yLQIAzol Lysis試劑到細(xì)胞樣品中充分裂解，如果是臨床組織樣本需要 先在研缽中邊加液氮邊研磨，待組織樣本磨成粉末后加入QIAzol Lysis繼續(xù)研磨，再將研 磨液吸入到1.5mL去RNA酶EP中，室溫靜置5min;
[0088] 2)加入140yL三氯甲烷(氯仿），旋渦振蕩15s，室溫靜2~3min;
[0089] 3)4°C，12000Xg 離心 15min;
[0090] 4)小心吸取離心后上清至一個新收集管中，加入1.5倍體積的100 %乙醇，吹打混 勻；
[0091] 5)將RNeasy?Mini柱放入一個2mL收集管中，吸取700yL混合液至RNeasy?:Mini柱 中，室溫彡8000 X g離心15s，棄過濾液；
[0092] 6)重復(fù)上面步驟直至混合液全部離心完；
[0093] 7)加入700yL RWT buffer至RNeas:y?Mini柱中，室溫彡8000Xg離心 15s，棄過濾 液；
[0094] 8)加入500yL RPE buffer至RNeasy?Mini柱中，室溫彡8000Xg離心 15s，棄過濾 液；
[0095] 9)加入500yL RPE buffer至R.Ncasy?Mini柱中，室溫^8000Xg離心2min，棄過濾 液；
[0096] 10)將RNeasy?Mini柱放到一個新的1.5mL收集管中，吸取30~50yL RNA-free H2O至RNeasy?Mini柱中央膜上，室溫彡8000 X g離心lmin;
[0097] 如果希望得到更多產(chǎn)量的RNA，可重復(fù)步驟（10)，再吸取30~50yL RNA-free H20 至RNeasyiJMini柱中央膜上，離心得到總RNA樣品。
[0098] 3.2 miRNA逆轉(zhuǎn)錄
[0099]米用GenePharma公司的Haripin-itTM microRNA and U6snRNA Normalization Real-time PCR Quantitation Kit，以l_3yg總RNA為逆轉(zhuǎn)錄模板，使用帶有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的特 異性引物將miRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄所得的cDNA產(chǎn)物用ddH20稀釋至200yL，再作為模板 用于下一步Real-time PCR(miR-30a及U6逆轉(zhuǎn)錄引物及檢測引物均由上海吉瑪制藥技術(shù)有 限公司設(shè)計并合成）。逆轉(zhuǎn)錄體系見表3。
[0100] 表3逆轉(zhuǎn)錄體系：
[0101]
[0102] 標(biāo)準(zhǔn)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序：
[0103] Step l：25〇C,30min
[0104] Step 2：42〇C,30min
[0105] Step 3：85〇C,5min
[0106] 4Γ，保存。
[0107] 3.3 Real-time定量檢測miR_30a表達(dá)水平
[0108] 反應(yīng)體系見表4
[0109] 表4反應(yīng)體系：
[0110]
[0111] 實時定量PCR反應(yīng)程序：
[0112] Step l：95〇C,3min
[0113] Step 2:95Γ，128;62Γ，40s(40循環(huán)）
[0114] [4]ΗΡ1 γ 為miR-30a下游靶基因
[0115] TargetScan(http://www. targetscan. org/),PicTar(http://pictar.mdc- berlin · de/)和miRDB(http: //www .mirbase · org/)是目前使用率最高，并且公認(rèn)的miRNA革巴 基因預(yù)測信息較完善，相對比較準(zhǔn)確的預(yù)測軟件。生物信息學(xué)預(yù)測軟件顯示在HP1 γ的3'-UTR 區(qū)域存在 miR-30 家族(包括 111丨1?-3(^、111丨1?-3013、111丨1?-30(3、111丨1?-30(1和111丨1?-3〇6)的結(jié)合位點 (圖4A)，并且該結(jié)合位點區(qū)域具有特種保守性。此外miR-30家族所有成員具有相同的種子 區(qū)域(Seed sequence)，均結(jié)合在HP1 y3'_UTR區(qū)域上。熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測了miR-30家族是否可以通過結(jié)合在HP1 γ 3'-UTR區(qū)域從而負(fù)調(diào)控HP1 γ的表達(dá)。結(jié)果顯示，miR-30a/b/c/d/e分別與克隆了HP1 γ 3'-UTR的pMIR-REPORT? Luciferase質(zhì)粒和共轉(zhuǎn)染HCT116 細(xì)胞之后，與陰性對照相比，熒光強度均受到不同程度的抑制（圖4B)，但miR-30a的抑制效 果最強(？〈0.01)。然而，將11^1?-30 &結(jié)合位點堿基突變以后，這種抑制效果幾乎消失（圖4〇 (P>0.05)。在Western blot實驗中，miR-30a轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，HP1 γ蛋白水平明顯受到抑制，表 明ΗΡ1 γ是miR-30a直接作用的下游靶基因（圖4D&E)。
[0116]具體實施步驟如下：
[0117] 4.1熒光素酶報告基因載體構(gòu)建
[0118] 4.1.1引物設(shè)計
[0119] 根據(jù)生物信息預(yù)測（表5)，找到HPly3'UTR上與miR-30家族結(jié)合片段的序列。HP1 Y3'UTR片段序列如下：
[0121] 表5 TargetScan軟件預(yù)測miR-30家族與HP1 γ的結(jié)合位點
[0122]
[0123] 根據(jù)上述序列，在Primer 5.0中設(shè)計PCR擴增引物：
[0124] Sense:5 '-TCTTTACCCCAATTCATTACATGGAGGC-3 '
[0125] Antisense:5 '-TTTCTATTTCTACTGTAAAGGCATATCA-3 '
[0126] 分別加上(Spe I和Hind III)酶切位點和保護(hù)堿基：
[0127] Sense:5 '-CGGACTAGTTCTTTACCCCAATTCATTACATGGAGGC-3 '
[0128] Antisense:5 '-CCCAAGCTTTTTCTATTTCTACTGTAAAGGCATATCA-3 '
[0129]引物設(shè)計完成后，經(jīng)過http://blast.ncbi .nlm.nih.gov/在線比對確認(rèn)，由南京 金斯瑞生物公司合成。
[0130] 4.1.2 PCR擴增
[0131] 表6標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系：
[0132]
[0133] 標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)程序：
[0134] Step 1:95 °C，5min
[0135] Step 2:98Γ，1〇8;55Γ 30s;72°C 20s(35個循環(huán)）
[0136] Step 3：72〇Ca〇min
[0137] 4°C，保存。
[0138] 4.1.3瓊脂糖凝膠電泳
[0139 ] 1)洗凈瓊脂糖凝膠電泳槽、梳子，配制1 X TAE電泳緩沖液；
[0140] 2)將配置好的2%瓊脂糖凝膠插上梳子，室溫下放置30~45min，直至凝膠完全凝 結(jié)；
[0141 ] 3)小心拔出梳子，將凝膠放入電泳槽中；
[0142] 4)向電泳槽中加入1 X TAE電泳緩沖液，剛好沒過凝膠；
[0143] 5)將 10XLoading buffer與PCR產(chǎn)物混合均勻；
[0144] 6)將上述混合液加至上樣孔中；
[0145] 7)關(guān)上電泳槽蓋，接好電源，電壓90V，使DNA從負(fù)極(黑）向正極(紅)方向移動；
[0146] 8)當(dāng)溴酚藍(lán)向前移動至膠的2/3時，關(guān)閉電源，拔出電極插頭，打開電泳槽蓋。
[0147] 4.1.4 DNA產(chǎn)物膠回收
[0148] 1)在紫外燈下切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，計算凝膠重量；
[0149] 2)加3個凝膠體積的Buffer DE-A，75°C加熱，間斷混合，直至凝膠塊完全熔化(約6 ~8min);
[0150] 3)加0.5個Buffer DE-A體積的Buffer DE-B，混合均勾。當(dāng)分離的DNA片段小于 400bp時，加入1個凝膠體積的異丙醇；
