專(zhuān)利名稱(chēng)：蛋白類(lèi)蛋白酶體激活劑亞基3(pse3)作為結(jié)直腸癌標(biāo)記物的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及結(jié)直腸癌的診斷。本發(fā)明公開(kāi)了蛋白類(lèi)蛋白酶體激活劑亞基3(＝PSE3)在結(jié)直腸癌診斷中的用途。而且，本發(fā)明特別涉及通過(guò)檢測(cè)個(gè)體來(lái)源的液體樣品中的PSE3而由所述樣品診斷結(jié)直腸癌的方法。PSE3的檢測(cè)例如可用于結(jié)直腸癌的早期檢測(cè)或診斷。
癌癥仍然是一種主要的公共健康挑戰(zhàn)，盡管檢測(cè)和治療有所進(jìn)展。在各種類(lèi)型的癌癥中，結(jié)直腸癌(＝CRC)是在西方世界中最常發(fā)生的癌癥之一。
癌癥被檢測(cè)/診斷得越早，整體存活率就越好。這對(duì)CRC來(lái)說(shuō)尤為正確。晚期腫瘤的預(yù)后很差。超過(guò)1/3的患者在確診后5年內(nèi)死于進(jìn)行性疾病，相當(dāng)于5年內(nèi)的存活率約為40％。目前的治療僅治愈了一小部分患者，并且明顯地對(duì)那些在疾病早期獲得診斷的患者的作用最好。
鑒于CRC是一種公共健康問(wèn)題，必須開(kāi)發(fā)出更有效地篩選和預(yù)防性檢測(cè)結(jié)直腸癌的方法。
目前可用的最早期結(jié)直腸癌檢測(cè)方法包括使用便血檢查或內(nèi)窺鏡方法。但是，在檢查便血前，一般必須存在明顯的腫瘤大小?；谟從局拇蟊銤撗獧z查的敏感性約為26％，這意味著74％的具有惡性腫瘤病灶的患者仍然不能被檢測(cè)出來(lái)(Ahlquist，D.A.，Gastroenterol.Clin.North Am.26(1997)41-55)。目測(cè)癌癥前期和癌癥病灶是最好的早期檢測(cè)方法，但結(jié)腸鏡檢查是侵入性的，成本高、風(fēng)險(xiǎn)大且有并發(fā)癥(Silvis，S.E，et al.，JAMA 235(1976)928-930；Geenen，J.E.，et al.，Am.J.Dig.Dis.20(1975)231-235；Anderson，W.F.，et al，J.Natl.Cancer Institute 94(2002)1126-1133)。
在近些年，已經(jīng)報(bào)道了海量的所謂結(jié)腸特異性基因乃至所謂的結(jié)直腸癌特異性基因。大多數(shù)的相應(yīng)研究論文或?qū)＠暾?qǐng)都是基于通過(guò)分別分析結(jié)腸(癌)組織和不同組織或鄰近正常組織的RNA表達(dá)譜所獲得的數(shù)據(jù)。這樣的方法可概括為差異mRNA展示技術(shù)。
作為可由mRNA展示技術(shù)獲得數(shù)據(jù)的實(shí)例，應(yīng)提及和討論WO01/96390。該申請(qǐng)描述并要求保護(hù)200種以上的分離的多核苷酸以及同樣多的對(duì)應(yīng)的多肽，以及其檢測(cè)CRC的用途。但是，通過(guò)對(duì)應(yīng)蛋白的水平不能監(jiān)測(cè)mRNA水平的差異是常識(shí)。稀有mRNA編碼的蛋白的存在量可能非常大，而高豐度mRNA編碼的蛋白可能仍然難以檢測(cè)到或根本無(wú)法發(fā)現(xiàn)。mRNA水平和蛋白水平之間缺乏關(guān)聯(lián)是源于以下的原因，如mRNA穩(wěn)定性、翻譯效率、蛋白穩(wěn)定性等。
還有一些新方法研究不同組織之間或健康組織和患病組織之間的蛋白譜差異，以鑒別可用于診斷CRC的侯選標(biāo)記分子。Brünagel，G.，et al.，Cancer Research 62(2002)2437-2442鑒別了7種核基質(zhì)蛋白，這些蛋白在CRC組織中的豐度似乎高于鄰近的正常組織。沒(méi)有報(bào)道得自個(gè)體的液體樣品的數(shù)據(jù)。
WO 02/078636報(bào)告了約9種由表面增強(qiáng)激光吸收和離子化(SELDI)發(fā)現(xiàn)的結(jié)直腸癌相關(guān)蛋白質(zhì)點(diǎn)。與得自健康對(duì)照的血清相比，在得自CRC患者的血清中更常觀察到這些蛋白質(zhì)點(diǎn)。但是，不知道這種點(diǎn)中包含的分子的身份(例如其序列)。
盡管CRC領(lǐng)域中列出的侯選蛋白標(biāo)記龐大且不斷增長(zhǎng)，但迄今為止這些分子的臨床/診斷效用還未知。為了在臨床上有效用，作為單個(gè)標(biāo)記物的新診斷標(biāo)記物至少應(yīng)當(dāng)和本領(lǐng)域已知的最好單個(gè)標(biāo)記物一樣好?；蛘?，新標(biāo)記物分別在單獨(dú)使用或和一種或多種其它標(biāo)記物聯(lián)用的情況下，應(yīng)當(dāng)使診斷的敏感性和/或特異性有進(jìn)步。檢查的診斷敏感性和/或特異性最好通過(guò)下文詳述的其受試者操作特征曲線(xiàn)來(lái)評(píng)價(jià)。
目前，在CRC領(lǐng)域僅有基于癌胚抗原(CEA，一種腫瘤相關(guān)糖蛋白)的診斷性血檢可用于幫助診斷。在95％的得自結(jié)直腸癌、胃癌和胰腺癌患者的組織樣品中，以及在大多數(shù)乳癌、肺癌以及頭頸癌患者中，CEA增加(Goldenberg，D.M.，et al.，J.Natl.Cancer Inst.(Bethesda)57(1976)11-22)。CEA水平提高在非惡性患者中也有報(bào)道，而許多結(jié)直腸癌患者血清中的CEA水平正常，尤其是在疾病早期(Carriquiry，L.A.，and Pineyro，A.，Dis.Colon Rectum 42(1999)921-929；Herrera，M.A.，et al.，Ann.Surg.183(1976)5-9；Wanebo，H.J.，et al.，N.Engl.J.Med.299(1978)448-451)。由血清或血漿檢測(cè)的CEA在檢測(cè)重現(xiàn)性方面的效用在報(bào)道上有爭(zhēng)議，迄今還未廣泛應(yīng)用(Martell，R.E.，et al.，Int.J.Biol.Markers 13(1998)145-149；Moertel，C.G.，et al.，JAMA 270(1993)943-947)。
根據(jù)可得到的數(shù)據(jù)，血清CEA測(cè)定過(guò)程所具有的敏感性和特異性均不能使其用作無(wú)癥狀群體的結(jié)直腸癌篩選檢查(Reynoso，G.，et al.，JAMA 220(1972)361-365；Sturgeon，C.，Clinical Chemistry 48(2002)1151-1159)。
全血、血清或血漿是最廣泛使用的臨床途徑樣品源。鑒別出使癌癥檢查可靠或提供早期診斷信息的早期CRC腫瘤標(biāo)記物，可產(chǎn)生一種診斷性實(shí)驗(yàn)，極大地幫助診斷和處理該疾病。因此，存在著急迫的臨床需要來(lái)改進(jìn)CRC的血液診斷。特別重要地是改善CRC的早期診斷，因?yàn)閷?duì)于早期診斷的患者來(lái)說(shuō)，其存活機(jī)會(huì)遠(yuǎn)高于在疾病進(jìn)行期被診斷出來(lái)的患者。
本發(fā)明的任務(wù)是研究是否可以鑒別出可能有助于CRC診斷的新標(biāo)記物。
令人驚奇地是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用蛋白PSE3至少可以部分地克服目前技術(shù)水平已知的問(wèn)題。
因此，本發(fā)明涉及結(jié)直腸癌診斷方法，該方法包括以下步驟a)提供由個(gè)體獲得的液體樣品；b)在適于PSE3特異性結(jié)合物和PSE3形成復(fù)合物的條件下，使所述樣品接觸所述結(jié)合物，和c)將(b)中形成的復(fù)合物的量與結(jié)直腸癌診斷相關(guān)聯(lián)。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是診斷結(jié)直腸癌的方法，該方法包括以下步驟a)在適于PSE3特異性結(jié)合物和PSE3形成復(fù)合物的條件下，使得自個(gè)體的液體樣品接觸所述PSE3特異性結(jié)合物，和b)將(a)中形成的復(fù)合物的量與結(jié)直腸癌診斷相關(guān)聯(lián)。
技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，任何這樣的診斷都可以體外進(jìn)行。其后廢棄患者樣品。患者樣品僅用于本發(fā)明的體外診斷方法，患者樣品材料不轉(zhuǎn)移回患者體內(nèi)。通常，樣品為液體樣品。
26S蛋白酶體是一種具有高度有序結(jié)構(gòu)的多催化蛋白酶復(fù)合體，由兩種復(fù)合體20S核心和19S調(diào)節(jié)體組成。蛋白酶體以高濃度分布于整個(gè)真核細(xì)胞中，以ATP/泛蛋白依賴(lài)性方式切割肽(Coux et al.(1996)，Annu.Rev.Biochem.65，801-847；Bochtler et al.(1999)，Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.28，295-317)。免疫蛋白酶體是一種改良的蛋白酶體，其是加工MHC I類(lèi)肽必須的。在免疫蛋白酶體中，19S調(diào)節(jié)體由11S調(diào)節(jié)體取代(Rock and Goldberg(1999)，Annu.Rev.Immunol.17，739-779)。已經(jīng)鑒別出11S調(diào)節(jié)體的3種亞基(α、β和γ)(Kandil et al.(1997)，Immunogenetics 46，337-344)。PSE3(蛋白酶體激活蛋白亞基3；SWISS-PROTQ12920)是11S調(diào)節(jié)體的γ亞基，6個(gè)γ亞基組合形成同源六聚體環(huán)。
已經(jīng)鑒別出編碼不同同工型的兩種轉(zhuǎn)錄物變體(SEQ ID NO1和SEQ ID NO2)。
最初在1990年分離出PSE3編碼基因，對(duì)應(yīng)的蛋白稱(chēng)為Ki。系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者產(chǎn)生抗多種核抗原的自身抗體，Ki是其中之一。Nikaido等(Nikaido et al.(1990)，Clin.Exp.Immunol.79，209-214)使用牛cDNA作為探針篩選SLE患者cDNA文庫(kù)，分離出對(duì)應(yīng)的cDNA。稍后，發(fā)現(xiàn)重組Ki活化蛋白酶體，該蛋白被確定為PSE3(Realini et al.(1997)，J.Biol.Chem.272，25483-25492；Tanahashi et al.(1997)，Genes Cells2，195-211)。
最近的工作揭示，根據(jù)免疫組織化學(xué)染色和蛋白質(zhì)印跡的評(píng)價(jià)，PSE3在甲狀腺癌中不正常高表達(dá)，尤其是在其生長(zhǎng)促進(jìn)細(xì)胞中不正常高表達(dá)(Okamura et al.(2003)，J.Clin.Endocrin.Metab.88，1374-1383)。
對(duì)技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)地是，本發(fā)明不應(yīng)當(dāng)被解釋為限于SEQID NO1或SEQ ID NO2的全長(zhǎng)PSE3蛋白。PSE3的生理或人工片段、PSE3的次級(jí)修飾物以及PSE3的等位基因變體也包含在本發(fā)明中。人工片段優(yōu)選包括合成或通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生的肽，其至少包含診斷目標(biāo)的一個(gè)表位，該表位由至少6個(gè)連續(xù)氨基酸組成，這6個(gè)連續(xù)氨基酸來(lái)源于在SEQ ID NO1或SEQ ID NO2中公開(kāi)的序列。這樣的片段最好可用于產(chǎn)生抗體，或用作免疫實(shí)驗(yàn)中的標(biāo)準(zhǔn)。人工片段更優(yōu)選包含目標(biāo)的至少兩個(gè)表位，以供建立夾心免疫實(shí)驗(yàn)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，新標(biāo)記物PSE3可用于監(jiān)測(cè)以及篩選目的。
當(dāng)用于患者監(jiān)測(cè)時(shí)，本發(fā)明的診斷方法可能有助于評(píng)價(jià)腫瘤載荷、治療效率和患者隨訪(fǎng)中腫瘤復(fù)發(fā)。PSE3水平增加與腫瘤載荷直接相關(guān)。在短期(幾小時(shí)至14天)化療后，PSE3增加可用作腫瘤細(xì)胞死亡指標(biāo)。在患者隨訪(fǎng)(3個(gè)月至10年)中，PSE3增加可用作腫瘤復(fù)發(fā)指標(biāo)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的診斷方法用于篩選目的。即其通過(guò)檢測(cè)PSE3水平，并將所檢測(cè)的水平與CRC的存在與否相關(guān)聯(lián)，用于評(píng)價(jià)預(yù)先未進(jìn)行CRC診斷的患者。
結(jié)直腸癌最經(jīng)常由腺瘤(息肉)發(fā)展為惡性腫瘤。CRC的不同分期常常按照Dukes的A-D期分期。
癌癥分期是根據(jù)程度、發(fā)展和嚴(yán)重性對(duì)疾病分級(jí)。其將癌癥患者分組，以使預(yù)后和治療選擇普遍化。
目前，TNM系統(tǒng)最廣范地被用于對(duì)癌癥的解剖學(xué)程度進(jìn)行分期。其代表了國(guó)際公認(rèn)的一致的分期系統(tǒng)。有三種基本變量T(原發(fā)腫瘤程度)、N(區(qū)域淋巴結(jié)狀況)和M(有或沒(méi)有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移)。TNM標(biāo)準(zhǔn)公開(kāi)于UICC(International Union Against Cancer)，Sobin，L.H.，Wittekind，Ch.(eds)TNM Classification of Malignant Tumours，fifthedition，1997。
尤其重要地是，CRC的早期診斷轉(zhuǎn)化為非常好的預(yù)后。結(jié)直腸惡性腫瘤由良性腫瘤產(chǎn)生，即由腺瘤產(chǎn)生。因此，最好的預(yù)后是那些在腺瘤階段確診的患者。早在T1S、N0、M0期或T1-3、N0、M0期確診的患者如果治療適當(dāng)?shù)脑?huà)，其在診斷后存活5年的幾率超過(guò)90％，相比之下已出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)確診的患者的5年存活率只有10％。