[0151] 4)吸取上一步中的混合液，轉(zhuǎn)移到DNA制備管（置于2mL離心管）中，13000rpm， lmin，棄濾液；
[0152] 5)將制備管置回2mL離心管，加500yL Buffer ￥1，13000印111，3〇8，棄濾液；
[0153] 6)將制備管置回2mL離心管，加700yL Buffer 12，13000印111，3〇8，棄濾液，重復(fù)一 次；
[0154] 7)將制備管置于2mL離心管中，13000rpm，離心2min;
[0155] 8)將制備管置于新的1.5mL離心管中，加25~60yL去離子水，室溫靜置5min;
[0156] 9) 13000rpm，lmin，洗脫 DNA，-20 °C 保存?zhèn)溆谩?br>[0157] 4.1.5目的片段和報告基因載體雙酶切
[0158] 表7雙酶切反應(yīng)體系：
[0159]
[0160] 37°C水浴3h，瓊脂糖凝膠電泳對DNA片段和pMIR-REPORTTM Luciferase載體雙酶 切產(chǎn)物進(jìn)行回收純化。
[0161] 4.1.6 DNA片段與載體連接
[0162] 表8 DNA片段與載體連接反應(yīng)體系
[0163]
[0164] DNA片段與載體分子數(shù)目比為1:10~1: 3。16°(：連接過夜。
[0165] 4.1.7細(xì)菌轉(zhuǎn)化
[0166] 1)取出感受態(tài)細(xì)菌DH5a，冰上融化；
[0167] 2)加入5~20yL連接產(chǎn)物至感受態(tài)細(xì)菌DH5a中，輕輕混勻，冰上放置30min;
[0168] 3)42°(：熱激9〇8，然后迅速冰浴21^11;
[0169] 4)加 lmL的LB培養(yǎng)液，37°C搖床中培養(yǎng)45min;
[0170] 5)將菌液均勻涂布于含有抗生素的LB平板上；
[0171] 6)37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12~16h，直至長出肉眼可見菌落時挑取單克隆擴大培養(yǎng)并 鑒定。
[0172] 4.1.8質(zhì)粒提取
[ΟΙ73 ] 1)收集5~15mL過夜培養(yǎng)的菌液，8000rpm，離心lmin，棄上清；
[0174] 2)加入500yL Buffer P1(含RNase A)，渦旋振蕩懸浮細(xì)菌沉淀；
[0175] 3)加入500yL Buffer P2,溫和混勻，室溫放置3~5min;
[0176] 4)加入500yL Buffer E3,立即混勻，室溫放置5min;
[0177] 5)13000rpm，離心 lOmin;
[0178] 6)將上清加入Endo-Remover Column中（已裝入收集管），13000rpm，離心lmin;
[0179] 7)將收集管中的濾液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入450yL異丙醇，上下顛倒混勻；
[0180] 8)柱平衡：向已裝入收集管的Spin Column DL中加入200yL Buffer PS， 13000rpm，離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將Spin Column DL重新放回收集管中；
[0181] 9)將步驟7)中濾液與異丙醇的混合溶液轉(zhuǎn)移到平衡好的吸附柱（已裝入收集管） 中；
[0182 ] 10) 13000rpm，離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中；
[0183] 11)加入750yL Buffer PW，13000rpm，離心lmin，倒掉收集管中的廢液；
[0184] 12)將吸附柱重新放回收集管中，13000rpm，離心2min，倒掉廢液，將吸附柱置于室 溫干燥5min;
[0185] 13)將吸附柱置于一個新的離心管中，加入100~200yL去離子水，室溫放置5min， 13000rpm，離心2min，-20 °C 保存?zhèn)溆谩?br>[0186] 4.1.9目的片段鑒定
[0187] 將上述質(zhì)粒應(yīng)用相應(yīng)的限制性雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢測雙酶切結(jié)果，初步查 看條帶是否與目的片段大小一致，并將樣本送至上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序分 析，進(jìn)一步確定克隆進(jìn)載體的片段是否為目的片段以及是否有堿基突變。