在本發(fā)明的意義上，CRC的早期診斷是指在惡性前腫瘤狀態(tài)(腺瘤)或在根本未出現(xiàn)轉(zhuǎn)移(無(wú)論是鄰近還是遠(yuǎn)距離，即腺瘤、T1S、N0、M0或T1-4、N0、M0)的腫瘤期確診。T1S代表原位腫瘤。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，PSE3用于診斷早在腺瘤期的CRC。
進(jìn)一步優(yōu)選診斷出CRC時(shí)其尚未完全生長(zhǎng)過(guò)腸壁，因此既沒(méi)有使腹膜臟層穿孔，也沒(méi)有侵入其它器官和結(jié)構(gòu)，即在T1S、N0、M0期或T1-3、N0、M0(＝T1S-3、N0、M0)期確診。
本發(fā)明的診斷方法基于個(gè)體來(lái)源的液體樣品。與本領(lǐng)域已知的方法不同，PSE3是通過(guò)使用特異性結(jié)合物由該液體樣品中特異性檢出。
特異性結(jié)合物為例如PSE3受體、結(jié)合PSE3的凝集素或PSE3抗體。特異性結(jié)合物與其對(duì)應(yīng)靶分子的親和性至少為107l/mol。特異性結(jié)合物與其靶分子的親和性?xún)?yōu)選為108l/mol，或更優(yōu)選為109l/mol。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，術(shù)語(yǔ)特異性用于表示樣品中存在的其它生物分子不明顯結(jié)合PSE3特異性結(jié)合物。結(jié)合靶分子以外的生物分子的水平產(chǎn)生的結(jié)合親和性?xún)?yōu)選僅為靶分子親和性的10％，更優(yōu)選僅為靶分子親和性的5％或更少。最優(yōu)選的特異性結(jié)合物既實(shí)現(xiàn)以上的親和性最低標(biāo)準(zhǔn)，也實(shí)現(xiàn)特異性最低標(biāo)準(zhǔn)。
特異性結(jié)合物優(yōu)選為PSE3反應(yīng)性抗體。術(shù)語(yǔ)抗體指多克隆抗體、單克隆抗體、這些抗體的片段以及含抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的遺傳構(gòu)建物。
任何保持以上特異性結(jié)合物標(biāo)準(zhǔn)的抗體片段都可以使用?？贵w通過(guò)本領(lǐng)域公開(kāi)的方法生產(chǎn)，例如Tijssen(Tijssen，P.，Practice andtheory of enzyme immunoassays 11(1990)全書(shū)，尤其是第43-78頁(yè)；Elsevier，Amsterdam)描述的方法。另外，技術(shù)人員完全了解基于免疫吸收劑的方法可用于抗體的特異性分離。利用這些方法可提高多克隆抗體的質(zhì)量，并由此增強(qiáng)其在免疫實(shí)驗(yàn)中的效能(Tijssen，P.，出處同上，108-115頁(yè))。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容，使用在兔中產(chǎn)生的多克隆抗體。但是，很明顯，也可以使用其它物種例如大鼠或豚鼠的多克隆抗體以及單克隆抗體。因?yàn)閱慰寺】贵w可以需要的任意量生產(chǎn)，并具有穩(wěn)定的特性，所以它們是開(kāi)發(fā)臨床途徑實(shí)驗(yàn)的理想工具。在本發(fā)明方法中，PSE3單克隆抗體的生產(chǎn)和使用是又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案。
現(xiàn)在，技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，PSE3已經(jīng)被確定為有效診斷CRC的標(biāo)記物，使用替代方法可達(dá)到和本發(fā)明成果相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。例如，可使用替代策略生產(chǎn)抗體。這樣的策略其中包括使用合成肽，該肽具有PSE3表位，用于免疫?；蛘撸墒褂糜址Q(chēng)為DNA接種的DNA免疫。
為進(jìn)行檢測(cè)，在適于形成結(jié)合物-PSE3復(fù)合體的條件下，使得自個(gè)體的液體樣品和PSE3特異性結(jié)合物溫育。這樣的條件不必指定，因?yàn)榧夹g(shù)人員不需要?jiǎng)?chuàng)造性勞動(dòng)就可以輕易確定這樣的合適溫育條件。
作為本發(fā)明公開(kāi)方法的最后一步，檢測(cè)復(fù)合體的量，并將其與CRC診斷相關(guān)聯(lián)。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，有眾多方法來(lái)檢測(cè)特異性結(jié)合物-PSE3復(fù)合體的量，其全部細(xì)節(jié)都描述在相關(guān)的教科書(shū)(參閱例如Tijssen P.，出處同上，或Diamandis，et al.，eds.(1996)Immunoassay，Academic Press，Boston)中。
優(yōu)選以?shī)A心型實(shí)驗(yàn)形式檢測(cè)PSE3。在這樣的實(shí)驗(yàn)中，使用第一種特異性結(jié)合物將PSE3捕獲在一側(cè)，在另一側(cè)使用第二種特異性結(jié)合物，其被標(biāo)記得可直接或間接檢測(cè)。
如上所述，已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，可檢測(cè)得自個(gè)體樣品的液體樣品中的PSE3。在CRC診斷中應(yīng)用標(biāo)記物PSE3不需要組織和活組織檢查樣品。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用血清作為液體樣品材料實(shí)施本發(fā)明的方法。
在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，用血漿作為液體樣品材料實(shí)施本發(fā)明的方法。
在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，用全血作為液體樣品材料實(shí)施本發(fā)明的方法。
此外，可以技術(shù)人員已知的各種方法制備糞，同樣獲得液體樣品。這種來(lái)源于糞的樣品液體也代表了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。
對(duì)組織樣品應(yīng)用常規(guī)蛋白酶體方法導(dǎo)致鑒別出選定組織的多種潛在標(biāo)記侯選物，但本發(fā)明的發(fā)明人令人驚奇地能檢測(cè)體液樣品中的蛋白PSE3。甚至更令人驚奇地是，他們能夠證明，在得自個(gè)體的這種液體樣品中存在的PSE3可與結(jié)直腸癌診斷相關(guān)聯(lián)。
具有巨大優(yōu)勢(shì)的PSE3抗體可用于建立方法，例如在原位、活組織檢查中或免疫組織學(xué)方法中檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞。
PSE3抗體優(yōu)選用于定性(PSE3存在與否)或定量(測(cè)定PSE3量)免疫實(shí)驗(yàn)。
檢測(cè)蛋白PSE3水平已被證實(shí)在CRC領(lǐng)域非常有優(yōu)勢(shì)。因此，在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及使用蛋白PSE3作為標(biāo)記分子，用于由得自個(gè)體的液體樣品診斷結(jié)直腸癌。
術(shù)語(yǔ)標(biāo)記分子用于表示根據(jù)個(gè)體體液檢測(cè)，分析物PSE3的水平增加標(biāo)志著存在CRC。
特別優(yōu)選在結(jié)直腸癌的早期診斷中使用新標(biāo)記物PSE3。
蛋白PSE3本身的使用代表著挑戰(zhàn)CRC診斷領(lǐng)域的顯著進(jìn)步。聯(lián)合檢測(cè)PSE3和其它已知標(biāo)記物如CEA或迄今已發(fā)現(xiàn)的其它CRC標(biāo)記物，獲得了進(jìn)一步的改進(jìn)。因此，在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在由得自個(gè)體的液體樣品診斷結(jié)直腸癌時(shí)聯(lián)合使用為結(jié)直腸癌標(biāo)記分子的PSE3和一種或多種結(jié)直腸癌標(biāo)記分子。在這點(diǎn)上，表述“一種或多種”代表1-10種，優(yōu)選1-5種，更優(yōu)選3種。可與PSE3檢測(cè)組合的其它CRC標(biāo)記物優(yōu)選為CEA、CA 19-9、CA 72-4和/或CA 242。因此，本發(fā)明非常優(yōu)選的實(shí)施方案是在由得自個(gè)體的液體樣品診斷結(jié)直腸癌時(shí)使用為結(jié)直腸癌標(biāo)記分子的蛋白PSE3連同一種或多種結(jié)直腸癌標(biāo)記分子，其中至少一種其它標(biāo)記分子選自CEA、CA 19-9、CA 72-4和CA 242。非常優(yōu)選標(biāo)記物PSE3和CEA聯(lián)用。
在特異性結(jié)合實(shí)驗(yàn)如免疫實(shí)驗(yàn)領(lǐng)域中的診斷試劑，通常最好以試劑盒的形式提供，其含有特異性結(jié)合物和進(jìn)行實(shí)驗(yàn)需要的輔助試劑。本發(fā)明因此還涉及免疫學(xué)試劑盒，其含有至少一種PSE3特異性結(jié)合物和用于檢測(cè)PSE3的輔助試劑。
檢查的受試者操作特征曲線(xiàn)(ROC)最好地描述了檢查的準(zhǔn)確度(特別參見(jiàn)Zweig，M.H.，and Campbell，G.，Clin.Chem.39(1993)561-577)。ROC圖是全部敏感性/特異性對(duì)的曲線(xiàn)，其由觀測(cè)數(shù)據(jù)完整范圍內(nèi)不斷變化的判斷閾值產(chǎn)生。
實(shí)驗(yàn)室檢查的臨床效能取決于其診斷準(zhǔn)確度或正確將患者分類(lèi)成臨床相關(guān)亞組的能力。診斷準(zhǔn)確度衡量檢查正確分辨所研究患者的兩種不同狀況的能力。這樣的狀況例如為健康和疾病或良性對(duì)惡性疾病。
在每種情況下，通過(guò)在完整判斷閾值范圍內(nèi)畫(huà)出敏感性對(duì)1-特異性的曲線(xiàn)，ROC圖都描繪出了兩種分布之間的重疊。在y軸上為敏感性或真陽(yáng)性率[定義為(真陽(yáng)性檢查結(jié)果數(shù))/(真陽(yáng)性檢查結(jié)果數(shù)+假陰性檢查結(jié)果數(shù))]。這也稱(chēng)為在疾病或病癥存在下的陽(yáng)性。其僅僅是由受感染亞組計(jì)算出來(lái)。在x軸上為假陽(yáng)性率，或1-特異性[定義為(假陽(yáng)性結(jié)果數(shù))/(真陰性結(jié)果數(shù)+假陽(yáng)性結(jié)果數(shù))]。其是特異性的指標(biāo)，完全由未感染亞組計(jì)算出來(lái)。因?yàn)檎骊?yáng)性和假陽(yáng)性率完全獨(dú)立地通過(guò)使用兩個(gè)不同小組的檢查結(jié)果計(jì)算出來(lái)，所以ROC曲線(xiàn)與樣品中疾病的發(fā)病率無(wú)關(guān)。ROC曲線(xiàn)上的每個(gè)點(diǎn)都代表對(duì)應(yīng)于特定判斷閾值的敏感性/-特異性對(duì)。具有理想辨別力的檢查(兩種分布結(jié)果之間無(wú)重疊)的ROC曲線(xiàn)經(jīng)過(guò)左上角，其真陽(yáng)性率為1.0，即100％(理想的敏感性)，而假陽(yáng)性率為0(理想的特異性)。無(wú)辨別力的檢查(兩組的分布結(jié)果一致)的理論曲線(xiàn)為從左下角至右上角的45°對(duì)角線(xiàn)。大多數(shù)曲線(xiàn)處于這兩個(gè)極端之間。(如果ROC曲線(xiàn)完全處于45°對(duì)角線(xiàn)以下，則其很容易通過(guò)將“陽(yáng)性”標(biāo)準(zhǔn)由“大于”轉(zhuǎn)變?yōu)椤靶∮凇倍C正，反之亦然)。定性地看，曲線(xiàn)越接近于左上角，檢查的整體準(zhǔn)確度越高。
定量實(shí)驗(yàn)室檢查的診斷準(zhǔn)確度的一個(gè)便利目標(biāo)是以單個(gè)數(shù)字表示其效力。最常見(jiàn)的整體檢測(cè)是ROC曲線(xiàn)下面積。根據(jù)慣例，該面積經(jīng)?！?.5(如果不是，可倒轉(zhuǎn)決策規(guī)則使其是)。值位于1.0(兩組的檢查值完全分開(kāi))和0.5(兩組檢查值之間沒(méi)有顯著的分布差異)之間。面積不僅僅取決于曲線(xiàn)的特定部分，例如最接近對(duì)角線(xiàn)的點(diǎn)或90％特異性的敏感性，而是取決于整條曲線(xiàn)。這是ROC曲線(xiàn)如何接近理想曲線(xiàn)(面積＝1.0)的定量描述性表達(dá)。
使用受試者操作特征曲線(xiàn)分析(ROC；Zweig，M.H.，and Campbell，G.，Clin.Chem.39(1993)561-577)，評(píng)價(jià)新標(biāo)記物PSE3與已確立的標(biāo)記物CEA相比或組合的臨床效用。該分析基于意義明確的患者群，其由50個(gè)各自分別得自T1-3、N0、M0期患者、更惡化的腫瘤即T4和/或各種嚴(yán)重程度的轉(zhuǎn)移(N+和/或M+)以及健康對(duì)照的樣品組成。
提供以下的實(shí)施例、參考文獻(xiàn)、序列表和圖是為了幫助理解本發(fā)明，其真正范圍在所附權(quán)利要求書(shū)中提出。要理解地是，可對(duì)所提出的方法進(jìn)行修改，而不偏離本發(fā)明的精神。


圖1結(jié)腸腫瘤組織中PSE3的鑒別，其表觀分子量約為30kDa，等電點(diǎn)約為pH 5.5(較高處)。圖1顯示了用腫瘤樣品上樣的2D-凝膠(左側(cè))和用得自鄰近健康粘膜的相配對(duì)照樣品上樣的凝膠(右側(cè))的典型實(shí)例。這些凝膠的放大部分中的圖表示蛋白PSE3的位置。該蛋白用相同方法在健康粘膜中無(wú)法檢測(cè)到。標(biāo)示的蛋白斑在對(duì)照和腫瘤組織中以相同的程度明顯存在。這是由于以下事實(shí)經(jīng)常在和腫瘤組織中的ANX4(膜聯(lián)蛋白4)相同的蛋白斑處鑒別出PSE3。PSE3(剪接變體2)(31kDa/5.79)和ANX4(35kDa/5.85)的MW和PI非常相似，這解釋了這種表觀上的共遷移。PSE3從未在該蛋白斑中被鑒別出來(lái)，也沒(méi)有在對(duì)照凝膠中的任何其它蛋白斑中被鑒別出來(lái)，但PSE3專(zhuān)門(mén)在腫瘤組織中表達(dá)。