[0188] 4.2 miRNA結(jié)合位點堿基突變
[0189] 我們使用Muta-direct?定點突變試劑盒(北京賽百盛基因技術(shù)有限公司）可以在 質(zhì)粒DNA序列的特定位點誘導(dǎo)堿基突變。
[0190] 4.2.1設(shè)計點突變引物
[0191] 1)設(shè)計上下游引物時確保突變點在引物的中央位置；
[0192] 2)計算引物的Tm值，看是否達(dá)到78°C，如果Tm值低于78°C，則適當(dāng)改變引物的長度 以使其Tm值達(dá)到78°C(GC含量應(yīng)大于40%);
[0193] 3)使用經(jīng)過純化的引物；
[0194] !'111值計算公式：1'111 = 0.41\(%(^6〇-675/1+81.5
[0195] 其中：L:引物堿基數(shù)；％of GC:引物GC含量。
[0196] 4.2.2樣品PCR反應(yīng)體系
[0197] 表9樣品PCR反應(yīng)體系：
[0199] 4.2.3 PCR反應(yīng)條件
[0200] Step 1:95 °C，3s
[0201] Step 2:95°C，lmin; 72°C，lmin per plasmid KB(突變 1-2個喊基 15循環(huán)，突變3個 堿基18個循環(huán)）
[0202] PCR擴增反應(yīng)完成后冰上孵育5min，然后置于室溫。
[0203] 4.2.4突變質(zhì)粒選擇
[0204] PCR反應(yīng)結(jié)束后使用Mutazyme?酶消化甲基化質(zhì)粒從而選擇突變質(zhì)粒DNA。
[0205] 1)準(zhǔn)備PCR反應(yīng)產(chǎn)物；
[0206] 2)加入 lyL(10UAiL)Mutazyme? 酶 37°C 溫育 1 小時；
[0207] 當(dāng)質(zhì)粒DNA用量過多時Mutazyme?酶可能發(fā)生與樣品反應(yīng)不完全的現(xiàn)象。為了保證 突變率請嚴(yán)格遵照實驗步驟進(jìn)行操作。如果突變率低，可以適當(dāng)延長反應(yīng)時間或增加 Mutazyme?酶用量。
[0208] 4.2.5 轉(zhuǎn)化
[0209] 反應(yīng)完畢后在質(zhì)粒DNA上會產(chǎn)生缺口，當(dāng)把這個質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入E.coli中時選擇dam+ 型菌株，例如DH5a。
[0210] 1)將l〇yL樣品加到50yL感受態(tài)細(xì)胞里，然后放置在冰上30min;
[0211] 2)接下來可以參照一般的轉(zhuǎn)化步驟進(jìn)行。
[0212] 4.3熒光素酶報告基因?qū)嶒?br>[0213] 1)轉(zhuǎn)染前一天，將生長良好的細(xì)胞接種于12孔板中，經(jīng)16~18h后細(xì)胞融合度為 60%~70%左右；
[0214] 2)轉(zhuǎn)染前吸干培養(yǎng)基，換成新鮮培養(yǎng)基(不含血清和抗生素）。每孔0.8yg單熒光素 酶報告質(zhì)料，〇. 2yg0-gal內(nèi)參質(zhì)粒，miR-30mimics或者NC對照lyL(母液為20μΜ)。質(zhì)粒(yg) 與轉(zhuǎn)染試劑(yL)之比為1:3。將上述質(zhì)粒用100yL的無血清培養(yǎng)基混勻，室溫放置15min后， 再依次加入到六孔板細(xì)胞中。37 °C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。其中，每個樣品設(shè)三個復(fù)孔；
[0215] 3)轉(zhuǎn)染4~6小時后換成全培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)；
[0216] 4)轉(zhuǎn)染48小時后，吸去培養(yǎng)基，用roS洗兩遍。先用胰酶消化幾分鐘后，用roS重懸 細(xì)胞后移入1.5mL的EP管中，lOOOrpm離心5min收集細(xì)胞，在細(xì)胞沉淀中加入100yL的RIPA細(xì) 胞裂解液，冰上裂解細(xì)胞30min;
[0217] 5)4°C，12000rpm離心 10min;