圖2蛋白質(zhì)印跡的典型實(shí)例。用4名患者(患者34結(jié)腸癌，DukesB；患者36直腸癌，Dukes B；患者37直腸癌，Dukes A；和患者39結(jié)腸癌，Dukes A)的結(jié)直腸腫瘤組織和鄰近健康對(duì)照組織的組織裂解物上樣聚丙烯酰胺凝膠，在電泳后將蛋白印跡在硝酸纖維素膜上。使用多克隆兔抗PSE3血清測(cè)試樣品中PSE3的存在情況。含腫瘤裂解物的泳道用“T”表示，含正常對(duì)照組織的泳道用“N”表示。箭頭表示凝膠中PSE3條帶的位置。所有的腫瘤樣品都在PSE3位置產(chǎn)生強(qiáng)烈信號(hào)，而在鄰近正常對(duì)照組織的裂解物中僅可檢測(cè)到微弱信號(hào)。
簡(jiǎn)寫(xiě)ABTS 2，2′-連氮基-雙-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸(6)]二銨鹽BSA 牛血清白蛋白cDNA 互補(bǔ)DNACHAPS(3-[(3-膽酰氨基丙基)-二甲銨]-1-丙磺酸鹽)DMSO 二甲基亞砜
DTT 二硫蘇糖醇EDTA 乙二胺四乙酸ELISA酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)HRP 辣根過(guò)氧化物酶IAA 碘乙酰胺IgG 免疫球蛋白GIEF 等電聚焦IPG 固定化pH梯度LDS 十二烷基硫酸鋰MALDI-TOF基體輔助激光解吸/電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜MES 三甲苯基，2，4，6-三甲苯基OD 光密度PAGE 聚丙烯酰胺凝膠電泳PBS 磷酸緩沖鹽水PI 等電點(diǎn)RTS 快速表達(dá)系統(tǒng)SDS 十二烷基硫酸鈉實(shí)施例1鑒別PSE3為潛在的結(jié)直腸癌標(biāo)記物組織來(lái)源為鑒別作為潛在結(jié)直腸癌診斷標(biāo)記物的腫瘤特異性蛋白，使用蛋白酶體方法對(duì)三種不同組織進(jìn)行分析。
總而言之，分析10名患結(jié)直腸癌的患者的組織標(biāo)本。對(duì)于每名患者，由治療性切除物收集三種不同的組織類(lèi)型腫瘤組織(＞80％腫瘤)(T)、鄰近健康組織(N)和鄰近健康粘膜的剝離粘膜(M)。后兩種組織類(lèi)型用作相配的健康對(duì)照樣品。在切除后立即將組織速凍，并在處理前儲(chǔ)存于-80℃。用組織病理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)診斷腫瘤。
組織制備將0.8-1.2g冷凍組織放入臼中，并利用液氮完全冷凍。將組織在臼中研磨成粉，并溶解在10倍體積(w/v)的裂解緩沖液(40mM檸檬酸鈉、5mM MgCl2、1％ Genapol X-080、0.02％疊氮化鈉、無(wú)EDTA的Complete[Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany，目錄號(hào)1873580])中，隨后在Wheaton玻璃均質(zhì)機(jī)(20x松配合(fitting)，20x緊配合)中勻漿。以4500xg對(duì)3ml勻漿液進(jìn)行1小時(shí)的蔗糖密度離心(10-60％蔗糖)。在此離心步驟后，獲得三種組分。梯度頂層級(jí)分含可溶性蛋白，將其用于進(jìn)一步的分析。
等電聚焦(IEF)和SDS-PAGE對(duì)于IEF，將3ml懸浮液與12ml樣品緩沖液(7M尿素、2M硫脲、2％ CHAPS、0.4％ IPG緩沖液pH 4-7、0.5％ DTT)混合，并溫育1小時(shí)。將樣品在AmiconUltra-15裝置(Millipore GmbH，Schwalbach，Germany)中濃縮，使用Bio-Rad蛋白實(shí)驗(yàn)(目錄號(hào)500-0006；Bio-Rad Laboratories GmbH，München，Germany)按照供應(yīng)商的說(shuō)明測(cè)定蛋白濃度。向相當(dāng)于1.5mg蛋白樣品的體積中加入緩沖液，至終體積為350μl。該溶液用于過(guò)夜再水合IPG條帶pH 4-7(Amersham Biosciences，F(xiàn)reiburg，Germany)。使用以下的梯度方案進(jìn)行IEF1.)1分鐘達(dá)到500V；2.)2小時(shí)達(dá)到3,500V；3.)3,500V穩(wěn)定22小時(shí)，產(chǎn)生82kVh。在IEF后，將條帶儲(chǔ)存于-80℃，或直接用于SDS-PAGE。
在SDS-PAGE前，將條帶在平衡緩沖液(6M尿素、50mMTris/HCl、pH 8.8、30％甘油、2％ SDS)中溫育，對(duì)于還原，加入DDT(15分鐘，+50mg DTT/10ml)，對(duì)于烷基化，加入IAA(15分鐘，+235mg碘乙酰胺/10ml)。將條帶放在12.5％聚丙烯酰胺凝膠上，并以1W/凝膠電泳1小時(shí)，然后以17W/凝膠電泳。隨后，固定(50％甲醇、10％乙酸鹽)凝膠，并用NovexTM膠體藍(lán)染色試劑盒(Invitrogen，Karlsruhe，Germany，目錄號(hào)LC6025，45-7101)染色過(guò)夜。
檢測(cè)為結(jié)直腸癌潛在標(biāo)記物的PSE3通過(guò)用ProteomeWeavers軟件(Definiens AG，Germany，Munchen)進(jìn)行影像分析，獨(dú)立地分析每名患者。另外，凝膠的所有蛋白斑都通過(guò)挑選機(jī)器人切除，蛋白斑中存在的蛋白通過(guò)MALDI-TOF質(zhì)譜鑒別(UltraflexTMToF/ToF，Bruker Daltonik GmbH，Bremen，Germany)。對(duì)于每名患者，將腫瘤樣品的4個(gè)凝膠與鄰近正常和剝離粘膜組織的各自4個(gè)凝膠進(jìn)行對(duì)比，并分析對(duì)應(yīng)于差異表達(dá)蛋白的不同蛋白斑。利用這種方法，發(fā)現(xiàn)蛋白PSE3在腫瘤組織中特異性表達(dá)或強(qiáng)烈過(guò)表達(dá)，而在健康對(duì)照組織中未檢測(cè)到或不太強(qiáng)烈地表達(dá)。因此，其和許多其它蛋白一道，有資格成為用于結(jié)直腸癌診斷的候選標(biāo)記物。
實(shí)施例2生產(chǎn)結(jié)直腸癌標(biāo)記蛋白PSE3的抗體生產(chǎn)結(jié)直腸癌標(biāo)記蛋白PSE3的多克隆抗體，通過(guò)免疫檢測(cè)實(shí)驗(yàn)如蛋白質(zhì)印跡或ELSIA，進(jìn)一步使用這些抗體檢測(cè)血清、血漿和血液的PSE3水平。
在大腸桿菌中表達(dá)的重組蛋白為了生產(chǎn)抗PSE3抗體，進(jìn)行蛋白重組表達(dá)，以獲得免疫原。使用RTS 100表達(dá)系統(tǒng)和大腸桿菌的組合進(jìn)行表達(dá)。在第一步中，分析DNA序列，使用“ProteoExpert RTS E.coli HY”系統(tǒng)獲得推薦的高產(chǎn)量cDNA沉默突變體和各自的PCR引物序列。這是一個(gè)基于商業(yè)站點(diǎn)的服務(wù)(www.proteoexpert.com)。使用推薦的引物對(duì)，使用“RTS100大腸桿菌線(xiàn)性模板生產(chǎn)裝置，His-tag”(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany，目錄號(hào)3186237)系統(tǒng)，由cDNA生產(chǎn)線(xiàn)性PCR模板，用于PSE3蛋白編碼核苷酸序列的體外翻譯和表達(dá)。為了蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)和隨后的純化，表達(dá)的蛋白含His-tag。鑒別出最佳表達(dá)的變體。由PCR至表達(dá)和檢測(cè)的所有步驟都按照生產(chǎn)商的說(shuō)明進(jìn)行。各自的PCR產(chǎn)物含所有必需的T7調(diào)節(jié)區(qū)(啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和T7終止子)，按照生產(chǎn)商的說(shuō)明將其克隆入pBAD TOPO載體(Invitrogen，Karlsruhe，Germany，目錄號(hào)K 4300/01)中。為使用T7調(diào)節(jié)序列進(jìn)行表達(dá)，將構(gòu)建物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL 21(DE 3)(Studier，F(xiàn).W.，et al.，Methods Enzymol.185(1990)60-89)中，轉(zhuǎn)化的細(xì)菌以1L批次培養(yǎng)，用于蛋白表達(dá)。