[0218] 6)取10yL上清用于熒光素酶的活性測量，加入40yL的Luciferase底物，迅速吸打 均勻后，測量熒光值；
[0219] 7)準(zhǔn)備β-半乳糖甘酶的測活緩沖體系：
[0220] 表10 β-半乳糖甘酶的測活緩沖體系
[0221]
[0222] 37°C水浴反應(yīng)37min，此時反應(yīng)液為黃色，取150yL反應(yīng)液通過酶標(biāo)儀讀取420nm的 光吸收值。然后用熒光素酶活性除以β-gal活性即可得到相對熒光素酶活性，進(jìn)而分析 miRNA對靶基因的調(diào)控作用。
[0223] [5]miR_30a抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和克隆形成能力
[0224] 為檢測miR-30a對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力的影響，我們對轉(zhuǎn)染了 miR-30a的HCT116 和SW620細(xì)胞用CCK-8和EdU法檢測miR-30a對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果表明， miR-30a對HCT116和SW620細(xì)胞增殖能力有很明顯的抑制效果，具有顯著性差異(#P〈0.01 和*P〈0.05)(圖5A和B)。說明miR-30a能夠抑制HCT116和SW620細(xì)胞增殖。我們還研究了miR-30a過表達(dá)對結(jié)直腸癌細(xì)胞克隆形成能力影響的實驗，實驗結(jié)果顯示miR-30a過表達(dá)后顯著 降低了 HCT116細(xì)胞的克隆形成能力（圖5C)。
[0225] 具體實施步驟如下：
[0226] 5.1 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖
[0227] 1)按miRNA轉(zhuǎn)染步驟進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染時間24~48h;
[0228] 2)棄培養(yǎng)基，PBS洗兩次，胰酶消化細(xì)胞，加入含10%FBS的培養(yǎng)基終止消化；
[0229] 3)計數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至2X104個/mL，96孔培養(yǎng)板內(nèi)每孔加入100yL細(xì)胞懸 液，即每孔接種2000個細(xì)胞，每組設(shè)3~5個平行孔，2個空白對照孔，共接種4塊96孔培養(yǎng)板， 37 °C培養(yǎng)箱培養(yǎng)；
[0230] 4)每天同一時間取1塊96孔板進(jìn)行測量。每孔培養(yǎng)基中加入10yL CCK-8,混勻，37 °C培養(yǎng)lh;
[0231] 5)用酶標(biāo)儀測定450nm吸光值；
[0232] 6)以不同處理組細(xì)胞的0D450值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，繪制細(xì)胞的生長曲 線。
[0233] 5.2 EdU法檢測細(xì)胞增殖
[0234] 1)按miRNA轉(zhuǎn)染步驟進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染時間24~48h。消化細(xì)胞，計數(shù)，以每孔4 X 103~1 X 105細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)至正常生長階段；
[0235] 2)用細(xì)胞培養(yǎng)基按1000:1的比例稀釋EdU溶液(試劑A)，制備適量50μΜ EdU培養(yǎng) 基；
[0236] 3)每孔加入100yL 50μΜ EdU培養(yǎng)基孵育2h，棄培養(yǎng)基；
[0237] 4)PBS清洗細(xì)胞1~2次，每次5min;
[0238] 5)每孔加入50yL細(xì)胞固定液（即含4%多聚甲醛的PBS)室溫孵育30min，棄固定液；
[0239] 6)每孔加入50yL 2mg/mL甘氨酸，脫色搖床孵育5min后，棄甘氨酸溶液；
[0240] 7)每孔加入100yL PBS，脫色搖床清洗5min，棄PBS;
[0241] 8)(加強)每孔加入100yL滲透劑(0.5%Triton X-100的PBS)脫色搖床孵育lOmin; PBS 清洗1 次，5min;