按照標(biāo)準(zhǔn)方法在Ni-螯合柱上進(jìn)行His-PSE3融合蛋白純化。簡(jiǎn)而言之，通過(guò)離心沉淀1L含His-PSE3融合蛋白表達(dá)載體的細(xì)菌培養(yǎng)物。將細(xì)胞沉淀重懸浮在裂解緩沖液中，該裂解緩沖液含磷酸鹽pH8.0、7M鹽酸胍、咪唑和硫代甘油，接著使用Ultra-Turraxe勻漿。通過(guò)高速離心沉淀不溶性物質(zhì)，將上清液上Ni-螯合層析柱。用幾個(gè)柱床體積的裂解緩沖液沖洗柱，接著用含磷酸鹽pH 8.0和尿素的緩沖液沖洗。最后，使用含SDS的磷酸鹽緩沖液在酸性條件下洗脫結(jié)合的抗原。
生產(chǎn)抗PSE3的單克隆抗體a)免疫小鼠首先用100μg PSE3腹膜內(nèi)免疫12周齡的A/J小鼠。在6周后接著再進(jìn)行兩次間隔1個(gè)月的腹膜內(nèi)免疫。在此過(guò)程中，每只小鼠都給予100μg吸附至氫氧化鋁的PSE3和109g百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)。隨后，每次使用100μg PSE3的PBS緩沖液在融合前第3天和第2天靜脈內(nèi)進(jìn)行最后兩次免疫接種。
b)融合和克隆按照Galfre，G.，and Milstein，C.，Methods in Enzymology 73(1981)3-46所述，將按照a)免疫的小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合。在該過(guò)程中，將免疫小鼠的約1×108脾細(xì)胞與2×107骨髓瘤細(xì)胞(P3X63-Ag8-653，ATCC CRL1580)混合并離心(300xg，10分鐘，4℃)。然后用無(wú)胎牛血清(FCS)的RPMI 1640培養(yǎng)基漂洗細(xì)胞1次，并在50ml圓錐管中以400xg再離心。廢棄上清液，通過(guò)輕敲溫和地使細(xì)胞沉淀松散，加入1ml PEG(分子量4000，Merck，Darmstadt)，通過(guò)移液操作混合。在37℃水浴中1分鐘后，于室溫在4-5分鐘內(nèi)滴加5ml無(wú)FCS的RPMI 1640。此后，在約1分鐘內(nèi)滴加入5ml含10％ FCS的RPMI 1640，徹底混合，用培養(yǎng)基(RPMI 1640+10％ FCS)補(bǔ)充至50ml，隨后以400xg于4℃離心10分鐘。將沉淀的細(xì)胞由含10％ FCS的RPMI 1640中取出，并接種在次黃嘌呤-重氮絲氨酸選擇培養(yǎng)基(100mmol/l次黃嘌呤、1μg/ml重氮絲氨酸的RPMI 1640+10％ FCS溶液)中。向培養(yǎng)基中加入100U/ml的白介素6作為生長(zhǎng)因子。
大約10天后，測(cè)試初級(jí)培養(yǎng)物的特異性抗體。利用熒光活化細(xì)胞分揀儀在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中克隆PSE3陽(yáng)性初級(jí)培養(yǎng)物。在該過(guò)程中，再加入100U/ml的白介素6作為生長(zhǎng)因子。
c)由細(xì)胞培養(yǎng)物上清液分離免疫球蛋白將獲得的雜交瘤細(xì)胞以1×105細(xì)胞/ml密度接種在含10％ FCS的RPMI 1640中，并在發(fā)酵罐(Thermodux Co.，Wertheim/Main，型號(hào)MCS-104XL，序號(hào)144-050)中增殖7天。在培養(yǎng)物上清液中獲得平均濃度為100μg/ml的單克隆抗體。通過(guò)蛋白質(zhì)化學(xué)的常規(guī)方法(例如Bruck，C.，et al.，Methods in Enzymology 121(1986)587-695描述的方法)由培養(yǎng)物上清液進(jìn)行此抗體的純化。
生產(chǎn)多克隆抗體a)免疫接種為進(jìn)行免疫接種，以1∶1比率制備蛋白溶液(100μg/ml蛋白PSE3)和完全弗氏佐劑的新鮮乳濁液。每只兔在第1、7、14和第30、60和90天用1ml乳濁液免疫接種。取血，獲得的抗PSE3血清進(jìn)一步用于實(shí)施例3和4描述的實(shí)驗(yàn)。
b)用辛酸和硫酸銨通過(guò)連續(xù)沉淀由兔血清純化IgG(免疫球蛋白G)用4體積的乙酸鹽緩沖液(60mM，pH 4.0)稀釋1體積的兔血清。用2M Tris-堿將pH調(diào)節(jié)至4.5。在劇烈攪拌下滴加辛酸(25μl/ml的稀釋樣品)。30分鐘后，離心樣品(13,000xg，30分鐘，4℃)，廢棄沉淀，收集上清液。通過(guò)加入2M Tris-堿將上清液pH調(diào)節(jié)至7.5，并過(guò)濾(0.2μm)。
在劇烈攪拌下，通過(guò)滴加4M硫酸銨溶液至終濃度為2M，沉淀上清液中的免疫球蛋白。通過(guò)離心(8,000xg，15分鐘，4℃)收集沉淀的免疫球蛋白。
廢棄上清液。將沉淀溶解在10mM NaH2PO4/NaOH，pH 7.5、30mM NaCl中，并徹底透析。透析液進(jìn)行離心(13,000xg，15分鐘，4℃)并過(guò)濾(0.2μm)。
生物素化多克隆兔IgG用10mM NaH2PO4/NaOH，pH 7.5、30mM NaCl使多克隆兔IgG達(dá)到10mg/ml。每ml IgG溶液加入50μl生物素-N-羥基琥珀酰亞胺(3.6mg/ml的DMSO溶液)。于室溫30分鐘后，在Superdex 200(10mMNaH2PO4/NaOH，pH 7.5、30mM NaCl)上層析樣品。收集含生物素化IgG的級(jí)分。按照相同的方法生物素化單克隆抗體。
地高辛配基化多克隆兔IgG用10mM NaH2PO4/NaOH、30mM NaCl，pH 7.5使多克隆兔IgG達(dá)到10mg/ml。每ml IgG溶液加入50μl地高辛配基-3-O-甲基羰基-ε-氨基辛酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany，目錄號(hào)1 333 054)(3.8mg/ml的DMSO溶液)。于室溫30分鐘后，在Superdex200(10mM NaH2PO4/NaOH，pH 7.5、30mMNaCl)上層析樣品。收集含地高辛配基化IgG的級(jí)分。按照相同的方法用地高辛配基標(biāo)記單克隆抗體。
實(shí)施例3使用實(shí)施例2生產(chǎn)的多克隆抗體以蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)人結(jié)直腸癌組織中的PSE3如實(shí)施例1“組織制備”所述制備腫瘤樣品和健康對(duì)照樣品的組織裂解物。
使用Invitrogen，Karlsruhe，Germany的試劑和設(shè)備進(jìn)行SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡。對(duì)于測(cè)試的每種組織樣品，將10μg組織裂解物稀釋在還原性NuPAGE(Invitrogen)SDS樣品緩沖液中，并于95℃加熱10分鐘。樣品在MES電泳緩沖體系中在4-12％ NuPAGE凝膠(Tris-甘氨酸)上電泳。使用Invitrogen XCell IITMBlot Module(Invitrogen)和NuPAGE轉(zhuǎn)移緩沖體系將凝膠分離的蛋白混合物印跡到硝酸纖維素膜上。用PBS/0.05％ Tween-20漂洗膜3次，并用Roti-Block封閉緩沖液(A151.1；Carl Roth GmbH，Karlsruhe，Germany)封閉2小時(shí)。初級(jí)抗體多克隆兔抗PSE3血清(如實(shí)施例2所述產(chǎn)生)用Roti-Block封閉緩沖液以1∶10,000稀釋?zhuān)⑴c膜溫育1小時(shí)。用PBS/0.05％ Tween-20漂洗膜6次。用POD-綴合的多克隆綿羊抗兔IgG抗體標(biāo)記特異性結(jié)合的初級(jí)兔抗體，用0.5xRoti-Block封閉緩沖液稀釋至10mU/ml。溫育1小時(shí)后，用PBS/0.05％ Tween-20漂洗膜6次。為檢測(cè)結(jié)合的POD-綴合的抗兔抗體，將膜與Lumi-LightLUS蛋白質(zhì)印跡底物(序號(hào)2015196，Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)溫育，并對(duì)放射自顯影膠片曝光。
典型實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖2。發(fā)現(xiàn)在檢查的16名結(jié)直腸癌患者中，有15名患者其PSE3在腫瘤組織中相比于鄰近對(duì)照組織強(qiáng)烈過(guò)表達(dá)。
實(shí)施例4ELISA用于檢測(cè)人血清和血漿樣品中的PSE3為檢測(cè)人血清或血漿中的PSE3，開(kāi)發(fā)了夾心ELISA。為捕獲和檢測(cè)抗原，將等份的抗PSE3多克隆抗體(參見(jiàn)實(shí)施例2)分別與生物素和地高辛配基綴合。
在10mM磷酸鹽，pH 7.4、1％ BSA、0.9％ NaCl和0.1％ Tween-20中，將鏈霉抗生物素蛋白包被的96孔微量滴定板與100μl的10μg/ml生物素化抗PSE3多克隆抗體溫育60分鐘。溫育后，用0.9％NaCl、0.1％ Tween-20漂洗板3次。然后將孔與連續(xù)稀釋的作為標(biāo)準(zhǔn)抗原的重組蛋白(參見(jiàn)實(shí)施例2)或稀釋的患者血漿樣品溫育2小時(shí)。在結(jié)合PSE3后，用0.9％ NaCl、0.1％ Tween-20漂洗板3次。為特異性檢測(cè)結(jié)合的PSE3，在10mM磷酸鹽，pH 7.4、1％ BSA、0.9％ NaCl和0.1％ Tween-20中將孔與100μl的10μg/ml地高辛配基化抗PSE3多克隆抗體溫育60分鐘。此后，漂洗板3次，以去除未結(jié)合的抗體。在下一步中，在10mM磷酸鹽，pH 7.4、1％ BSA、0.9％ NaCl和0.1％Tween-20中將孔與20mU/ml抗地高辛配基-POD綴合物(RocheDiagnostics GmbH，Mannheim，Germany，目錄號(hào)1633716)溫育60分鐘。隨后用相同的緩沖液漂洗板3次。為檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合物，將孔與100μl ABTS溶液(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany，目錄號(hào)11685767)溫育，在30-60分鐘后用ELISA讀數(shù)器于405nm檢測(cè)OD。
實(shí)施例5根據(jù)診斷準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)臨床效用的ROC分析通過(guò)分析得自特征明確的患者群的個(gè)體液體樣品，評(píng)價(jià)準(zhǔn)確度，所述特征明確的患者群即分別為50名進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查并發(fā)現(xiàn)無(wú)腺瘤或CRC的患者、50名確診并分期為T(mén)1-3、N0、M0的CRC患者和50名確診為進(jìn)行性CRC的患者，進(jìn)行性CRC患者至少在至少一個(gè)鄰近淋巴結(jié)具有腫瘤侵潤(rùn)或具有更嚴(yán)重形式的轉(zhuǎn)移。用市售可得的實(shí)驗(yàn)(Roche Diagnostics，CEA實(shí)驗(yàn)(目錄號(hào)1 173 1629，用于ElecsysSystems免疫實(shí)驗(yàn)分析儀)檢測(cè)CEA，并如上所述檢測(cè)PSE3，由此定量得自這些個(gè)體每一個(gè)的血清中的CEA和PSE3。按照Z(yǔ)weig，M.H.，and Campbell(出處同上)所述進(jìn)行ROC分析。通過(guò)正則化判別分析(Friedman，J.H.，Regularized Discriminant Analysis，Journal of theAmerican Statistical Association 84(1989)165-175)計(jì)算PSE3和已確立標(biāo)記物CEA的組合區(qū)分T1s-3、N0、M0組患者和健康個(gè)體的判別力。
初步的數(shù)據(jù)表明，PSE3還可能對(duì)手術(shù)后患者的隨訪(fǎng)非常有幫助。
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序列表<110>霍夫曼-拉羅奇有限公司(F.Hoffmann-La Roche AG)<120>蛋白類(lèi)蛋白酶體激活劑亞基3(PSE3)作為結(jié)直腸癌標(biāo)記物的用途<130>21882<150>EP 03017582.2<151>2003-08-08<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>254<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>MISC_FEATURE<223>蛋白酶體活化蛋白亞基3，同工型<400>1Met Ala Ser Leu Leu Lys Val Asp Gln Glu Val Lys Leu Lys Val Asp1 5 10 15Ser Phe Arg Glu Arg Ile Thr Ser Glu Ala Glu Asp Leu Val Ala Asn20 25 30Phe Phe Pro Lys Lys Leu Leu Glu Leu Asp Ser Phe Leu Lys Glu Pro35 40 45Ile Leu Asn Ile His Asp Leu Thr Gln Ile His Ser Asp Met Asn Leu50 55 60Pro Val Pro Asp Pro Ile Leu Leu Thr Asn Ser His Asp Gly Leu Asp65 70 75 80