[0242] 9)每孔加入100yL的IX Apollo染色反應(yīng)液，避光、室溫、脫色搖床孵育30min后，棄 染色反應(yīng)液；
[0243] 10)加入100yL滲透劑（0.5%TritonX-100的PBS)脫色搖床清洗2~3次，每次 10min，棄滲透劑；
[0244] 11)(加強）每孔每次加入lOOyL甲醇清洗1~2次，每次5分鐘；PBS清洗1次，每次 5min；
[0245] 12)用去離子水按100:1的比例稀釋試劑F，制備適量lXHoechst33342反應(yīng)液，避 光保存；
[0246] 13)每孔加入100yL lXHoechst 33342反應(yīng)液，避光、室溫、脫色搖床孵育30min 后，棄染色反應(yīng)液；
[0247] 14)每孔每次加入100yL PBS清洗1~3次；
[0248] 15)在熒光顯微鏡下截取圖像，拍照。
[0249] 5.3平板克隆實驗
[0250] 1)按miRNA轉(zhuǎn)染步驟進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染時間24~48h。胰酶消化細(xì)胞；
[0251] 2)收集細(xì)胞計數(shù)，六孔板每孔接種200個細(xì)胞，37°C培養(yǎng)14天左右；
[0252] 3)棄培養(yǎng)基，PBS洗1次，甲醇固定20min，棄去固定液，待稍干燥后加入0.1 %結(jié)晶 紫染色20min，用水洗去殘余染液，計數(shù)細(xì)胞數(shù)在50個細(xì)胞以上的克隆。
[0253] [6]miR_30a在體內(nèi)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞生長
[0254] 為了進(jìn)一步研究miR_30a對腫瘤增殖的作用。我們在免疫缺陷的裸鼠中進(jìn)行研究， 為了實驗背景的一致性，我們采用同一只小鼠的兩個后肢皮下分別接種miRNA-30a過表達(dá) 和NC對照細(xì)胞的方法。進(jìn)而分析miR-30a能否在體內(nèi)抑制腫瘤的生長。圖6 (A)裸鼠左右側(cè)分 別接種5 X 106個HCT116miR-NC與miR-30a過表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞株，20天后處死裸鼠并拍照，從 外觀來看，在接種20天后，轉(zhuǎn)染miR-30a的腸癌細(xì)胞成瘤體積比NC明顯要小；圖6(B)將移植 瘤取出拍照，mi R-30a過表達(dá)組(η = 8)與NC組(η = 8)相比體積明顯變小。圖6 (C)繪制mi R-30a過表達(dá)組與NC對照組腫瘤生長曲線，每4天測量一次腫瘤尺寸，共測量20天，**P〈0.01; 圖6(D)將miR-30a過表達(dá)組(n = 8)與NC對照組(n = 8)腫瘤取出稱重，比較兩組腫瘤質(zhì)量*** P<0.001；
[0255] 具體實施步驟如下：
[0256] 6.1 miR_30a過表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建
[0257] 1 )miRNA-30a 前體序列：
[0258] 鏈A:
[0259] (保護(hù)堿基)GCC(HpaI 保護(hù)堿基與酶切位點)GTTAACGCGACTGTAAACATCCTCGACTGGAA GCTGTGAAGCCAC AGATGGGCTTTCAGTCGGATGTTTGCAGCTGCTTTTTTG (終止子）
[0260] 鏈B:
[0261] (保護(hù)堿基)^(XhoI 保護(hù)堿基與酶切位點)GAGCTCCAAAAAAGCAGCTGCAAACATCCGAC TGAAAGCCCATCTGTGGCTTCACAGCTTCCAGTCGAGGATGTTTACAGTGC
[0262] 2)將鏈A和鏈B分別稀釋成60μΜ的母液；
[0263] 3)將鏈Α和Β各取lyL，加入48yL退火buffer(100mM K-acetate，20mM HEPES-K0H pH 7 · 4，2mM Mg-acette)，95°C，4min; 70°C，lOmin，室溫緩慢冷卻20min，4Γ放置20min;
[0264] 4)如前步驟將miR_30a前體連接到pLL3.7載體上，轉(zhuǎn)化、挑選陽性克隆，測序鑒定；
[0265] 5)若序列正確則可進(jìn)行下一步的慢病毒制作。三種質(zhì)粒按照以下比例轉(zhuǎn)染293T細(xì) 胞：8.4yg pLL3.7-miR-30a，14yg pCMV-AR8.9,5.6yg pCMV-VSV-G，36~48小時后收集細(xì) 胞上清，用0.22μπι的濾器過濾，即得到用于干擾表達(dá)的慢病毒。用與逆轉(zhuǎn)錄病毒同樣的方法 感染目標(biāo)細(xì)胞，然后以GFP為標(biāo)記進(jìn)行流式篩選，所得細(xì)胞擴大培養(yǎng)，即可得到miR-30a過表 達(dá)穩(wěn)走細(xì)胞系。
[0266] 6.2裸鼠皮下成瘤實驗具體步驟：
[0267] 1)HCT116細(xì)胞用胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，無血清的培養(yǎng)基洗3遍后，細(xì)胞計數(shù)后 調(diào)整為2.5X107個/mL;
[0268] 2)用lmL注射器吸取細(xì)胞液以皮下注射接種，每只裸鼠用200yL細(xì)胞液，即5 X106 個細(xì)胞/只，每組8只；
[0269] 3)隔兩天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤體積，計算體積公式:V= 1/2 X L X W2(V，Volume;L， Length；ff,Width)；
[0270] 4)處死裸鼠分離腫瘤組織后，稱重。
【主權(quán)項】
1. 一種與癌細(xì)胞或腫瘤輔助診斷相關(guān)的標(biāo)志物，其特征在于該標(biāo)志物為miR-30a和HP1 γ中的任意一種或兩種，所述的HP1 γ為HP1 γ基因或/和HP1 γ蛋白；優(yōu)選的該標(biāo)志物為 miR-30a和ΗΡ1 γ蛋白的組合。 2. miR-30a和ΗΡ1 γ中的任意一種或兩種作為癌細(xì)胞或腫瘤輔助診斷標(biāo)志物中的應(yīng)用。3. 權(quán)利要求1所述的標(biāo)志物在制備癌細(xì)胞或腫瘤輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。4. 一種用于檢測miR-30a表達(dá)水平的試劑盒或生物芯片，其特征在于該試劑盒或生物 芯片中包括用于檢測血液或腫瘤組織中的miR_30a表達(dá)水平的特異性引物。5. -種用于檢測ΗΡΙγ蛋白表達(dá)水平的試劑盒，其特征在于該試劑盒中包括用于檢測 血液或腫瘤組織中的ΗΡ1 γ蛋白表達(dá)水平的特異性抗體。6. -種癌細(xì)胞或腫瘤輔助診斷試劑盒或生物芯片，其特征在于該試劑盒或生物芯片用 于檢測血液或腫瘤組織中的miR-30a和ΗΡ1 γ蛋白mRNA的雙表達(dá)水平。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的癌細(xì)胞或腫瘤輔助診斷試劑盒或生物芯片，其特征在于該試 劑盒或生物芯片含有用于檢測miR_30a表達(dá)水平和HP1 γ蛋白mRNA的特異性引物和用于檢 測HP1 γ蛋白表達(dá)水平的特異性抗體;優(yōu)選的，該試劑盒中還包括PCR技術(shù)常用的試劑和免 疫組化技術(shù)常用的試劑。8. -種在癌細(xì)胞或腫瘤中高表達(dá)的ΗΡ1 γ蛋白的活性、作用、及表達(dá)量的抑制物，其特 征在于該抑制物為ΗΡΙγ基因及其蛋白產(chǎn)物的抑制物，優(yōu)選的該抑制物為包括抗體、化學(xué)抑 制物和miRNA抑制物以及類似物中的至少一種;優(yōu)選的，所述的miRNA抑制物為miR-30a以及 類似物，進(jìn)一步優(yōu)選為miR-30a。 9 .miR-30a在制備抑制癌細(xì)胞或腫瘤藥物中的應(yīng)用。10.權(quán)利要求1~3、6~9任意一項中所述的癌細(xì)胞包括結(jié)直腸癌細(xì)胞及其他類似的上 皮癌細(xì)胞;所述的腫瘤包括腸癌及其他上皮腫瘤;優(yōu)選的，所述的上皮腫瘤包括肺癌、肝癌、 胃癌、卵巢癌、宮頸癌。
【文檔編號】G01N33/574GK106093400SQ201610463963
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月23日
【發(fā)明人】趙 權(quán), 劉明, 陳玉根, 鞠君毅, 王亞東, 王瑩, 聶敏, 黃菲菲, 李祝臣
【申請人】成都山權(quán)江生物科技有限公司