Gly Pro Thr Tyr Lys Lys Arg Arg Leu Asp Glu Cys Glu Glu Ala Phe85 90 95Gln Gly Thr Lys Val Phe Val Met Pro Asn Gly Met Leu Lys Ser Asn100 105 110Gln Gln Leu Val Asp Ile Ile Glu Lys Val Lys Pro Glu Ile Arg Leu115 120 125Leu Ile Glu Lys Cys Asn Thr Val Lys Met Trp Val Gln Leu Leu Ile130 135 140Pro Arg Ile Glu Asp Gly Asn Asn Phe Gly Val Ser Ile Gln Glu Glu145 150 155 160Thr Val Ala Glu Leu Arg Thr Val Glu Ser Glu Ala Ala Ser Tyr Leu165 170 175Asp Gln Ile Ser Arg Tyr Tyr Ile Thr Arg Ala Lys Leu Val Ser Lys180 185 190Ile Ala Lys Tyr Pro His Val Glu Asp Tyr Arg Arg Thr Val Thr Glu195 200 205Ile Asp Glu Lys Glu Tyr Ile Ser Leu Arg Leu Ile Ile Ser Glu Leu210 215 220Arg Asn Gln Tyr Val Thr Leu His Asp Met Ile Leu Lys Asn Ile Glu225 230 235 240Lys Ile Lys Arg Pro Arg Ser Ser Asn Ala Glu Thr Leu Tyr245 250<210>2<211>267<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>MISC_FEATURE<223>蛋白酶體活化蛋白亞基3，同工型<400>2Met Ala Ser Leu Leu Lys Val Asp Gln Glu Val Lys Leu Lys Val Asp1 5 10 15Ser Phe Arg Glu Arg Ile Thr Ser Glu Ala Glu Asp Leu Val Ala Asn20 25 30Phe Phe Pro Lys Lys Leu Leu Glu Leu Asp Ser Phe Leu Lys Glu Pro35 40 45Ile Leu Asn Ile His Asp Leu Thr Gln Ile His Ser Asp Met Asn Leu50 55 60Pro Val Pro Asp Pro Ile Leu Leu Thr Asn Ser His Asp Gly Leu Asp65 70 75 80Gly Pro Thr Tyr Lys Lys Arg Arg Leu Asp Glu Cys Glu Glu Ala Phe85 90 95Gln Gly Thr Lys Val Phe Val Met Pro Asn Gly Met Leu Lys Ser Asn100 105 110Gln Gln Leu Val Asp Ile Ile Glu Lys Val Lys Pro Glu Ile Arg Leu115 120 125Leu Ile Glu Lys Cys Asn Thr Pro Ser Gly Lys Gly Pro His Ile Cys130 135 140Phe Asp Leu Gln Val Lys Met Trp Val Gln Leu Leu Ile Pro Arg Ile145 150 155 160Glu Asp Gly Ash Ash Phe Gly Val Ser Ile Gln Glu Glu Thr Val Ala165 170 175
Glu Leu Arg Thr Val Glu Ser Glu Ala Ala Ser Tyr Leu Asp Gln Ile180 185 190Ser Arg Tyr Tyr Ile Thr Arg Ala Lys Leu Val Ser Lys Ile Ala Lys195 200 205Tyr Pro His Val Glu Asp Tyr Arg Arg Thr Val Thr Glu Ile Asp Glu210 215 220Lys Glu Tyr Ile Ser Leu Arg Leu Ile Ile Ser Glu Leu Arg Asn Gln225 230 235 240Tyr Val Thr Leu His Asp Met Ile Leu Lys Asn Ile Glu Lys Ile Lys245 250 255Arg Pro Arg Ser Ser Asn Ala Glu Thr Leu Tyr260 26權(quán)利要求
1.一種結(jié)直腸癌的診斷方法，所述方法包括以下步驟a)提供得自個(gè)體的液體樣品，b)在適于蛋白酶體激活蛋白亞基3(PSE3)特異性結(jié)合物和PSE3形成復(fù)合體的條件下，使所述樣品與所述結(jié)合物接觸，c)將(b)中形成的復(fù)合體的量與結(jié)直腸癌診斷相關(guān)聯(lián)。
2.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步的特征在于所述樣品是血清。
3.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步的特征在于所述樣品是血漿。
4.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步的特征在于所述樣品是全血。
5.蛋白PSE3的用途，所述蛋白在由得自個(gè)體的液體樣品進(jìn)行的結(jié)直腸癌診斷中用作標(biāo)記分子。
6.蛋白PSE3的用途，所述蛋白在由得自個(gè)體的液體樣品進(jìn)行的結(jié)直腸癌早期診斷中用作標(biāo)記分子。
7.權(quán)利要求6的用途，其中所述早期診斷用來(lái)源于腺瘤期CRC患者的樣品進(jìn)行。
8.權(quán)利要求6的用途，其中所述早期診斷用來(lái)源于T1S-3、N0、M0期CRC患者的樣品進(jìn)行。
9.蛋白PSE3的用途，所述蛋白作為結(jié)直腸癌標(biāo)記分子與另一種結(jié)直腸癌標(biāo)記分子聯(lián)用于由得自個(gè)體的液體樣品進(jìn)行的結(jié)直腸癌診斷。
10.一種免疫學(xué)試劑盒，所述試劑盒包含至少一種PSE3特異性結(jié)合物和用于檢測(cè)PSE3的輔助試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及結(jié)直腸癌診斷。本發(fā)明公開(kāi)了蛋白PSE3(蛋白酶體激活蛋白亞基3)在結(jié)直腸癌診斷中的用途。本發(fā)明涉及通過(guò)檢測(cè)來(lái)源于個(gè)體的液體樣品中的PSE3而由所述樣品診斷結(jié)直腸癌的方法。PSE3檢測(cè)例如可用于結(jié)直腸癌的早期檢測(cè)或診斷。
文檔編號(hào)G01N33/574GK1833170SQ200480022266
公開(kāi)日2006年9月13日 申請(qǐng)日期2004年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月8日
發(fā)明者M·塔克, P·伯恩德特, M·-L·哈格曼, J·卡爾, H·蘭根, S·帕爾梅, M·勒斯勒, W·羅林格爾, W·措爾格 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司